CN109368813B - 一种高效处理废水的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效处理废水的方法，具体地，所述方法包括在废水处理过程中，使用固定化微生物颗粒，所述固定化微生物颗粒中包含一种基因改造的微生物，所述废水为稠油高盐废水，更具体地，所述固定化微生物颗粒中包埋有基因改造的嗜热细菌，可以在高温中对污染废水进行降解，具有较强的硝氮、氨氮去除效果，本发明还提供一种用于处理稠油污水的前置设备，可以与任意水处理装置连接，可以解决的稠油污水分离难，需冷却的问题，还可以对油料进行回收，适用于多种污染场景。

Description

一种高效处理废水的方法

技术领域

本发明涉及污水处理领域，特别地涉及一种高效处理废水的方法。

背景技术

含油污泥是油田生产过程中产生的主要污染物之一，由于污泥的成分复杂，因此处理方法也很多。但是目前，国内外已有的多种处理含油污泥的方法，收效不大，仍需进一步研究，寻找经济合理的处理方法。目前油田大多处于二次和三次采油阶段，通常采用水驱、蒸汽驱及聚合物驱的方式来实现大规模生产，稠油油田生产中随稠油开采出大量废水，称为稠油污水。

稠油污水的油水密度差小，所含的胶质和沥青质具有天然乳化性质，采油废水成分复杂，除含有石油类外，还含有开采过程中投加的大量化学药剂、如破乳剂、降粘剂、驱油剂等难降解物质，添加的各类化学药剂除增加污水本身的COD外，又降低了污水的可生化性，且含有对微生物生长繁殖有抑制或毒害作用的有机成分，生化处理运行过程中存在因生物菌种的死亡或变异而导致污水处理效果逐渐下降的问题，采用合适有效的工艺方法使之达到排放标准，是稠油污水处理过程的难点和关键。

专利CN103601340A公开了一种稠油污水处理方法，其是将稠油污水原水依次经过常温常压催化氧化处理、厌氧生化处理、接触氧化处理以及臭氧活性炭曝气生物滤池处理工艺，但稠油污水的温度通常为80～90℃，如采用常温常压催化处理，需要先进行冷却处理，提高了工艺过程的成本，常见高温稠油中含盐离子较多，温度升高后，容易结垢，所以降盐也是处理过程中的重要环节之一。

本发明提供一种高效处理废水的方法，特别地涉及一种处理高温稠油高盐污水的方法，所述方法可省略冷却处理步骤，直接处理高温稠油污水，具有较强的盐离子、硝氮、氨氮去除效果，适用于多种污染场景。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高效处理废水的方法。

一种高效处理废水的方法，包括在废水处理过程中，使用固定化微生物颗粒，所述固定化微生物颗粒中包含一种基因改造的微生物，所述废水为稠油高盐废水。

所述基因改造的微生物为转基因嗜热脂肪芽孢杆菌，生产转基因嗜热脂肪芽孢杆菌的方法为：挖掘嗜盐芽孢杆菌的耐盐相关基因，提取其基因组DNA进行全基因组测序，利用大肠杆菌表达系统构建盐胁迫后嗜盐芽孢杆菌的cDNA文库，将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至不同盐浓度的LB培养基进行耐盐测试，于28℃培养一周，观察其生长情况，挑取生长旺盛的菌落进行纯培养，划线培养若干次直至获得单克隆，挑取10个长势旺盛的克隆进行测序，获得耐盐基因YRP1、YRP2、YRP3、YRP4、YRP5、YRP6、YRP7、YRP8、YRP9、YRP10，合成上述耐盐基因并分别转入嗜热脂肪芽孢杆菌感受态细胞中，将上述插入外源基因的嗜热脂肪芽孢杆菌分别接种至NaCl浓度为20％的LB液体培养基，于28℃培养5天，验证获得除盐效果最好的菌株为转入YRP2核苷酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌。

所述YRP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述固定化微生物颗粒的制备方法如下：将转基因嗜热脂肪芽孢杆菌固定进入石墨烯基复合材料以制备固定化微生物颗粒，具体地，将嗜热脂肪芽孢杆菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液得菌体；将菌体悬浮于液体LB培养基中，得嗜热脂肪芽孢杆菌悬液，摇床培养，摇床转速为120r/min，培养温度为55℃，培养时间为3天。培养3天后将菌体离心后，将沉淀放入0.9％生理盐水中洗脱三次，最后一次制成菌悬液，溶剂为生理盐水，向其中加入1wt％的炭粉吸附5h获得吸附液，将海藻酸钠、聚乙烯醇溶于双蒸水中，超声至完全溶解，加入以水为溶剂制备的氧化石墨烯溶液，继续超声使氧化石墨烯颗粒与海藻酸钠和聚乙烯醇相互沉积，在85℃水浴加热搅拌至完全溶解，静置冷却至35℃，得包埋剂，所述包埋剂中氧化石墨烯的含量为0.2％，聚乙烯醇的含量为5％，海藻酸钠的含量为7％，将所述吸附液与所述包埋剂混合均匀，得第一复合物，所述吸附液与包埋剂体积配比为1:8，第一复合物与交联剂体积配比为1:4，所述交联剂为3wt％CaCl2饱和硼酸溶液，将第一复合物逐滴滴入交联剂中形成第二复合物，5℃交联15h，生理盐水清洗，4℃保存，得固定化微生物颗粒。

本发明是以如下技术方案实现的：

本发明的有益效果在于：所述固定化微生物颗粒中包埋有基因改造的嗜热细菌，可以在高温中对污染废水进行降解，具有较强的硝氮、氨氮去除效果，本发明还提供一种用于处理稠油污水的前置设备，可以与任意水处理装置连接，可以解决的稠油污水分离难，需冷却的问题，还可以对油料进行回收，适用于多种污染场景。

附图说明

图1为本发明所述用于处理稠油污水的前置设备的示意图。

其中，1-进水口，2-温浴管，3-反应室，4-固定化微生物颗粒，5-冷却管，6-出水口，7-阀门，8-回收室，9-稠油出口。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：获得耐盐基因

嗜盐芽孢杆菌(Bacillus saliphilus)菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 1.15441。前期研究证明该菌具有较强的耐盐性，虽然其具有较强的除盐作用，但是其不易培养并且不具备耐高温、除碳、除硫、除氨氮等功能，不能直接应用于高盐稠油废水的处理中。

为了挖掘嗜盐芽孢杆菌的耐盐相关基因，探索其耐盐的分子机制，提取其基因组DNA进行全基因组测序，基因组测序委托南京金斯瑞公司通过SOLEXA测序平台完成，利用大肠杆菌表达系统(E.coli DH5a)构建盐胁迫后嗜盐芽孢杆菌的cDNA文库，具体方法为：分别利用超声随机打断基因组DNA至250bp、500kb、1.0kb、1.5kb的片段，将DNA片段与接头连接，之后250bp和500bp文库进行PCR扩增，上机测序，1.0kb和1.5kb大片段文库采用Cre-LoxRecombination建库技术构建，在DNA大片段两端连接LoxP接头后再进行环化、测序；按照基因组构建步骤分别构建插入片段为250bp，500bp，1.0kb，1.5kb的片段插入文库。

将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至不同盐浓度的LB培养基进行耐盐测试，盐胁迫浓度为5％-10％(NaCl浓度按1％递增)和10％-20％(NaCl浓度按2％递增)，于30℃培养一周，观察其生长情况，挑取生长旺盛的菌落进行纯培养，划线培养若干次直至获得单克隆(划线培养采用盐浓度为20％的LB培养基)，挑取10个长势旺盛的克隆进行测序，具体由上海生工完成测序，用通用引物F-T7和R-pYES2检测插入片段长度及具体序列，将所得到的序列去除载体后，获得耐盐基因YRP1、YRP2、YRP3、YRP4、YRP5、YRP6、YRP7、YRP8、YRP9、YRP10。

实施例2：将耐盐基因转入嗜热脂肪芽孢杆菌中

所述YRP1、YRP2、YRP3、YRP4、YRP5、YRP6、YRP7、YRP8、YRP9、YRP10的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的序列5’端还连接有NcoI酶切位点，3’端还连接有SwaI酶切位点。将合成的YRP1、YRP2、YRP3、YRP4、YRP5、YRP6、YRP7、YRP8、YRP9、YRP10核苷酸序列分别连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10，载体结构包括：Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6 RNA聚合酶启动子；T7为T7 RNA聚合酶启动子；YRPX为YRP1-10核苷酸序列；MCS为多克隆位点)。

制备嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的感受态细胞，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(保藏号ATCC7953)，制备过程如下：取过夜培养的嗜热脂肪芽孢杆菌，稀释20倍接种于生长培养基(每500mL含蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖2.5，磷酸氢二钾2.5，0.5mol/L山梨醇)中，55℃震荡培养至OD600＝0.1，收集菌体后进行10min冰浴，放入提前预冷的15℃离心机中，5500转速离心2分钟，弃上清，留沉淀；电转液冰浴后洗涤沉淀3次，用菌体体积1/20的电转液保存菌体备用。

然后将重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10分别用热激方法转化嗜热脂肪芽孢杆菌感受态细胞，其热激条件为：30μl嗜热脂肪芽孢杆菌感受态细胞、10μl质粒DNA(重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10)，65℃水浴35秒；55℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜，过夜温度55℃。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度55℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸钾、2M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。提取的质粒经NcoI和SwaI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10中分别对应的插入的所述YRP1、YRP2、YRP3、YRP4、YRP5、YRP6、YRP7、YRP8、YRP9、YRP10的核苷酸序列。

将上述插入外源基因的嗜热脂肪芽孢杆菌分别接种至NaCl浓度为20％的LB液体培养基，于55℃培养5天，观察其生长情况，并测定培养基中的盐含量，测定结果如表1所示：

表1液体培养基中随天数变动的NaCl浓度测定结果

结果表明，转入YRP2核苷酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌具有明显的除盐效果，在培养第5天测定OD600，转入YRP7核苷酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌长势旺盛，可以满足高盐稠油废水的处理条件，YRP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例3：

将嗜热脂肪芽孢杆菌固定进入石墨烯基复合材料以制备固定化微生物颗粒，具体地，将嗜热脂肪芽孢杆菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液得菌体；将菌体悬浮于液体LB培养基中，得嗜热脂肪芽孢杆菌悬液，摇床培养，摇床转速为120r/min，培养温度为55℃，培养时间为3天。培养3天后将菌体离心后，将沉淀放入0.9％生理盐水中洗脱三次，最后一次制成菌悬液，溶剂为生理盐水，向其中加入1wt％的炭粉吸附5h获得吸附液，将海藻酸钠、聚乙烯醇溶于双蒸水中，超声至完全溶解，加入以水为溶剂制备的氧化石墨烯溶液，继续超声使氧化石墨烯颗粒与海藻酸钠和聚乙烯醇相互沉积，在85℃水浴加热搅拌至完全溶解，静置冷却至35℃，得包埋剂，所述包埋剂中氧化石墨烯的含量为0.2％，聚乙烯醇的含量为5％，海藻酸钠的含量为7％，将所述吸附液与所述包埋剂混合均匀，得第一复合物，所述吸附液与包埋剂体积配比为1:8，第一复合物与交联剂体积配比为1:4，所述交联剂为3wt％CaCl₂饱和硼酸溶液，将第一复合物逐滴滴入交联剂中形成第二复合物，5℃交联15h，生理盐水清洗，4℃保存，得固定化微生物颗粒。

实施例4：

图1展示了本发明所述一种用于处理稠油污水的前置设备，所述前置设备包括稠油污水进水管1、温浴管2，所述温浴管2内固定流通65℃循环温浴液，所述温浴管套在进水管1外部，进水管1下方连接有反应室3，所述反应室3中填充有固定化微生物颗粒4，由于稠油污水温度高，反应室3可保持55-65度高温，稠油高盐污水在反应室3中通过与固定化微生物颗粒4反应破乳、净化，使得原油上浮，水下沉，反应室3下方连接有回收室8，所述回收室8包括左右各一腔室，左腔室为剩余稠油回收室，右腔室内设置有冷却管5，反应室与左腔室之间设置有阀门7，阀门7上设置有拦截网，用于拦截固定化微生物颗粒4，净化后的水相通过冷却管5运动至出水口6进入后续常规污水处理环节，稠油通过阀门7进入稠油回收室，稠油回收室7内设置有高温喷淋设备，所述高温喷淋设备可喷射高温液体使稠油溶解并从稠油出口9排出，得到的稠油可二次利用。

将上述设备与后续污水处理设备连接后进行小试，采用高盐稠油人工废水为进水，控制温度为55℃、pH为7.5，溶解氧为0.25mg/L～3.0mg/L的好氧交替条件下处理盐度为5％的稠油废水，接种7d后，氨氮去除率达到了97％以上，TN去除率达到了98％以上，固定化微生物颗粒体积小，相对有效生物量大，储存条件要求低，在实际应用时，现场定量可根据污水特性进行处理稠油污水的前置设备的叠加，便于操作，适用于多种污染场景。以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 宜兴市永洁环保设备有限公司

<120> 一种高效处理废水的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<223> YRP2

<400> 1

ccaccaacct gacatctatc cattttctgc acctgataca cgtttggcgc caactagagt 60

ctgtactcca aatgagaccc cggttgacgc ggacgtatcg ttcacgcaca taagtgaaaa 120

cgtcaaataa catggggccg catgatccta atgcgtcggt gagctactgt aaagcggtat 180

tattcaacta aatggagttg gcacacgtcg atgtgttctc cccccttcga gcgtatgcgt 240

ttagcggacc ttattgcttg agggggtcac tctactagac tgacgtgggc cacggtggga 300

attttaacga ggagggtaaa tcgctatcgc acatgccttc tcaccgacac atatcttcca 360

caaggttggt ggcttggaag gcataggtgc gcgaaaaaac gattctatcc ccgatacact 420

gcacggatgc gggcataatc aacgtcattg agttaaaaat actgcccaac gccgaacacc 480

actagttagg agtctttgtc tacattccac ct 512

Claims (2)

1.一种高效处理废水的方法，其特征在于，包括在废水处理过程中，使用固定化微生物颗粒，所述固定化微生物颗粒中包含一种基因改造的微生物，所述废水为稠油高盐废水；

所述基因改造的微生物为转基因嗜热脂肪芽孢杆菌，生产转基因嗜热脂肪芽孢杆菌的方法为：挖掘嗜盐芽孢杆菌的耐盐相关基因，提取其基因组 DNA进行全基因组测序，利用大肠杆菌表达系统构建盐胁迫后嗜盐芽孢杆菌的cDNA文库，将插入外源基因的大肠杆菌接种至不同盐浓度的LB培养基进行耐盐测试，于28℃培养一周，观察其生长情况，挑取生长旺盛的菌落进行纯培养，划线培养若干次直至获得单克隆，挑取10个长势旺盛的克隆进行测序，获得耐盐基因YRP1、YRP2、YRP3、YRP4、YRP5、YRP6、YRP7、YRP8、YRP9、YRP10，合成上述耐盐基因并分别转入嗜热脂肪芽孢杆菌感受态细胞中，将上述插入外源基因的嗜热脂肪芽孢杆菌分别接种至NaCl浓度为20%的LB液体培养基，于28℃培养5天，验证获得除盐效果最好的菌株为转入YRP2核苷酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌；

所述YRP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化微生物颗粒的制备方法如下：将转基因嗜热脂肪芽孢杆菌固定进入石墨烯基复合材料以制备固定化微生物颗粒，具体地，将嗜热脂肪芽孢杆菌接种至富集培养基，摇床培养，培养液离心去除上清液得菌体；将菌体悬浮于液体LB培养基中，得嗜热脂肪芽孢杆菌悬液，摇床培养，摇床转速为120 r/min，培养温度为55℃，培养时间为3天；

培养3天后将菌体离心后，将沉淀放入0.9%生理盐水中洗脱三次，最后一次制成菌悬液，溶剂为生理盐水，向其中加入1wt％的炭粉吸附5h获得吸附液，将海藻酸钠、聚乙烯醇溶于双蒸水中，超声至完全溶解，加入以水为溶剂制备的氧化石墨烯混合物，继续超声使氧化石墨烯颗粒与海藻酸钠和聚乙烯醇相互沉积，在85℃水浴加热搅拌至完全溶解，静置冷却至35℃，得包埋剂，所述包埋剂中氧化石墨烯的含量为0.2％，聚乙烯醇的含量为5％，海藻酸钠的含量为7％，将所述吸附液与所述包埋剂混合均匀，得第一复合物，所述吸附液与包埋剂体积配比为1:8，第一复合物与交联剂体积配比为1:4，所述交联剂为3wt％ CaCl2饱和硼酸溶液，将第一复合物逐滴滴入交联剂中形成第二复合物，5℃交联15h，生理盐水清洗，4℃保存，得固定化微生物颗粒。

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