CN104726479A - 大豆耐盐基因GmCBL3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆耐盐基因GmCBL3及其应用。大豆耐盐基因GmCBL3的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。本发明首先克隆大豆耐盐基因GmCBL3；利过Gateway系统将GmCBL3基因进行BP反应连接到pDONR221，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmCBL3连接到表达载体pK2GW7上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌，再转入拟南芥中，使转基因阳性植株处于外界盐胁迫的条件下生长。经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株和其他转拟南芥CBL1基因的转基因植株的抗盐性明显提高。

Description

大豆耐盐基因GmCBL3及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及大豆耐盐基因GmCBL3及其应用。

背景技术

我国是大豆的原产地和主要栽培国，土壤盐渍化是已成为限制大豆产业发展的主要障碍因子之一。通过常规育种方法术改良植物的抗旱耐盐性，耗时费力，困难大，已经很难培育出真正的抗性品种，分子生物学和反向遗传学为大豆育种提供了新思路、新途径和新契机，为实现提高大豆的耐盐性提供了可能。了解掌握大豆的耐盐性并进一步揭示其分子机制，对育成大豆耐盐新品种，扩大大豆的种植范围，减少盐渍土壤等因素对大豆栽培和产量的影响，稳定我国的大豆生产，保证中国粮食安全和社会稳定有着重要意义。同时，也是树立我国自有的大豆品牌，增强我国大豆在国际市场上的竞争力的重要前提和基础。

植物的耐盐性状是一个多基因控制的数量性状，而且很多抗耐盐相关的基因未被发现，这就决定了植物耐盐机制的复杂性。盐胁迫能诱导植物细胞Ca²⁺浓度的变化，而Ca²⁺信号是由受体蛋白接受并传导的，这类蛋白叫钙调磷酸酶B类蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)。CBL为植物抗逆基因调控网络中钙离子通道信号传导的主要调节基因，目前已在拟南芥中克隆到10个CBL基因，在其他物种中，如玉米、马铃薯和水稻中也有类似蛋白发现(GeneBank)。CBL1是CBL蛋白家族中的一员，拟南芥中的CBL1在植物K⁺信号传递通路中起着重要作用。CBL1和CBL9共同作用能够激活CIPK23(CBL-interacting protein kinases，CIPK)，后者通过磷酸化K⁺转运蛋白AKT1增加胞内的K⁺浓度，从而引起细胞的一系列钙离子通道信号的转导变化，使细胞对外界刺激做出应激反应，提高细胞对外界刺激的耐受性。但大豆中的CBL基因及其对植物耐盐性的研究鲜有报道。

本发明中的大豆基因GmCBL3属于大豆CBL家族中的一员，具有磷酸酶的功能，能够调节植物细胞膜内Ca²⁺信号的传导，通过磷酸化K⁺转运蛋白AKT1增加胞内的K⁺浓度，减少Na⁺的摄入，从而提高植物的耐盐性。本发明所报道的大豆基因GmCBL3非等同于其亚家族其他成员，具有一定的特异性，是植物盐胁迫下钙离子通道信号传导途径中的重要调节基因，它在拟南芥中的过表达能够明显提高植株的耐盐性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从耐盐、低温敏感型大豆种质371005(山东省沿海地区种质资源收集编号)中分离得到的耐盐基因—GmCBL3，将该基因转到模式植物拟南芥中证明其功能，得到耐盐性提高的转基因植株。

本发明所述的大豆耐盐基因GmCBL3，它的基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含上述的大豆耐盐基因GmCBL3的植物表达载体pK2GW7-GmCBL3。

本发明还提供了所述大豆耐盐基因GmCBL3在提高植物耐盐性方面的用途。

其中：所述植物是拟南芥；进一步的，所述拟南芥是Col-0野生型。

本发明首先在大豆371005植株中克隆到了大豆耐盐基因GmCBL3；利过Gateway系统将GmCBL3基因进行BP反应连接到pDONR221，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmCBL3连接到表达载体pK2GW7上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。将转化农杆菌菌株转入拟南芥中，再使转基因阳性植株处于外界盐胁迫的条件下生长，通过对照比较，观察转基因植株的生长情况，从而验证表达的GmCBL3的功能。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了大豆耐盐基因GmCBL3并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的提高耐盐性的能力。经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株和其他转拟南芥CBL1基因的转基因植株的抗盐/耐旱性有所提高，可广泛用于培育耐盐的植物品种。

附图说明

图1为CBL简并引物扩增电泳图。左侧箭头所示为目的条带，分子量约为400bp；-，阴性对照；M，marker；

图2为5＇RACE产物电泳图。左侧箭头所示为目的条带，分子量约为300bp；-，阴性对照；M，marker；

图3为载体pDONR221示意图；

图4为植物表达载体pK2GW7示意图；

图5为野生型、转GmCBL3和转AgCBL1基因的拟南芥转基因阳性植株在NaCl浓度为0.5％的1/2MS培养基上正常培养10天后的耐盐性功能验证图。

具体实施方式

实施例1、GmCBL3的克隆

耐盐大豆种质的采集：本发明的发明人于2009年10月在东营市利津县明集乡齐家村收集并筛选出一种耐盐、低温敏感型的大豆种质(土壤盐浓度(‰)：1.5，纬度/°：37.59，经度/°：118.22，海拔/m：10)。根据山东省编号以37开头，第1005份资源，故命名为371005(山东省沿海地区种质资源收集编号)；其相对盐害指数：18.00。

1.1大豆371005植株总RNA的提取：

(1)大豆371005材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末；

(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1mlTRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心10min去沉淀；

(3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心15min；

(4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10～20min；

(5)2-8℃12000r/min离心10min，弃上清；

(6)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，4℃不超过7500r/min离心5min，弃上清；

(7)室温放置晾干后，加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。

1.2利用Takara逆转录合成试剂盒完成第一链cDNA

(1)0.2ml Eppendorf管中，加入下列成分：

用DNaseI纯化的上述总RNA(0.1μg/μl)   2.0μl

Olige(dT)anchored primer(2μM)         2.0μl；

(2)0℃水浴变性10分钟，立即置于冰浴中；

(3)在10μl反应体系中加入下列成分：2.0μl 5×MMLV RT buffer；1.0μl 250μmol/L dNTPmix；0.25μl Rnasin；0.5μl(200u/μl)MMLV逆转录酶；2μl上述RNA变性液。42℃进行逆转录反应1hr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。

1.3PCR

以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。

(1)PCR引物由深圳华大基因科技有限公司合成

引物P0(上游引物)：5＇-AGCCTAGMGGTTTGCAACA-3＇(SEQ ID No.2)

引物P1(下游引物)：5＇-ATTCTTCCHTGHCAATCTT-3＇(SEQ ID No.3)

M＝A/C H＝T/A/C；

(2)PCR反应体系

(3)PCR反应程序

94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，36个循环；最后72℃延伸10min。CBL简并引物PCR扩增产物电泳如图1所示。

1.45＇-RACE

按照TaKaRa 5＇-Full RACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳5＇-RACE产物如图2所示。

1.5利用Takara公司凝胶回收试剂盒对目的片段回收

(1)用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1.5mlEppendorf管中；

(2)称重，加入3-4倍体积的DR-I Buffer，65℃加热10min融化胶块，每隔2min混匀一次保证胶块能充分融化；

(3)加入DR-I Buffer量的1/2体积的DR-ⅡBuffer，均匀混合；

(4)将Spin Cloumn安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液；

(5)将500μl Rinse A加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液；

(6)将700μl Rinse B加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液；

(7)重复步骤6，然后12000rpm再离心1min；

(8)将Spin Cloumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Cloumn膜的中央处加入预热到60℃的25μl的水或洗脱缓冲液，室温静置1min；

(9)12000rpm离心1min洗脱DNA；

(10)重复步骤9，2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检查回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1hr；

(11)然后4℃，12000rpm离心15min，用70％冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40μl无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。

1.6连接

用上述的回收目的片段与pMD18-T载体(购自TAKARA有限公司，下同)按摩尔比约1:1的比例进行连接，连接体系如下：

混匀并短暂离心，16℃连接过夜。得到重组质粒pMD18-GmCBL3，用于后面的反应。1.7CaCl₂法制备感受态细胞

(1)挑取DH5α单菌落接种于5ml LB液体培养基(购自TAKARA有限公司，下同)中，37℃振荡培养过夜；

(2)按1：100-1：50的比例，取1ml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD600为0.3-0.6；

(3)将菌液冰浴10min，4℃4000rpm离心10min，收集菌体；

(4)沉淀加10ml预冷的0.1M CaCl₂悬浮后，冰浴30min；

(5)4℃4000rpm离心10min。沉淀重悬浮于1ml预冷的0.1M CaCl₂，混匀并冰水浴中保存，备用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。

1.8热击法转化E.coli DH5α

(1)在无菌条件下吸取100μl感受态细胞，加入1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.6中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min；

(2)在42℃恒温水浴中热激90sec(准确记时)；

(3)冰浴3-5min；

(4)加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养45-60min；

(5)短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp(氨苄西林)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布；

(6)将平板于37℃正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。

1.9碱裂解法提取大肠杆菌质粒

溶液Ⅰ：葡萄糖       0.901g(50mM)

1M Tris·HCl(pH8.0)  2.5ml(25mM)

0.5M EDTA(pH8.0)     2.0ml(10mM)

定容至100ml，6.895×10⁴Pa高压蒸汽灭菌15min，4℃保存；

溶液Ⅱ：NaOH 0.2M

SDS     1％

溶液Ⅱ在质粒提取开始之前现配；

溶液Ⅲ：乙酸钾  29.44g

冰醋酸  11.5ml

少量水溶解乙酸钾后，加入冰醋酸，定容至100ml，剧烈摇晃，以彻底混匀，高压蒸汽灭菌20min；

TE buffer：1M Tris·Cl(pH7.4)   500μl(10mM)

0.5mM EDTA(pH8.0)               100μl(1mM)

定容至50ml。

(1)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固体LB平板中，37℃震荡培养12-16h；

(2)12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；

(3)加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；

(4)加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10min；

(5)加入150μl冰预冷的溶液Ⅲ，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；

(6)12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；

(7)弃尽上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；

(8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；

(9)12000rpm，离心3min；

(10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(11)弃上清后用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；

(12)室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA；

(13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)，充分振荡5-10min，12000rpm离心5min；

(14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，重复以上操作；

(15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

(16)弃上清用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40μl TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。

1.10DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送深圳华大基因有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示，全长687bp。

经过NCBI blast分析，上述cDNA序列与AgCBL1(gi 145340348)的核苷酸同源53.6％，与大豆钙调B类蛋白(calcineurin B-like protein 2，LOC100808191)的GmCBL2的核苷酸同源98.1％。命名大豆钙调B类蛋白GmCBL3。

实施例2、农杆菌介导大豆GmCBL3和拟南芥AgCBL1基因的拟南芥化转化

2.1过表达载体构建

(1)参考Gateway试剂盒说明书，利用引物SEQ ID No.4-5通过高保真DNA聚合酶的PCR反应给GmCBL3加上接头，扩增出带接头的目的基因全长片段：

P2(上游引物)：5'-AAAAAAGCAGGCTTCATGGTGCACTGTTTAGATGG-3'(SEQ IDNo.4)；

P3(下游引物)：5'-AGAAAGCTGGGTCGCCAACACCAGAGAAACTGA-3'；(SEQ IDNo.5)。

利用引物SEQ ID No.6-7通过高保真DNA聚合酶的PCR反应给AgCBL1加上接头，扩增出带接头的目的基因全长片段。

P4(上游引物)：5'-AAAAAAGCAGGCTTCATGGGCTGCTTCCACTCAAAGGCAG-3'(SEQ ID No.6)；

P5(下游引物)：5'-AGAAAGCTGGGTCTGTGGCAATCTCATCGACCTCCGAA-3'(SEQID No.7)。

(2)取25μl PCR产物，用TE Buffer(10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA)，1/2体积的30％PEG 8000/30mM MgCl₂溶液稀释4倍，终浓度为10％PEG和10mM MgCl₂，涡旋混匀，13000rpm离心15min；

(3)轻移上清，用TE重悬沉淀，使DNA终浓度为>10ng/μl；

(4)加入以下成分于1.5ml离心管中，并在室温下混合以进行BP反应：

attB-PCR产物(≥10ng/μl，总含量15-150ng)                      1-7μl

pDONR221vector(150ng/μl,图3)                          1μl

TE buffer,pH 8.0     to 8μl；

(5)取出BP ClonaseⅡ酶，在冰上放置2min后，涡旋振荡2s，重新放置冰上2min；

(6)重复(5)一次，在(4)的体系中加入2μl的BP ClonaseⅡ酶，轻轻混匀，微速离心数秒，使反应液聚集在离心管底，25℃反应1h或过夜，BP ClonaseⅡ酶重新放回-20℃或-80℃冰箱保存；

(7)将1μl蛋白酶K加入到反应体系中，轻轻混匀，37℃孵育10min以终止反应；

(8)取1μl反应液，进行大肠杆菌DH5α转化，并验证阳性；

(9)过夜培养呈阳性的大肠杆菌克隆，并提取其质粒；

(10)经过纯化的阳性克隆质粒(Entry clone)按以下体系加入1.5ml离心管中，并在室温下混合以进行LR反应：

Entry clone(50-150ng)               1-7μl

Destination vector(150ng/μl，图4)  1μl

TE buffer,pH 8.0                    to 8μl；

(11)取出LR ClonaseⅡ酶，在冰上放置2min后，涡旋振荡2s，重新放置冰上2min；

(12)重复(11)一次，在(10)的体系中加入2μl的LR ClonaseⅡ酶，轻轻混匀，微速离心数秒，使反应液聚集在离心管底，25℃反应1h或过夜，LR ClonaseⅡ酶重新放回-20℃或-80℃冰箱保存；

(13)在反应体系中加入1μl蛋白酶K终止反应，轻微混匀，37℃孵育10min；

(14)取1μl反应液，进行大肠杆菌转化，并验证阳性；

(15)培养阳性克隆，提取并纯化其质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。

2.2拟南芥花转化

(1)正常生长的开花拟南芥植株，长日照条件下在土壤生长。如果拟南芥已经开花，载体还没准备好，可去除顶花，4-6天后得到更多的花进行转化。

(2)将鉴定正确的农杆菌菌种转接到5-10ml含有适当抗生素的LB培养基中，28℃，250rpm，培养2天；

(3)将农杆菌转接到300ml含相应抗生素的LB培养基中，28℃培养到OD600＝1.5-2.0；

(4)4000g，15min室温集菌，用0.5％蔗糖溶液(现用现配)将细胞重悬到OD600＝0.6～0.8；

(5)加Sliwet L-77(表面活性剂，Sigma)，浓度0.02～0.05％(vol/vol)，混匀，可尽量将Sliwet L-77降低；

(6)转化时，将混好的细菌液放在适当的器皿中，将花浸入细菌液2-3秒。也可用吸管将细菌液滴到花上；

(7)将转化后的植株用黑色塑料袋避光保湿放置16-24小时；

(8)避光时间结束后，将植株在正常条件下生长。直到种子成熟；

(9)上述转化植株收的F1代种子先干燥1周，然后播在含适当抗生素的平板上；

(10)种子消毒：拟南芥种子在0.5％次氯酸钠溶液中浸泡15min，再用无菌水洗5次；

(11)4℃春化3天，幼苗在平板上生长10天，挑选叶片和根生长正常的苗子移栽到土中；

(12)将植株在正常条件下生长，直到种子成熟，获得F2代种子，进行功能验证试验。

实施例3、转GmCBL3和AgCBL1基因的拟南芥耐盐性验证

(1)提取植株的DNA样本，并利用下述引物通过Taq DNA聚合酶的PCR反应，验证并获得转GmCBL3基因阳性植株，

P6(上游引物)：5'-ATGGTGCACTGTTTAGATGGATTAA-3'(SEQ ID No.8)

P7(下游引物)：5'-TCAGCCAACACCAGAGAAACTGACA-3'(SEQ ID No.9)；

同样的利用下述引物通过Taq DNA聚合酶的PCR反应，验证并获得转AgCBL1基因阳性植株，

P8(上游引物)：5'-ATGGGCTGCTTCCACTCAAAGGCAG-3'(SEQ ID No.10)

P9(下游引物)：5'-TCATGTGGCAATCTCATCGACCTCC-3'(SEQ ID No.11)。

(2)把三种不同类型的拟南芥种子分别进行消毒处理，这三种种子为：拟南芥野生型(阴性对照)、过量表达拟南芥AgCBL1基因的拟南芥转基因植株(阳性对照)和过量表达大豆GmCBL3基因的拟南芥转基因植株；

(3)在NaCl浓度为0.5％的1/2MS培养基上，培养经过消毒处理的三种拟南芥种子；

(4)正常培养10天后，发现过量表达GmCBL3基因的拟南芥转基因植株能够较好的正常生长，过量表达拟南芥AgCBL1基因的拟南芥转基因植株次之，而拟南芥野生型植株不能正常生长。经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株和其他转拟南芥CBL1基因的转基因植株的抗盐性有所提高(如图5所示)。

Claims (5)

1.大豆耐盐基因GmCBL3，它的基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述的大豆耐盐基因GmCBL3的植物表达载体pK2GW7-GmCBL3。

3.权利要求1所述的大豆耐盐基因GmCBL3在提高植物耐盐性方面的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征是，所述植物是拟南芥。

5.一种提高植物耐盐性的方法，其特征是，首先克隆权利要求1所述的大豆耐盐基因GmCBL3；利过Gateway系统将GmCBL3基因进行BP反应连接到pDONR221，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmCBL3连接到表达载体pK2GW7上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌，再转入拟南芥中，得到耐盐性提高的转GmCBL3基因的拟南芥植株。