CN103620039B - 棉花hkt蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了植物转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及来源于棉花的HKT1Na/K转运蛋白GhHKT1，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

Description

棉花HKT蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及来源于棉花的HKT1Na/K转运蛋白GhHKT1，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。
背景技术
盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约0.4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育,则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3%以下的土壤上，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。
植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展（Zhu JK.2002.Salt and drought stress singaltransduction inplants.Annu.Rev.Plant Biol.53:1247-1273;ZhangZL.2011.Arabidopsis FloralInitiator SKB1 Confers High SaltTolerance by Regulating Transcription andPre-mRNA Splicingthrough Altering Histone H4R3and SmallNuclearRibonucleoprotein LSM4Methylation.Plant Cell,23:396–411）。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。
发明内容
本发明人发现了一种新的HKT1Na/K转运蛋白，并将其成功地用于培育耐盐性提高的转基因植物。
在第一方面中，本发明提供了一种HKT1Na/K转运蛋白GhHKT1，其特征在于具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列。
在第二方面中，本发明提供了一种编码权利要求1所述的转运蛋白GhHKT1的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在第三方面中，本发明提供了一种重组表达载体，其特征在于在所述载体的多克隆位点中插入第二方面所述的核苷酸序列。
在第四方面中，本发明提供了一种重组表达载体rd29A-GhHKT1-2300，其特征在于以双元表达载体pCAMBIA2300为骨架载体，在其多克隆位点中插入第二方面所述的核苷酸序列，以Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以诱导型启动子rd29A及Tnos作为所述的核苷酸序列的启动子和终止子。在一个优选实施方案中，所述多克隆位点为PstI和SacI。
在第五方面中，本发明提供了一种含有第二方面所述的核苷酸序列或者第三或第四方面所述的重组表达载体的转基因细胞系。
在第六方面中，本发明提供了一种含有第二方面所述的核苷酸序列或者第三或第四方面所述的重组表达载体的宿主菌。在一个优选实施方案中，所述宿主菌为农杆菌。在一个更优选地实施方案中，所述农杆菌为农杆菌LBA4404。
在第七方面中，本发明提供了一种调控植物耐盐性的方法，是将第二方面所述的核苷酸序列或者第三或第四方面所述的重组表达载体导入植物组织或细胞，并在其中表达。
在第八方面中，本发明提供了一种生产转基因植物的方法，其特征在于用第二方面所述的核苷酸序列或者用第三或第四方面所述的重组表达载体转化所述转基因植物并在其中表达。在一优选的实施方案中，所述转化是将第二方面所述的核苷酸序列整合到所述转基因植物的染色体上。在一个更优选的实施方案中，所述整合是通过以下方式进行的：用第三或第四方面所述的重组表达载体转化农杆菌，再以经转化的农杆菌转染植物并在其中表达。在一个更优选的实施方案中，所述植物为烟草。在一个更优选的实施方案中，所述烟草为普通烟草。
在第九方面中，本发明提供了第二方面所述的核苷酸序列或者第三或第四方面所述的重组表达载体用于制备转基因植物的用途。在一个优选实施方案中，所述植物为烟草。在一个更优选实施方案中，所述烟草为普通烟草。
在第十方面中，本发明提供了一种转基因植物或其种子，其特征在于其中含有并表达第二方面所述的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，所述核苷酸序列是整合在所述转基因植物的染色体上。在一个优选实施方案中，所述转基因植物为烟草。在一个更优选实施方案中，所述烟草为普通烟草。
附图说明
图1示出了植物重组表达载体rd29A-GhHKT1-2300构建流程图。
图2示出了植物重组表达载体rd29A-GhHKT1-2300的结构。
图3示出了转基因烟草的耐盐性测试结果，其中左图为转基因植株（T1K5-2），右图为非转基因烟草。
具体实施方式
下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
实施例
实施例1盐胁迫下棉花SSH文库构建：
具体方法为：
利用Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法通过抑制消减杂交方法构建消减文库。在实验过程中以经NaCl处理6h的棉花幼苗的根的mRNA作为样品（tester），以未处理的棉花幼苗的根的mRNA作为对照（driver）。
（1）供试材料：
冀棉14（国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-30270）播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光暗周期16h/8h条件下培养，每周浇1/2MS培养基（9.39mM KNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mM NH4NO3，0.75mM MgSO4，1.5mM CaCl2，50μM KI，100μM H3BO3，100μMMnSO4，30μM ZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μM CoCl2，100μM Na2EDTA，100μM FeSO4）一次。当苗株长高达25-30cm时用于实验。
（2）材料处理：
将供试幼苗分为2组，每组4株。第一组为对照组，在25℃、光照下培养，放置到1/2MS液体培养基中。第二组为处理组，25℃、光照下培养，放置到添加有终浓度为200mM NaCl的1/2MS液体培养基中，处理6小时，处理完毕后及时剪取两组幼苗的根，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。
（3）总RNA提取：
分别取对照和NaCl处理的棉花根0.5g，用植物RNA提取试剂盒（invitrogen）提取棉花总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA纯化试剂盒(purification of polyA+mRNA from total RNA)分离mRNA。
（4）抑制消减杂交：
为了增加获得表达序列标签（Expressed sequence tag,EST）(unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区。本实验室用RsaI，HaeIII分别对双链cDNA（按照消减试剂盒中记载的方案，由mRNA逆转录获得）进行消化，做两组抑制消减，其他步骤及方法按Clontech公司的PCR-selectTM cDNASubtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制消减杂交，最后合并两组获得的正向消减杂交cDNA片段的第二次PCR产物。
（5）cDNA消减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定
将合并的正向消减杂交cDNA片段的第二次PCR产物（QIAquick PCR PurificationKit纯化，购自Qiagen）与pGEM-TEasy(购自Promega试剂盒)载体连接，依照pGEM-T Easy试剂盒的程序，具体步骤如下：用200μl PCR管依次加入下列成分：纯化cDNA片段的第二次PCR产物3μl，T4连接酶缓冲液5μl，pGEM-T Easy载体1μl，T4DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。取10μL连接反应产物,加入到100μL感受态大肠杆菌JMI09(购自TAKARA)中,冰浴30min、热休克60s、冰浴2min,另加250μLLB培养液（1%Tryptone购自OXOID，0.5%Yeast Extract购自OXOID，1%NaCl购自国药）置37℃摇床中,以225r/min振荡培养30min,取200μL菌液种植于含50μg/mL氨苄青霉素的LB（同上）/X-gal/IPTG（X-gal/IPTG购自TAKARA）培养板上,37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落数,随机挑取300个白色菌落(编号：Gh-S001至Gh-S300)。将300个白色克隆挑于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的96孔细胞培养板(CORNING)中,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20%,于–80℃保存备用。以巢式PCR引物Primer 1（Clontech）和Primer 2R（Clontech）进行菌液PCR扩增,得到211个阳性克隆,对所有阳性克隆在送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序
（6）差异克隆的cDNA测序分析：
将上述211个差异克隆的DNA测序结果去除载体和不明确序列及多余的cDNA后，共得到153个EST(unigene)。经BlastN发现其中87条在GenBank中有同源序列，29条功能未知或者为假定蛋白,另有37条未获得同源匹配,推测可能是处于3’、5’末端非翻译区的较短序列。
实施例2棉花离子通道蛋白GhHKT1的克隆
克隆子Gh-S075序列为SEQ ID No：3，序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列属于离子通道蛋白，本文将克隆子Gh-S075编码的全长基因命名为GhHKT1。
GhHKT1全长基因的克隆
根据已经获得的GhHKT1基因片段，设计两条特异性引物，作为3’RACE的5’端特异性引物。
GhHKT1GSP1：SEQ ID NO:4：
CTGGAAGGAGATGGGTTATAGTC
GhHKT1GSP2：SEQ ID NO:5：
GGGTTGACATTAGTTCAGTTTAT
实验步骤按试剂盒说明书操作（3’RACE System for RapidAmplification ofcDNA Ends试剂盒购自invitrogen公司）
用SEQ ID NO:4与3’端引物AUAP（试剂盒自带），以mRNA逆转录的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。具体步骤如下：ExTaq购自TAKARA，50μl PCR反应体系：5μl 10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ IDNO:4和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。
所得的PCR产物用双馏水稀释100倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO:5与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO:5和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。第二次PCR产物3μ1连接于pGEM-T EasyVector，转化到大肠杆菌JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20%，-80℃保存备用。SEQ ID NO:5与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增,得到6个阳性克隆,送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序,获得该基因的cDNA的3’端。
根据已经获得的GhHKT1基因片段，设计三条特异性引物，作为5’RACE的3’端特异性引物。
GhHKT1GSP3：SEQ ID NO:6：
CCTGCTGATT CATTTTGACT TCC
GhHKT1GSP4：SEQ ID NO:7：
AAGGAGGGAG ATACATCATA ACA
GhHKT1GSP5：SEQ ID NO:8：
GATCAACTAC CGATTCACCA GC
实验步骤按试剂盒说明书操作（5’RACE System for RapidAmplification ofcDNA Ends试剂盒购自invitrogen公司）。
用SEQ ID NO：7与5’通用引物AAP（试剂盒自带），以mRNA逆转录的cDNA（反转录引物SEQ ID NO:6）为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：Ex Taq购自TAKARA，50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl ExTaq、10μM的引物SEQ ID NO:7和AAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。
所得的PCR产物用双蒸水稀释100倍后取2.0μl作为模板，用SEQID NO:8与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQID NO:8和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。第二次PCR产物3μl连接于pGEM-T EasyVector，转化到JM109(具体方法同上),随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20%，-80℃保存备用。SEQ ID NO:8与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增（反应体系及反应条件同上）,得到3个阳性克隆,送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序,获得该基因的cDNA的5’端。
所得的5’RACE产物克隆测序后，与3’RACE产物测序结果拼接。获得GhHKT1全长cDNA序列。根据GhHKT1全长cDNA序列设计一对引物如下：
GhHKT1F：SEQ ID NO:9：
ATG AGT AAC ACT ATT ATC TGT TTC G
GhHKT1R：SEQ ID NO:10：
TTAGGAGAGT TTCCAAGCTT TACC
通过SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10来克隆GhHKT1全长。
采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的cDNA为模板进行PCR反应。50μlPCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。
PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5μl 10×Ex Buffer，0.5μl 5mM的dATP，2.5μl 10×ExTaq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约1600 bp的DNA片段回收（Omega回收试剂盒），连接至pGEM T-easy载体上,转化JM109(方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20%，-80℃保存备用。SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10进行菌液PCR扩增（反应体系及反应条件同上）,得到4个阳性克隆,送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序,序列为SEQ ID NO:2。
实施例3GhHKT1基因植物表达载体构建
选择植物双元表达载体pCAMBIA2300（购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子rd29A及Tnos作为GhHKT1基因的启动子和终止子。
用引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12以植物表达载体PBI121（购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl PBI121，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过EcoRI、BglII酶切连接到pCAMBIA2300(promega，T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-1。
SEQ ID NO:11：
GCAC GAATTC ATACAAATGGAC GAAC GGAT
SEQ ID NO:12：
ATCC AGATCT AGATCCGGTGCAGATTATTTG
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以PBI121为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl PBI121，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过SacI、EcoRI酶切连接到pCAMBIA2300-1(promega T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-2
SEQ ID NO:13：
AAGGA GCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA
SEQ ID NO:14：
TCAGAATTCCCAGTGAATT CCCGATCTAG TA
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16以拟南芥（哥伦比亚型，购自www.arabidopsis.org）DNA（参考Zeng J.,et L.2002,Preparation of total DNA from“recalcit rant plant taxa”,Acta Bot.Sin.,44(6):694-697中的方法提取拟南芥DNA）为模板，扩增拟南芥rd29A启动子。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl拟南芥DNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过HindIII、PstI酶切连接到（连接方法同上）pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3
SEQ ID NO:15：
ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA
SEQ ID NO:16：
TGACTGCA GTCCAAAGATT TTTTTCTTTC CAATAG
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18扩增GhHKT1（模板是实施例2所获得GhHKT1），采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl GhHKT1-pGEM，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。通过PstI、SacI酶切连接到（连接方法同上）pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体rd29A-GhHKT1-2300。
SEQ ID NO:17：
TGACTGCA GATG AGT AAC ACT ATT ATC TGT TTC G
SEQ ID NO:18：
AAGGA GCTCTTAGGAGAGT TTCCAAGCTT TACC。
实施例4rd29A-GhHKT1-2300表达载体转化农杆菌
农杆菌LBA4404（购自Biovector Science Lab,Inc）感受态制备：提前1-2天将农杆菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16h)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml活化后的菌液（1:20的比例）接种于100ml同样浓度抗生素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5h至OD600=0.8。冰浴菌液10min，每隔3min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10min，弃上清液；加入一定量预冷10%甘油重悬浮菌体,4℃下4000g离心10min，收集沉淀；用10%甘油重复洗3-4次；加入适量冰浴预冷的10%甘油重新悬浮细菌沉淀，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。
转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往40μl的感受态细胞中加入1μl的质粒，混匀后冰浴约10min。将感受态和DNA的混合物用枪转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯（购自bio-rad）放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用0.1cm的电击杯的时候，MicroPulser（购自bio-rad）的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的LB培养基。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，28℃，225rpm培养1h。取100～200μl的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml链霉素、50μg/ml卡那霉素），28℃培养。
实施例5利用农杆菌介导的转染法获得转基因烟草
用75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号I5A00660）30s，用灭菌双蒸水洗两次。再用0.1%升汞浸泡8min，用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于MS（18.78mM KNO3，1.25mMKH2PO4，20.6mM NH4NO3，1.5mM MgSO4，3.0mM CaCl2，50μM KI，100μM H3BO3，100μM MnSO4，30μM ZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μM CoCl2，100μM Na2EDTA，100μM FeSO4，7.4g/L琼脂，蔗糖30g/L）上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体rd29A-GhHKT1-2300的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天（MS培养基）。将叶片转到分化培养基（MS+1mg/L细胞分裂素（BA）+0.1mg/L萘乙酸（NAA）+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素）上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基（MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素）中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。
取获得的转基因烟草叶片，提取DNA（同实施例3中拟南芥DNA提取方法），用SEQ IDNO:9：和SEQ ID NO:10（50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min），PCR鉴定，保存阳性植株进行编号T0K1-T0K20。
实施例6过表达GhHKT1转基因烟草T1的耐盐模拟实验及功能鉴定
灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透。选取T0代转基因烟草种子（即实施例5中所获得的转基因植株的种子T0K1-T0K5）、对照烟草种子分别播种在蛭石上，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，每5天浇一次1/2MS。培养25天之后，摘取最下端一片叶子，提取基因组DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)，用SEQ IDNO:9：和SEQ ID NO:10（PCR条件同上）做PCR鉴定，剔除阴性植株（对照烟草也同样摘取一片叶子）。挑取大小一致的转基因烟草、对照烟草做耐盐实验，浇灌100mM NaCl，其中转基因烟草分为五组（5个不同转化事件），每组10_株；对照组含10_株。25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，14天后观察结果：T1代转基因植株的耐盐性鉴定表明，对照植株不能正常生长，生长明显受到抑制，而转基因植株生长明显高于对照植株，显现出明显的耐盐性（参见图3及表1）。
表1表达GhHKT1的转基因烟草表现出良好的耐盐性。耐盐鉴定处理：浇灌100mMNaCl，14天后，称量不同转化事件植株重量（表1），数值为平均值±标准偏差。
实验组 植株重量（g）
T1K1组 0.81±0.09
T1K2组 0.56±0.06
T1K3组 0.76±0.08
T1K4组 0.85±0.06
T1K5组 0.60±0.07
对照组 0.30±0.04

Claims (17)

1.一种HKT1Na/K转运蛋白GhHKT1，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的转运蛋白GhHKT1的核苷酸序列。
3.权利要求2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于在所述载体的多克隆位点中插入权利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一种重组表达载体rd29A-GhHKT1-2300，其特征在于以双元表达载体pCAMBIA2300为骨架载体，在其多克隆位点中插入权利要求3所述的核苷酸序列，以Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以诱导型启动子rd29A及Tnos作为权利要求3所述的核苷酸序列的启动子和终止子。
6.权利要求5的重组表达载体rd29A-GhHKT1-2300，其中所述多克隆位点为PstI和SacI。
7.一种含有权利要求2或3所述的核苷酸序列或者权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的转基因细胞系。
8.一种含有权利要求2或3所述的核苷酸序列或者权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的宿主菌。
9.权利要求8的宿主菌，所述宿主菌为农杆菌。
10.权利要求9的宿主菌，所述宿主菌为农杆菌LBA4404。
11.一种调控植物耐盐性的方法，是将权利要求2或3所述的核苷酸序列或者权利要求4-6任一项所述的重组表达载体导入植物组织或细胞，并在其中表达。
12.一种生产转基因植物的方法，其特征在于用权利要求2或3所述的核苷酸序列或者用权利要求4-6任一项所述的重组表达载体转化所述转基因植物并在其中表达。
13.权利要求12的方法，其中所述转化是将权利要求2或3所述的核苷酸序列整合到所述转基因植物的染色体上。
14.权利要求13的方法，其中所述整合是通过以下方式进行的：用权利要求4-6任一项所述的重组表达载体转化农杆菌，再以经转化的农杆菌转染植物并在其中表达。
15.权利要求12-14任一项的方法，其中所述植物为烟草。
16.权利要求15的方法，其中所述烟草为普通烟草。
17.权利要求2或3所述的核苷酸序列或者权利要求4-6任一项所述的重组表达载体用于制备转基因植物的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593380B (zh) * 2014-12-29 2017-08-25 中国农业科学院作物科学研究所 用于提高植物耐盐性的编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1;1a及其应用
CN105566466B (zh) * 2015-11-18 2020-11-24 烟台大学 一种互花米草耐盐蛋白hkt及其编码基因和应用
CN109354613B (zh) * 2018-11-12 2021-08-31 贵州省烟草科学研究院 一种来自烟草的钾转运蛋白tpk1及其编码基因与应用
CN109553668B (zh) * 2018-11-14 2021-08-31 贵州省烟草科学研究院 烟草kup1基因及应用
CN110982815B (zh) * 2019-06-24 2023-03-31 河南科技学院 一种棉花钾转运体基因启动子及其应用
CN112724219B (zh) * 2021-02-01 2022-09-06 内蒙古大学 超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树
CN113512563A (zh) * 2021-08-02 2021-10-19 中国农业科学院棉花研究所 GhPOT8基因在调控植物耐盐胁迫能力中的应用及调控植物耐盐胁迫能力的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996005722A1 (en) * 1994-08-23 1996-02-29 The Regents Of The University Of California High-affinity potassium uptake transporter from higher plants
CN101090972A (zh) * 2004-10-29 2007-12-19 克罗普迪塞恩股份有限公司 具有改良生长特性的植物及其制备方法
CN101456909A (zh) * 2009-01-13 2009-06-17 南京农业大学 一种大豆hkt类蛋白及其编码基因与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996005722A1 (en) * 1994-08-23 1996-02-29 The Regents Of The University Of California High-affinity potassium uptake transporter from higher plants
CN101090972A (zh) * 2004-10-29 2007-12-19 克罗普迪塞恩股份有限公司 具有改良生长特性的植物及其制备方法
CN101456909A (zh) * 2009-01-13 2009-06-17 南京农业大学 一种大豆hkt类蛋白及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The Control of Single-Celled Cotton Fiber Elongation by Developmentally Reversible Gating of Plasmodesmata and Coordinated Expression of Sucrose and K+ Transporters and Expansin;Yong-Ling Ruan等;《The Plant Cell》;20010131;第13卷;47-60页 *
植物K+吸收转运的分子机制研究进展;鲁黎明等;《棉花学报》;20061231;第18卷(第06期);379-385页 *
高亲和K+转运载体(HKT)与植物抗盐性;邵群等;《植物生理学通讯》;20060430;第42卷(第02期);175-181页 *

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