CN111876520A - 大豆e2/gigantea同源基因定量pcr引物及其应用 - Google Patents

大豆e2/gigantea同源基因定量pcr引物及其应用 Download PDF

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韩天富
武婷婷
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Abstract

本发明公开了一种大豆E2/GIGANTEA同源基因定量PCR引物及其应用。本发明提供了一套用于检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量的特异性定量PCR引物，为序列表中序列1‑6所示的六条单链DNA。本发明通过采用实时定量PCR的方法，明确GIGANTEA(GI)及其同源基因表达特性，由于该基因不仅在大豆生育期中具有重要作用，而且在生物节律性运动/生物钟中具有重要作用，因此检测该基因的表达，在大豆生物学研究及应用中具有重要作用。本发明对于了解掌握大豆生长习性有重要意义。

Description

大豆E2/GIGANTEA同源基因定量PCR引物及其应用
技术领域
本发明涉及大豆分子遗传育种领域，具体涉及一种大豆E2/GIGANTEA同源基因定量PCR引物及其应用。
背景技术
实时定量PCR技术可以方便快捷的评价目标基因表达水平，是分子生物学和分子遗传育种领域的广泛使用的重要分析工具。然而，它对目标基因引物设计的专一性特异性的要求高，这成为目标基因表达水平精准分析的限制性因素。尤其是在基因组同源基因拷贝数较多的情况下，如何设计可正确有效区分各个同源基因的特异性引物至关重要。
大豆是典型的短日照作物，也是植物光周期反应研究的模式材料，更是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。在我国，大豆是四大粮食作物之一，对保证国家粮食安全、改善城乡人民生活和增加农民收入有十分重要的作用。
外部环境时刻在变化，最为直观显著的是昼夜更替与四季变化，及与之密切相关的温度波动。生物适应这种外界的波动，发展了一套追随时间的内在机制，即生物节律钟(circadian clock)。生物节律钟通常包括三个部分：信号输入途径、节律振荡子和信号输出途径。信号输入途径感知外部环境信号的周期性波动如光照与温度的昼夜变化，传递给节律振荡子，调节生物节律钟的节律，输出节律信号到信号输出途径，调节目标基因、蛋白和代谢产物，从而使生物更好地适应外界环境。由此，与昼夜更替周期相一致，生物节律钟大体保持24h的周期。生物节律钟往往由多个基因/蛋白构成，形成多个互锁的转录翻译反馈环路。研究生物节律钟对于了解掌握大豆生长习性至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆E2/GIGANTEA同源基因定量PCR引物及其应用。
第一方面，本发明保护引物组合，该引物组合包括引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ；
所述引物对Ⅰ由引物Glyma.10G221500-F和引物Glyma.10G221500-R组成；
所述引物Glyma.10G221500-F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Glyma.10G221500-R为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅱ由引物Glyma.16G163200-F和引物Glyma.16G163200-R组成；
所述引物Glyma.16G163200-F为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Glyma.16G163200-R为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅲ由引物Glyma.20G170000-F和引物Glyma.20G170000-R组成；
所述引物Glyma.20G170000-F为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Glyma.20G170000-R为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合还包括引物对Ⅳ；所述引物对Ⅳ由引物GmACTIN-F和引物GmACTIN-R组成；所述引物GmACTIN-F为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(a10)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物GmACTIN-R为如下(a13)或(a14)：
(a13)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(a14)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子。
具体的，所述引物组合可由所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ和所述引物对Ⅲ组成，还可由所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ与所述引物对Ⅳ组成。
上述引物组合的用途可为下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量；
(b2)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达模式；
(b3)大豆生长习性检测；
(b4)大豆生物节律钟检测。
第二方面，本发明保护第一方面所述引物组合的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量；
(b2)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达模式；
(b3)大豆生长习性检测；
(b4)大豆生物节律钟检测。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量；
(b2)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达模式；
(b3)大豆生长习性检测；
(b4)大豆生物节律钟检测。
第三方面，本发明保护含有第一方面所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量；
(b2)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达模式；
(b3)大豆生长习性检测；
(b4)大豆生物节律钟检测。
第四方面，本发明保护第三方面所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
第五方面，本发明保护大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量或表达模式检测方法，包括如下步骤：以待测大豆的cDNA为模板，采用前文所述引物组合进行定量PCR检测，得到大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量或表达模式结果。
第六方面，本发明保护大豆生物节律钟检测方法，包括如下步骤：以待测大豆的cDNA为模板，采用前文所述引物组合进行定量PCR检测，得到大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量在一定时间内的变化趋势，研究大豆生物节律钟变化规律。
以上任一所述大豆E2/GIGANTEA同源基因为Glyma.10G221500和/或Glyma.16G163200和/或Glyma.20G170000。
本发明提供了一套用于检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量的特异性定量PCR引物。本发明通过采用实时定量PCR的方法，明确GIGANTEA(GI)及其同源基因表达特性，由于该基因不仅在大豆生育期中具有重要作用，而且在生物节律性运动/生物钟中具有重要作用，因此检测该基因的表达，在大豆生物学研究及应用中具有重要作用。本发明对于了解掌握大豆生长习性有重要意义。
附图说明
图1为Glyma.10G221500的扩增曲线。
图2为Glyma.10G221500的溶解曲线。
图3为Glyma.16G163200的扩增曲线。
图4为Glyma.16G163200的溶解曲线。
图5为Glyma.20G170000的扩增曲线。
图6为Glyma.20G170000的溶解曲线。
图7为Glyma.10G221500在大豆品种中黄24中昼夜节律表达情况。
图8为Glyma.16G163200在大豆品种中黄24中昼夜节律表达情况。
图9为Glyma.20G170000在大豆品种中黄24中昼夜节律表达情况。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量的特异性定量PCR引物设计
1.生物节律钟往往由多个基因/蛋白构成，形成多个互锁的转录翻译反馈环路。其中GIGANTEA(GI)是其中一个重要的核心组分。该基因在大豆中主要有三个同源基因Glyma.10G221500，Glyma.16G163200，Glyma.20G170000。其中Glyma.10G221500是大豆生育期基因E2，在大豆生长发育、生态适应性中发挥重要作用。因此，通过采用实时定量PCR的方法，明确GIGANTEA(GI)及其同源基因表达特性，对于了解掌握大豆生长习性至关重要，为此，本申请发明人针对大豆E2/GIGANTEA同源基因Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000设计大量引物，获得了一组特异性好的定量检测这三个基因表达量的PCR引物，如表1所示。
表1
Figure BDA0002658275050000051
2.引物检测效果鉴定
待测大豆样品为华春1号，绥农14，自贡冬豆和中黄13。除了自贡冬豆(记载于如下文献中:韩天富,盖钧镒.大豆开花逆转现象的发现[J].作物学报,1998,24(2):168-171.)由大豆改良中心北京分中心提供，其他均为审定品种。
下述实验中，CHC，CSN，CZG，CZH13分别为正常生长2周龄的华春1号，绥农14，自贡冬豆和中黄13；GHC，GSN，GZG，GZH13分别为光处理2周龄的华春1号，绥农14，自贡冬豆和中黄13；7T和10T表示取样时间点分别为光处理7小时和10小时(均从亮灯开始计时)。光处理为：12h光照培养,12h暗培养；光照强度为15000Lux,光源波长强化500nm、600-700nm,温度为25℃。正常生长为：12h光照培养,12h暗培养；光照强度为15000Lux,光源波长强化600-700nm,温度为25℃。
每个待测大豆重复3次，每次重复的步骤如下：
(1)采用TRNzol试剂盒提取待测大豆叶片的RNA，然后使用Nanodrop仪器测定RNA浓度，得到待测大豆的RNA。
(2)取待测大豆的RNA，采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒进行反转录，得到待测大豆的cDNA，并用双蒸水稀释到相当于1.67ng/μl RNA的转录产物。
(3)以步骤(2)得到的产物为模板，采用步骤1合成的用于检测大豆Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000基因表达量的引物对进行实时定量PCR扩增(以GmActin基因为内参)，并计算拷贝数。
实时定量PCR上样体系按照StarLighter试剂盒的说明书上样分别利用各引物对检测相应基因的表达量，反应体系为10μL，由5μL 2×qPCR Mix、0.2μL 50×ROX Low、0.5μL上游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“F”的引物)、0.5μL下游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“R”的引物)、2.5μL待测大豆的cDNA和1.3μL ddH2O组成。
(4)完成步骤(3)后，以循环数为横坐标，ΔRn为纵坐标，绘制扩增曲线。
对于8个待测大豆样本来说，Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000的扩增曲线见图1，图3和图5：可见各引物对在指数扩增阶段的扩增曲线与引物对Actin在指数扩增阶段的扩增曲线基本平行。结果表明，各引物对与引物对Actin的扩增效率基本一致。
(5)完成步骤(3)后，绘制溶解曲线。
采用引物对进行实时定量PCR扩增，上述待测大豆样本的溶解曲线见图2，图4和图6：扩增产物的溶解曲线均呈现单峰分布，且主峰基本重叠。结果表明，各引物对的特异性好，扩增产物无杂带。
由此可见，Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000引物对的特异性好，扩增效率高，可以用于实时定量PCR扩增检测Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000基因表达量。
实施例2、定量PCR引物应用
本实施例主要使用实施例1制备的特异性定量PCR引物分析大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量的昼夜节律特性。
本实施例所用大豆品种为中黄24(选育单位：中国农业科学院作物科学研究所，用品种吉林21×(汾豆31×中豆19)选育而成的大豆品种。2008年8月7日第二届国家农作物品种审定委员会第二次会议审定通过，审定编号为国审豆2008003。)。
1、将中黄24种植至单叶完全展开，从零点开始，每隔三小时摘取单叶为样品，液氮冻透后置于-80度冰箱保存备用。
2、使用天根公司TRNzol试剂盒，根据试剂盒说明书，提取步骤1收集的大豆单叶样品的RNA，并使用Nanodrop仪器，测定RNA浓度。
3、使用全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix试剂盒，根据试剂盒说明书，将RNA样品反转录获得cDNA，并用双蒸水稀释到相当于1.67ng/μl RNA的转录产物。
4、以步骤3得到的cDNA为模板，使用StarLighter试剂盒，根据试剂盒说明书，配置10μl的qPCR反应体系，反应体系如表2所示。
表2
Figure BDA0002658275050000071
用ABI公司QuantStudio 7Flex仪器进行表达量的定量分析，反应程序如下：预变性阶段：95℃ 20秒；PCR扩增阶段：95℃ 1秒，60℃ 20秒，50个循环；溶解曲线阶段：95℃ 15秒，60℃ 60秒，然后以0.05℃/秒的速度升温至95℃。
采用2-ΔCT分析方法分析目标基因为Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000的相对表达量。
结果如图7-图9所示。结果显示，大豆E2/GIGANTEA同源基因Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000的表达量均呈规律性的以24小时为周期的节律变化，它们均在白天开始表达上升，并在下午开始下降，至半夜降至最低。
上述结果说明采用本发明的引物对对大豆E2/GIGANTEA同源基因Glyma.10G221500、Glyma.16G163200和Glyma.20G170000进行检测，可以实现大豆生物钟节律变化的检测。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 大豆E2/GIGANTEA同源基因定量PCR引物及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gcagttgtac ttcaggcgga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
catctgtggc tcgcagtagt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
agccacagat ggaatgctgg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
ggcgacactt taacaggttt ga 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
ctaagatcca cgctggcaga 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gcataatgca tcaacaacct gtc 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
cggtggttct atcttggcat c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
gtctttcgct tcaataaccc ta 22

Claims (8)

1.引物组合，包括引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ；
所述引物对Ⅰ由引物Glyma.10G221500-F和引物Glyma.10G221500-R组成；
所述引物Glyma.10G221500-F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Glyma.10G221500-R为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅱ由引物Glyma.16G163200-F和引物Glyma.16G163200-R组成；
所述引物Glyma.16G163200-F为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Glyma.16G163200-R为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅲ由引物Glyma.20G170000-F和引物Glyma.20G170000-R组成；
所述引物Glyma.20G170000-F为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Glyma.20G170000-R为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述的引物组合的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量；
(b2)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达模式；
(b3)大豆生长习性检测；
(b4)大豆生物节律钟检测。
3.权利要求1所述的引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量；
(b2)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达模式；
(b3)大豆生长习性检测；
(b4)大豆生物节律钟检测。
4.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量；
(b2)检测大豆E2/GIGANTEA同源基因表达模式；
(b3)大豆生长习性检测；
(b4)大豆生物节律钟检测。
5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
6.大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量或表达模式检测方法，包括如下步骤：以待测大豆的cDNA为模板，采用权利要求1所述引物组合进行定量PCR检测，得到大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量或表达模式结果。
7.大豆生物节律钟检测方法，包括如下步骤：以待测大豆的cDNA为模板，采用权利要求1所述引物组合进行定量PCR检测，得到大豆E2/GIGANTEA同源基因表达量在一定时间内的变化趋势，研究大豆生物节律钟变化规律。
8.如权利要求2至7任一所述的应用或试剂盒或方法，其特征在于：所述大豆E2/GIGANTEA同源基因为Glyma.10G221500和/或Glyma.16G163200和/或Glyma.20G170000。
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