CN110643733B - 一种检测大豆生物钟基因elf3同源基因的表达量的试剂盒 - Google Patents

一种检测大豆生物钟基因elf3同源基因的表达量的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测大豆生物钟基因ELF3同源基因的表达量的试剂盒。其包括用于扩增Glyma.04G050200基因的引物对200、用于扩增Glyma.08G197500基因的引物对500、用于扩增Glyma.14G091900基因的引物对900和用于扩增Glyma.17G231600基因的引物对600；引物对200、引物对500、引物对900和引物对600的上下游引物依次如SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：10所示。实验证明，采用引物对200、引物对500、引物对900和引物对600进行实时定量PCR，可以获得相应基因的表达量，进而分析大豆的生物节律和生长习性。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种检测大豆生物钟基因ELF3同源基因的表达量的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测大豆生物钟基因ELF3同源基因的表达量的试剂盒。
背景技术
实时定量PCR技术可以方便快捷的评价目标基因表达水平，是分子生物学和分子遗传育种领域的广泛使用的重要分析工具。然而，它对目标基因引物设计的专一性特异性的要求高，这成为目标基因表达水平精准分析的限制性因素。尤其是在基因组同源基因拷贝数较多的情况下，获得有效区分各个同源基因的特异性引物至关重要。
大豆是典型的短日照作物，也是植物光周期反应研究的模式材料，更是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。在我国，大豆是四大粮食作物之一，对保证国家粮食安全、改善城乡人民生活和增加农民收入有十分重要的作用。同时，大豆是古四倍体生物，历史上发生多次基因组复制事件，导致同源基因拷贝数多，相似性较高。因此，在分析大豆基因表达水平时，特别需要关注引物的特异性和有效性问题。
外部环境时刻在变化，最为直观显著的是昼夜更替与四季变化，及与之密切相关的温度波动。生物适应这种外界的波动，发展了一套追随时间的内在机制，即生物节律钟。生物节律钟通常包括三个部分：信号输入途径、节律振荡子和信号输出途径。信号输入途径感知外部环境信号的周期性波动如光照与温度的昼夜变化，传递给节律振荡子，调节生物节律钟的节律，输出节律信号到信号输出途径，调节目标基因、蛋白和代谢产物，从而使生物更好地适应外界环境。因此，与昼夜更替周期相一致，生物节律钟大体保持24h的周期。生物节律钟往往由多个基因/蛋白构成，形成多个互锁的转录翻译反馈环路，其中ELF3是其中一个重要的核心组分。
发明内容
本发明的目的是检测大豆生物钟基因ELF3同源基因的表达量，大豆生物钟基因ELF3的同源基因包括Glyma.04G050200基因(Genebank号为100793561)、Glyma.08G197500基因(Genebank号为100820110)、Glyma.14G091900基因(Genebank号为100818279)和Glyma.17G231600基因(Genebank号为100788038)。
本发明首先保护一种试剂盒，可包括用于扩增Glyma.04G050200基因的引物对200、用于扩增Glyma.08G197500基因的引物对500、用于扩增Glyma.14G091900基因的引物对900和用于扩增Glyma.17G231600基因的引物对600；Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因均为大豆生物钟基因ELF3的同源基因；
所述引物对200可由用于扩增特异DNA片段1的两条引物组成；所述特异DNA片段1中具有大豆基因组中引物200-F和引物200-R组成的引物对的靶序列；
所述引物200-F的核苷酸序列可如SEQ ID NO：3所示；
所述引物200-R的核苷酸序列可如SEQ ID NO：4所示；
所述引物对500可由用于扩增特异DNA片段2的两条引物组成；所述特异DNA片段2中具有大豆基因组中引物500-F和引物500-R组成的引物对的靶序列；
所述引物500-F的核苷酸序列可如SEQ ID NO：5所示；
所述引物500-R的核苷酸序列可如SEQ ID NO：6所示；
所述引物对900可由用于扩增特异DNA片段3的两条引物组成；所述特异DNA片段3中具有大豆基因组中引物900-F和引物900-R组成的引物对的靶序列；
所述引物900-F的核苷酸序列可如SEQ ID NO：7所示；
所述引物900-R的核苷酸序列可如SEQ ID NO：8所示；
所述引物对600可由用于扩增特异DNA片段4的两条引物组成；所述特异DNA片段4中具有大豆基因组中引物600-F和引物600-R组成的引物对的靶序列；
所述引物600-F的核苷酸序列可如SEQ ID NO：9所示；
所述引物600-R的核苷酸序列可如SEQ ID NO：10所示；
所述试剂盒的用途可为b1)或b2)或b3)：
b1)检测Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因中至少一个基因的表达量；
b2)分析大豆的生物节律；
b3)判断大豆的生长习性。
所述引物对200可由所述引物200-F和所述引物200-R组成。
所述引物对500可由所述引物500-F和所述引物500-R组成。
所述引物对900可由所述引物900-F和所述引物900-R组成。
所述引物对600可由所述引物600-F和所述引物600-R组成。
上述任一所述试剂盒具体可由所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900和所述引物对600组成。
上述任一所述试剂盒还可包括内参引物对；所述内参引物对的靶序列位于大豆的内参基因中。所述大豆的内参基因可为Glyma.18G290800基因。
上述任一所述试剂盒具体可由所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900、所述引物对600和所述内参引物对组成。
所述内参引物对可为用于扩增Glyma.18G290800基因的引物对Actin；
所述引物对Actin可由用于扩增特异DNA片段5的两条引物组成；所述特异DNA片段5中具有大豆基因组中引物Actin-F和引物Actin-R组成的引物对的靶序列；
所述引物Actin-F的核苷酸序列可如SEQ ID NO：1所示；
所述引物Actin-R的核苷酸序列可如SEQ ID NO：2所示。
所述引物对Actin具体可由所述引物Actin-F和所述引物Actin-R组成。
本发明还保护上述任一所述的试剂盒的制备方法，可包括e1)或e2)。
e1)将所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900、所述引物对600和所述内参引物对”中的各个引物分别单独包装的步骤。
e2)将所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900和所述引物对600中的各个引物分别单独包装的步骤。
本发明还保护所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900和所述引物对600在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为b1)或b2)或b3)：
b1)检测Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因中至少一个基因的表达量；
b2)分析大豆的生物节律；
b3)判断大豆的生长习性。
本发明还保护所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900、所述引物对600和所述内参引物对”在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为b1)或b2)或b3)：
b1)检测Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因中至少一个基因的表达量；
b2)分析大豆的生物节律；
b3)判断大豆的生长习性。
本发明还保护所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900和所述引物对600中的至少一个引物对在分析大豆的生物节律和/或判断大豆的生长习性中的应用。
本发明还保护d1)或d2)或d3)或d4)。
本发明保护d1)一种检测Glyma.04G050200基因表达量的方法，可包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述引物对200进行实时定量PCR的步骤。
本发明保护d2)一种检测Glyma.08G197500基因表达量的方法，可包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述引物对500进行实时定量PCR的步骤。
本发明保护d3)一种检测Glyma.14G091900基因表达量的方法，可包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述引物对900进行实时定量PCR的步骤。
本发明保护d4)一种检测Glyma.17G231600基因表达量的方法，可包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述引物对600进行实时定量PCR的步骤。
上述任一所述的方法中，所述样本可为大豆。所述样本具体可为大豆叶片。
实验证明，引物对200、引物对500、引物对900和引物对600的特异性好，扩增效率高。分别采用引物对200、引物对500、引物对900和引物对600进行实时定量PCR，可以依次获得Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的表达量的表达量，通过基因表达量进而可以分析大豆的生物节律和生长习性。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1步骤一中2的扩增曲线。
图2为实施例1步骤一中2的溶解曲线。
图3为实施例1步骤二中2的扩增曲线。
图4为实施例1步骤二中2的溶解曲线。
图5为实施例1步骤三中2的扩增曲线。
图6为实施例1步骤三中2的溶解曲线。
图7为实施例1步骤四中2的扩增曲线。
图8为实施例1步骤四中2的溶解曲线。
图9为Glyma.04G050200基因在大豆品种中黄24中昼夜节律表达情况。
图10为Glyma.08G197500基因在大豆品种中黄24中昼夜节律表达情况。
图11为Glyma.14G091900基因在大豆品种中黄24中昼夜节律表达情况。
图12为Glyma.17G231600基因在大豆品种中黄24中昼夜节律表达情况。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，引物合成及测序均由北京擎科生物科技有限公司完成。
大豆品种中黄24(记载于如下文献中：Yue Y，Liu N，Jiang B，et al.A SingleNucleotide Deletion inJEncoding GmELF3 Confers Long Juvenility and IsAssociated with Adaption of Tropic Soybean[J].Molecular Plant，2017，10(4):656-658.)由大豆改良中心北京分中心提供。在下文中，大豆品种中黄24简称中黄24。
下述实施例中，Glyma.18G290800基因的Genebank号为100792119，Glyma.18G290800基因在下文中简称GmActin基因。引物对Actin用于检测GmActin基因表达量。组成引物对Actin的上游引物和下游引物的核苷酸序列详见表1。
瓦窑黄豆(记载于如下文献中：Cheng Y，Ma Q，Ren H，et al.Fine mapping ofaPhytophthora-resistance geneRpsWYin soybean(Glycine maxL.)by high-throughputgenome-wide sequencing[J].Theoretical and Applied Genetics，2017，130(5):1041-1051.)由大豆改良中心广州分中心提供。
自贡冬豆(记载于如下文献中：韩天富，盖钧镒.大豆开花逆转现象的发现[J].作物学报，1998，24(2):168-171.)由大豆改良中心北京分中心提供。
下述实施例中，CW为正常生长2周龄的瓦窑黄豆，CZG为正常生长2周龄的自贡冬豆，GW为光处理2周龄的瓦窑黄豆，GZG为光处理2周龄的自贡冬豆。光处理为：12h光照培养，12h暗培养；光照强度为15000Lux，光源波长强化500nm、600-700nm，温度为25℃。正常生长为：12h光照培养，12h暗培养；光照强度为15000Lux，光源波长强化600-700nm，温度为25℃。
TRNzol试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品。
TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒为北京全式金生物技术有限公司的产品。
QuantStudio 7Flex为ABI公司的产品。
StarLighter试剂盒为北京启衡星生物科技有限公司的产品。
实施例1、检测大豆生物钟基因ELF3的同源基因表达量的试剂盒的制备
根据大豆品种Williams82的基因组序列，获得大豆生物钟基因ELF3的同源基因，包括Glyma.04G050200基因(Genebank号为100793561)、Glyma.08G197500基因(Genebank号为100820110)、Glyma.14G091900基因(Genebank号为100818279)和Glyma.17G231600基因(Genebank号为100788038)。
一、检测大豆Glyma.04G050200基因表达量的引物对的获得和鉴定
1、将Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的主要转录序列进行同源比对，选取Glyma.04G050200基因和其它三个基因差异性大的区域，设计并合成用于检测大豆Glyma.04G050200基因表达量的引物对。其中一个引物对为引物对200。组成引物对200的上游引物和下游引物的核苷酸序列详见表1。
表1
Figure BDA0002265310060000061
注：引物对名称中含有“F”的为上游引物，引物对名称中含有“R”的为下游引物。
2、鉴定
待测大豆为CW、CZG、GW或GZG。
每个待测大豆重复2次，每次重复的步骤如下：
(1)采用TRNzol试剂盒提取待测大豆叶片的RNA，然后使用Nanodrop仪器测定RNA浓度，得到待测大豆的RNA。
(2)取待测大豆的RNA，采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒进行反转录，得到待测大豆的cDNA。
(3)以待测大豆的cDNA(浓度为1.67ng/μL)为模板，采用步骤1合成的用于检测大豆Glyma.04G050200基因表达量的引物对进行实时定量PCR扩增(以GmActin基因为内参)，并计算拷贝数。
实时定量PCR上样体系按照StarLighter试剂盒的说明书上样，反应体系为10μL，由5μL 2×qPCR Mix、0.2μL50×ROX Low、0.5μL上游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“F”的引物)、0.5μL下游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“R”的引物)、2.5μL待测大豆的cDNA和1.3μLddH2O组成。
(4)完成步骤(3)后，以循环数为横坐标，ΔRn为纵坐标，绘制扩增曲线。
采用引物对200进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的扩增曲线见图1：引物对200在指数扩增阶段的扩增曲线与引物对Actin在指数扩增阶段的扩增曲线基本平行。结果表明，引物对200与引物对Actin的扩增效率基本一致。
(5)完成步骤(3)后，绘制溶解曲线。
采用引物对200进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的溶解曲线见图2(CW-3和CW-6为CW的两个重复，CZG-3和CZG-6为CZG的两个重复，GW-3和GW-6为GW的两个重复，GZG-3和GZG-6为GZG的两个重复)：扩增产物的溶解曲线均呈现单峰分布，且主峰基本重叠。结果表明，引物对200的特异性好，扩增产物无杂带。
由此可见，引物对200的特异性好，扩增效率高，可以用于实时定量PCR扩增检测Glyma.04G050200基因的表达量。
二、检测大豆Glyma.08G197500基因表达量的引物对的获得和鉴定
1、将Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的主要转录序列进行同源比对，选取Glyma.08G197500和其它三个基因差异性大的区域，设计并合成用于检测大豆Glyma.08G197500基因表达量的引物对。其中一个引物对为引物对500。组成引物对500的上游引物和下游引物的核苷酸序列详见表1。
2、鉴定
待测大豆为CW、CZG、GW或GZG。
每个待测大豆重复2次，每次重复的步骤如下：
(1)采用TRNzol试剂盒提取待测大豆叶片的RNA，然后使用Nanodrop仪器测定RNA浓度，得到待测大豆的RNA。
(2)取待测大豆的RNA，采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒进行反转录，得到待测大豆的cDNA。
(3)以待测大豆的cDNA(浓度为1.67ng/μL)为模板，采用步骤1合成的用于检测大豆Glyma.08G197500基因表达量的引物对进行实时定量PCR扩增(以GmActin基因为内参)，并计算拷贝数。
实时定量PCR上样体系按照StarLighter试剂盒的说明书上样，反应体系为10μL，由5μL 2×qPCR Mix、0.2μL50×ROX Low、0.5μL上游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“F”的引物)、0.5μL下游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“R”的引物)、2.5μL待测大豆的cDNA和1.3μLddH2O组成。
(4)完成步骤(3)后，以循环数为横坐标，ΔRn为纵坐标，绘制扩增曲线。
采用引物对500进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的扩增曲线见图3：引物对500在指数扩增阶段的扩增曲线与引物对Actin在指数扩增阶段的扩增曲线基本平行。结果表明，引物对500与引物对Actin的扩增效率基本一致。
(5)完成步骤(3)后，绘制溶解曲线。
采用引物对500进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的溶解曲线见图4(CW-3和CW-6为CW的两个重复，CZG-3和CZG-6为CZG的两个重复，GW-3和GW-6为GW的两个重复，GZG-3和GZG-6为GZG的两个重复)：扩增产物的溶解曲线均呈现单峰分布，且主峰基本重叠。结果表明，引物对500的特异性好，扩增产物无杂带。
由此可见，引物对500的特异性好，扩增效率高，可以用于实时定量PCR扩增检测Glyma.08G197500基因表达量。
三、检测大豆Glyma.14G091900基因表达量的引物对的获得和鉴定
1、将Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的主要转录序列进行同源比对，选取Glyma.14G091900和其它三个基因差异性大的区域，设计并合成用于检测大豆Glyma.14G091900基因表达量的引物对。其中一个引物对为引物对900。组成引物对900的上游引物和下游引物的核苷酸序列详见表1。
2、鉴定
待测大豆为CW、CZG、GW或GZG。
每个待测大豆重复2次，每次重复的步骤如下：
(1)采用TRNzol试剂盒提取待测大豆叶片的RNA，然后使用Nanodrop仪器测定RNA浓度，得到待测大豆的RNA。
(2)取待测大豆的RNA，采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒进行反转录，得到待测大豆的cDNA。
(3)以待测大豆的cDNA(浓度为1.67ng/μL)为模板，采用步骤1合成的用于检测大豆Glyma.14G091900基因表达量的引物对进行实时定量PCR扩增(以GmActin基因为内参)，并计算拷贝数。
实时定量PCR上样体系按照StarLighter试剂盒的说明书上样，反应体系为10μL，由5μL 2×qPCR Mix、0.2μL50×ROX Low、0.5μL上游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“F”的引物)、0.5μL下游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“R”的引物)、2.5μL待测大豆的cDNA和1.3μLddH2O组成。
(4)完成步骤(3)后，以循环数为横坐标，ΔRn为纵坐标，绘制扩增曲线。
采用引物对900进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的扩增曲线见图5：引物对900在指数扩增阶段的扩增曲线与引物对Actin在指数扩增阶段的扩增曲线基本平行。结果表明，引物对900与引物对Actin的扩增效率基本一致。
(5)完成步骤(3)后，绘制溶解曲线。
采用引物对900进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的溶解曲线见图6(CW-3和CW-6为CW的两个重复，CZG-3和CZG-6为CZG的两个重复，GW-3和GW-6为GW的两个重复，GZG-3和GZG-6为GZG的两个重复)：扩增产物的溶解曲线均呈现单峰分布，且主峰基本重叠。结果表明，引物对900的特异性好，扩增产物无杂带。
由此可见，引物对900的特异性好，扩增效率高，可以用于实时定量PCR扩增检测Glyma.14G091900基因表达量。
四、检测大豆Glyma.17G231600基因表达量的引物对的获得和鉴定
1、将Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的主要转录序列进行同源比对，选取Glyma.17G231600和其它三个基因差异性大的区域，设计并合成用于检测大豆Glyma.17G231600基因表达量的引物对。其中一个引物对为引物对600。组成引物对600的上游引物和下游引物的核苷酸序列详见表1。
2、鉴定
待测大豆为CW、CZG、GW或GZG。
每个待测大豆重复2次，每次重复的步骤如下：
(1)采用TRNzol试剂盒提取待测大豆叶片的RNA，然后使用Nanodrop仪器测定RNA浓度，得到待测大豆的RNA。
(2)取待测大豆的RNA，采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒进行反转录，得到待测大豆的cDNA。
(3)以待测大豆的cDNA(浓度为1.67ng/μL)为模板，采用步骤1合成的用于检测大豆Glyma.17G231600基因表达量的引物对进行实时定量PCR扩增(以GmActin基因为内参)，并计算拷贝数。
实时定量PCR上样体系按照StarLighter试剂盒的说明书上样，反应体系为10μL，由5μL 2×qPCR Mix、0.2μL50×ROX Low、0.5μL上游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“F”的引物)、0.5μL下游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“R”的引物)、2.5μL待测大豆的cDNA和1.3μLddH2O组成。
(4)完成步骤(3)后，以循环数为横坐标，ΔRn为纵坐标，绘制扩增曲线。
采用引物对600进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的扩增曲线见图7：引物对600在指数扩增阶段的扩增曲线与引物对Actin在指数扩增阶段的扩增曲线基本平行。结果表明，引物对600与引物对Actin的扩增效率基本一致。
(5)完成步骤(3)后，绘制溶解曲线。
采用引物对600进行实时定量PCR扩增，4个待测大豆的溶解曲线见图8(CW-3和CW-6为CW的两个重复，CZG-3和CZG-6为CZG的两个重复，GW-3和GW-6为GW的两个重复，GZG-3和GZG-6为GZG的两个重复)：扩增产物的溶解曲线均呈现单峰分布，且主峰基本重叠。结果表明，引物对600的特异性好，扩增产物无杂带。
由此可见，引物对600的特异性好，扩增效率高，可以用于实时定量PCR扩增检测Glyma.17G231600基因表达量。
五、检测大豆ELF3同源基因表达量的试剂盒的制备
检测大豆ELF3同源基因表达量的试剂盒由引物对Actin、引物对200、引物对500、引物对900和引物对600组成。
实施例2、采用实施例1制备的的试剂盒检测大豆ELF3同源基因表达量
1、在营养土中种植中黄24种子，常规培养，得到单叶完全展开的中黄24幼苗。
2、完成步骤1后，取所述中黄24幼苗，每隔3h摘取单叶液氮冻透，-80℃保存，作为待测样本。共摘10天。
3、完成步骤2后，取所述待测样本，采用TRNzol试剂盒提取RNA并使用Nanodrop仪器测定RNA浓度，得到待测样本的RNA。
4、完成步骤3后，取所述待测样本的RNA，采用TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录，然后用双蒸水稀释，得到浓度为1.67ng/μL的待测样本的cDNA。
5、以待测样本的cDNA为模板进行实时定量PCR，使用QuantStudio 7Flex(ABI公司)定量分析待测样本中目的基因(Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因或Glyma.17G231600基因)的表达量，2-ΔCT方法分析目标基因的相对表达量(以GmActin基因为内参基因)。
鉴定GmActin基因的引物为Actin-F和Actin-R。
鉴定Glyma.04G050200基因的引物为200-F和200-R。
鉴定Glyma.08G197500基因的引物为500-F和500-R。
鉴定Glyma.14G091900基因的引物为900-F和900-R。
鉴定Glyma.17G231600基因的引物为600-F和600-R。
其中实时定量PCR上样体系按照StarLighter试剂盒的说明书上样，反应体系为10μL，由5μL 2×qPCR Mix、0.2μL50×ROX Low、0.5μL上游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“F”的引物)、0.5μL下游引物(浓度为10.0μM)(引物名称中含有“R”的引物)、2.5μL待测样本的cDNA和1.3μLddH2O组成。
不同时间点的中黄24叶片中Glyma.04G050200基因的相对表达量见图9(纵坐标为相对表达量)。
不同时间点的中黄24叶片中Glyma.08G197500基因的相对表达量见图10(纵坐标为相对表达量)。
不同时间点的中黄24叶片中Glyma.14G091900基因的相对表达量见图11(纵坐标为相对表达量)。
不同时间点的中黄24叶片中Glyma.17G231600基因的相对表达量见图12(纵坐标为相对表达量)。
结果如下：Glyma.04G050200基因在深夜时分表达量最高，之后开始下降，在中午时分达到最低点，而后表达逐渐升高；Glyma.08G197500基因在傍晚时分达到最低点，而后表达上升，直至凌晨时分达到表达最高峰，之后开始下降；Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因与Glyma.04G050200基因的表达趋势基本类似，但Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的的表达最低点为上午时分，更早一些。由此可见，以24h为周期，Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因均呈规律性的昼夜节律变化。
上述结果表明，实施例1制备的试剂盒可用于检测Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的表达量，通过基因表达量进而可以判断大豆的生长习性。
<110> 河南农业大学
<120> 一种检测大豆生物钟基因ELF3同源基因的表达量的试剂盒
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cggtggttct atcttggcat c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gtctttcgct tcaataaccc ta 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
caggatgggc agtccgatac 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aacactctct gttgattggc a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atccttgttt ccactcccac tc 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
tgaaatcatc ttgcgtgaat ttggt 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
cacgatactc ggactggagg 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
aaacacactc tgttgattgg ca 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
tggaggccca atacagaagg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
caaacacact ctgttgattg gca 23

Claims (10)

1.一种试剂盒，包括用于检测Glyma.04G050200基因表达量的引物对200、用于检测Glyma.08G197500基因表达量的引物对500、用于检测Glyma.14G091900基因表达量的引物对900和用于检测Glyma.17G231600基因表达量的引物对600；Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因均为大豆生物钟基因ELF3的同源基因，Genebank号依次为100793561、100820110、100818279和100788038；
所述引物对200由所述引物200-F和所述引物200-R组成；
所述引物200-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述引物200-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述引物对500由所述引物500-F和所述引物500-R组成；
所述引物500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述引物500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述引物对900由所述引物900-F和所述引物900-R组成；
所述引物900-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述引物900-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述引物对600由所述引物600-F和所述引物600-R组成；
所述引物600-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述引物600-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
所述试剂盒的用途为检测Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因中至少一个基因的表达量。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内参引物对；所述内参引物对的靶序列位于大豆的内参基因中。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述内参引物对为用于检测Glyma.18G290800基因表达量的引物对Actin；所述Glyma.18G290800基因的Genebank号为100792119；
所述引物对Actin由所述引物Actin-F和所述引物Actin-R组成；
所述引物Actin-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述引物Actin-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求1至3任一所述的试剂盒的制备方法，包括e1）或e2）：
e1）将“权利要求1中所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900和所述引物对600”和“权利要求2或3中所述内参引物对”中的各个引物分别单独包装的步骤；
e2）将权利要求1中所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900和所述引物对600中的各个引物分别单独包装的步骤。
5.权利要求1中所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900和所述引物对600在制备试剂盒中的应用；
所述试剂盒的用途为检测Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因中至少一个基因的表达量；
Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的Genebank号依次为100793561、100820110、100818279和100788038。
6.权利要求1中所述引物对200、所述引物对500、所述引物对900、所述引物对600和权利要求2或3中所述内参引物对在制备试剂盒中的应用；
所述试剂盒的用途为检测Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因中至少一个基因的表达量；
Glyma.04G050200基因、Glyma.08G197500基因、Glyma.14G091900基因和Glyma.17G231600基因的Genebank号依次为100793561、100820110、100818279和100788038。
7.一种检测Glyma.04G050200基因表达量的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用权利要求1中所述引物对200进行实时定量PCR的步骤；
Glyma.04G050200基因为大豆生物钟基因ELF3的同源基因，Genebank号为100793561。
8.一种检测Glyma.08G197500基因表达量的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用权利要求1中所述引物对500进行实时定量PCR的步骤；
Glyma.08G197500基因为大豆生物钟基因ELF3的同源基因，Genebank号为100820110。
9.一种检测Glyma.14G091900基因表达量的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用权利要求1中所述引物对900进行实时定量PCR的步骤；
Glyma.14G091900基因为大豆生物钟基因ELF3的同源基因，Genebank号为100818279。
10.一种检测Glyma.17G231600基因表达量的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用权利要求1中所述引物对600进行实时定量PCR的步骤；
Glyma.17G231600基因为大豆生物钟基因ELF3的同源基因，Genebank号为100788038。
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PREDICTED: Glycine max protein Early FLOWERING 3 (LOC100788038), mRNA;NCBI;《Genbank》;20180831;序列 *
PREDICTED: Glycine max protein Early FLOWERING 3a(ELF3A),transcript variant X1,mRNA;NCBI;《Genbank》;20180831;序列 *
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