CN116064576B - 紫外线胁迫下燕麦的内参基因及引物序列与内参基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了紫外线胁迫下燕麦的内参基因及引物序列与内参基因的应用，属于燕麦分子生物学技术领域，所述紫外线胁迫下的燕麦内参基因为Unigene21385，其核苷酸序列如序列1所示，所述基因在紫外线胁迫条件下表达稳定一致，可用于分析评价紫外线胁迫条件下相关功能基因表达的情况，为定量分析紫外胁迫下燕麦的基因表达提供参考基因。

Description

紫外线胁迫下燕麦的内参基因及引物序列与内参基因的应用

技术领域

本发明涉及燕麦分子生物学技术领域，尤其涉及紫外线胁迫下燕麦的内参基因及引物序列与内参基因的应用。

背景技术

燕麦(Avena sativa L.)为禾本科燕麦属一年生粮饲兼用作物，不仅产草量高、营养丰富、适口性好，而且具有耐寒、抗旱、适应性强的特点，现已广泛栽培于世界各国。种植燕麦草对解决北方寒区冬春草场牧草供应不足，发展草食家畜畜牧业具有重要意义。

大气臭氧层破坏，导致地表紫外线辐射增强已成为影响植物生长发育的主要非生物胁迫之一。高强度紫外辐射会破坏植物光合等生理生化过程，抑制植物细胞的伸长，使茎部缩短增粗，植物高度和生物量显著降低，严重时造成植物死亡。

内参基因指在生物各组织器官及发育阶段始终稳定表达的一类基因，也常被称作管家基因。理想的内参基因应在不同的组织和细胞中均能够稳定表达，并且不受环境或生物胁迫的影响，若内参基因选择不当，可能会对实验结果准确性造成影响甚至得到相反的结论。但是，目前尚不存在一个在所有组织器官或所有条件下均能够稳定表达的内参基因。因此，对于不同植物材料和组织需根据具体的实验要求来选择合适的内参基因，以确保实验结果可靠。

目前，燕麦干旱胁迫、盐胁迫和重金属胁迫下适宜的内参基因主要包括ADPR、EIF4A和UBC21等，但不同非生物胁迫下适宜的内参基因可能并不相同，因此，仍缺少紫外线胁迫下燕麦适宜的内参基因，选择在紫外线胁迫下能够稳定表达的内参基因对于开展燕麦基因功能研究具有重要意义。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种紫外线胁迫下燕麦的内参基因及引物序列与内参基因的应用，可以为定量分析紫外胁迫下燕麦的基因表达提供参考基因，并公开筛选的燕麦内参基因的应用。

本发明同过以下技术方案解决上述问题：

紫外线胁迫下燕麦的内参基因，所述紫外线胁迫下的燕麦内参基因为Unigene21385。

进一步，所述内参基因Unigene21385的基因序列如序列1所示：

序列1：

“ATGGTTTCTCAAATCAAAGCCGAAATGGAGAAAACTTTGCGATGGCTTGTCCCCATTGCAAATAACACGACTAAGGCACACCATGGCTTTGGTTGGGTTGGAGAGTGGGCAAATACAGGATCTGAACTGAACTGCAAGCTATCAGGACAGATGGACTTGACCCGAATTGAAACACTGTATCATGCTGAGAAGGACAAGACTGAAGCATATATCCTTGAGCTTGTTGTGTGGCTTCATCATCTCATCAGTAGATACAGAGCTGCTAATGGAGATGTAAGGTCTCCTATCAAATCTCCTGTCCGTTCACCAACACAGAAGGGCCGCACAATCAGGTTGCAGCAGCCAGACCAAGCGAATGGTTCATCGCCGATTCTCACACCAGAGGATCAGGATATGCTAAGCTGTGTCAAGTACAGGAAATTTGTCCCTGGGATAAGCAAAAGTCAAGAATTTGACACAAAGTCAAGGCACAACAAGCAGGATAGATTGTGCAAGAGCAATAGCCATTCTCCAACCAGTGGCAACAGGAAAGATTTGCTCTCAGTTAGGAGGTTCTCCCTACTTCCTGTCATAGACTTCGAGATTGATAGGACAAAAGCTTTGGATTTAATCGACAGGCTTGATGATCTCAAAACACAGTGA”。

本发明还公开了紫外线胁迫下燕麦内参基因的应用，所述内参基因为Unigene21385，所述基因在紫外线胁迫条件下表达稳定一致，可用于分析评价紫外线胁迫条件下相关功能基因表达的情况。

本发明还公开了紫外线胁迫下燕麦的内参基因的引物序列，所述引物是基于Unigene21385基因的编码区序列(CDs区)为参考设计的。

进一步，以Unigene21385的编码区序列为基础，按照实时荧光定量PCR引物的设计原则，所述引物的参数为：引物长度为20-24bp，引物的退火温度为55-65℃，引物的GC含量为45-60％，产物大小为100-150bp。

进一步，所述引物序列的正向引物基因序列如序列2所示：5’-TGGAGAGTGGGCAAATACAGG-3’，反向引物的基因序列如序列3所示：5’-AAGCCACACAACAAGCTCAAG-3’。

本发明还公开了紫外线胁迫下燕麦内参基因的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取紫外线胁迫下处理后的总RNA，并反转录后合成cDNA；

(2)选择8个候选内参基因，设计用于实时荧光定量PCR的引物；

(3)将cDNA作为模板对8个候选内参基因进行荧光定量PCR扩增反应；

(4)通过实时荧光定量PCR的结果对内参基因进行稳定性分析，筛选得到紫外线胁迫下的燕麦内参基因。

进一步，所述8个候选内参基因分别为CL16428、CL23527、CL923、Unigene16229、Unigene21385、CL14963、CL2601以及Unigene24500。

进一步，所述步骤(3)的扩增反应的反应体系为：

20μL体系：10μL 2×Taq MasterMix，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL cDNA和7μLddH₂O，运行程序如下：预变性：95℃180s；变性：95℃15s，退火：58℃15s，延伸：72℃35个循环；彻底延伸：75℃300s。

进一步，所述步骤(4)的实时荧光定量PCR分析的反应体系为：

10μL的反应体系：5μL 2×ChamQ SYBR Color qPCRMasterMix，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，0.5μLcDNA和3.7μL ddH₂O，运行程序如下：预变性：95℃180s；变性：95℃10s，退火：58℃30s，延伸：72℃(采集荧光信号)40个循环；溶解曲线：起始温度57℃，终止温度95℃，5min。

进一步，所述步骤(4)结果稳定性分析对操作是：采用geNorm、NormFinder和BestKeeper以候选内参基因在实时荧光定量PCR中产生的Ct值作为处理对象，共同评价内参基因表达水平的稳定性，再采用RefFinder软件对geNorm，NormFinder和BestKeeper分析结果进行综合评定，筛选得出紫外线胁迫下稳定的燕麦内参基因。

有益效果：

1、本发明构建了引物序列，筛选出了Unigene21385基因作为内参基因，构建了紫外胁迫条件下燕麦基因表达的RT-qPCR技术体系，为紫外线胁迫下功能基因的表达分析及胁迫机制的研究奠定基础，也有助于深入研究紫外线下燕麦基因之间的互作关系，为准确定量分析紫外胁迫下燕麦的基因表达提供参考基因。

2、本发明筛选得到了Unigene21385基因作为紫外线胁迫下燕麦的内参基因，有利于提高紫外胁迫条件下基因表达分析研究的稳定性和准确性，具有良好的实用价值和科研应用意义。

附图说明

图1：Unigene21385基因的标准曲线；

图2：Unigene21385基因在紫外胁迫不同时间点下燕麦根部的表达量检测胶图；

图3：Unigene21385在紫外胁迫不同时间点下燕麦茎部的表达量检测胶图；

图4：Unigene21385在紫外胁迫不同时间点下燕麦叶片中的表达量检测胶图；

图5：紫外胁迫下不同时间点燕麦PAL基因以Unigene21385、CL923、Unigene21385+CL923与Unigene24500为内参基因时表达量；

其中，图2-图4中的1-6分别代表处理时间0h、3h、6h、12h、24h、48h。

具体实施方式

以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明：

本发明提供了在紫外线胁迫条件下的燕麦内参基因，经筛选该内参基因为Unigene21385，其核苷酸序列如序列1所示：

“ATGGTTTCTCAAATCAAAGCCGAAATGGAGAAAACTTTGCGATGGCTTGTCCCCATTGCAAATAACACGACTAAGGCACACCATGGCTTTGGTTGGGTTGGAGAGTGGGCAAATACAGGATCTGAACTGAACTGCAAGCTATCAGGACAGATGGACTTGACCCGAATTGAAACACTGTATCATGCTGAGAAGGACAAGACTGAAGCATATATCCTTGAGCTTGTTGTGTGGCTTCATCATCTCATCAGTAGATACAGAGCTGCTAATGGAGATGTAAGGTCTCCTATCAAATCTCCTGTCCGTTCACCAACACAGAAGGGCCGCACAATCAGGTTGCAGCAGCCAGACCAAGCGAATGGTTCATCGCCGATTCTCACACCAGAGGATCAGGATATGCTAAGCTGTGTCAAGTACAGGAAATTTGTCCCTGGGATAAGCAAAAGTCAAGAATTTGACACAAAGTCAAGGCACAACAAGCAGGATAGATTGTGCAAGAGCAATAGCCATTCTCCAACCAGTGGCAACAGGAAAGATTTGCTCTCAGTTAGGAGGTTCTCCCTACTTCCTGTCATAGACTTCGAGATTGATAGGACAAAAGCTTTGGATTTAATCGACAGGCTTGATGATCTCAAAACACAGTGA”

本发明筛选出的内参基因具有极高的表达稳定性，在紫外线胁迫下该内参基因不会受外源性或内源性因素的影响仍能保持稳定表达。

实施例1：

1、实验材料准备：

燕麦品种为青引1号，将青引1号种子置于滤纸上萌发，取萌发一致的种子转移至加有蛭石和营养土(体积比1:1)的穴盘中培养，培养条件为：25℃、300μmol·m^-2·s^-1光培养16h，暗培养8h，待幼苗生长至二叶期和三叶期时，使用UV-B(500μW·cm^-2)进行胁迫，在0h、3h、6h、12h、24h、48h分别取燕麦幼苗的根、茎和叶样品，经液氮速冻后储存于-80℃冰箱，试验设三次生物学重复。

2、紫外线胁迫下燕麦内参基因的筛选：

(1)提取燕麦总RNA和反转录合成cDNA

按照植物RNA提取试剂盒Ultrapure RNAKit(cwbio)的说明书所示，分别提取燕麦不同时间点根、茎、叶的总RNA。将各部位的总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测RNA质量合格后，使用反转录试剂盒HiScript III1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(vazyme)将RNA反转录后合成cDNA，置于冰箱中保存备用。

(2)候选内参基因的选择和引物设计

在内参基因数据库ICG和相关文献中检索已测序的禾本科植物中的可用内参基因，并依据相应的基因编号在NCBI数据库中获取它们的序列。利用TBtools，将上述序列作为查询文件，在本实验室前期燕麦转录组数据中查找对应的同源基因序列，筛选得到CL16428、CL923、Unigene16229、Unigene21385、CL14963、CL2601、Unigene24500以及CL23527，8个内参基因及引物序列如表1所示，引物由睿博兴科生物技术有限公司(中国北京)合成。

表1候选内参基因及引物序列

(3)PCR扩增反应

将得到的cDNA作为模板，利用表1提供的8个候选内参基因的引物进行荧光定量PCR扩增反应，20μL体系：10μL 2×Taq MasterMix，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL cDNA和7μL ddH₂O，扩增运行程序如下：预变性：95℃180s；变性：95℃15s，退火：58℃15s，延伸：72℃35个循环；彻底延伸：75℃300s。每个样品三次技术重复，用于检测引物质量。

(4)实时荧光定量PCR分析：

将燕麦的cDNA稀释10⁰、10^-1、10^-2和10^-3倍，将稀释后的cDNA为模板进行荧光定量PCR分析，引物为表1中的引物，分析cDNA为模板质量浓度(对数值)和Ct值的线性关系，获得相关系数，根据结果计算引物的扩增效率(E)和相关系数(R²)并绘制标准曲线，实时荧光定量PCR的结果采用2^－△△CT法来计算得到的，得到结果如表2所示：

表2

Unigene21385的结果如图1所示，其中，E(％)＝(10^-1/斜率-1)×100。根据图1的结果可知，Unigene21385相关系数R²为0.9998，扩增效率(E)为92.61，以上结果表明，Unigene21385基因序列设计的qRT-PCR引物特异性好，扩增效率高，可用于基因的表达稳定性分析。

CL16428、CL923、Unigene16229、Unigene21385、CL14963、CL2601、Unigene24500以及CL23527作为对照基因，分析Unigene21385的稳定性。将cDNA稀释至浓度约为200ng/μL，用于比较不同引物在不同组织中的稳定性，每个生物学重复做三次技术重复。

将稀释后的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR分析，引物为表1中的引物，10μL的反应体系：5μL 2×ChamQ SYBR Color qPCRMasterMix，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，0.5μLcDNA和3.7μL ddH₂O，运行程序如下：预变性：95℃180s；变性：95℃10s，退火：58℃30s，延伸：72℃(采集荧光信号)40个循环；溶解曲线：起始温度57℃，终止温度95℃，5min。

稳定性结果分析：以候选内参基因在实时荧光定量PCR中产生的Ct值(范围18-35)作为处理对象，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价内参基因表达水平的稳定性。由于三种软件计算方法和分析结果有所差异，因此采用RefFinder软件对geNorm，NormFinder和BestKeeper分析结果进行综合评定得到的结果如图3-5所示，RefFinder综合性分析结果如表6所示：

表3 GeNorm分析中稳定性分析(M值)

基因名称	M值	排名
			Unigene21385	0.92	1
CL923	0.95	2
			CL23527	0.98	3
CL14963	0.98	4
			CL16428	0.99	5
Unigene16229	1.11	6
			CL2601	1.22	7
Unigene24500	2.78	8

表4 NormFinder稳定性排名

表5 BestKeeper稳定性排名

基因名称	稳定值	相关系数r	标准偏差(SD)	变异系数(CV)	排名
						CL16428	0.39	0.70	0.39	1.21	1
CL14963	0.51	0.78	0.50	1.89	2
						CL23527	0.58	0.74	0.58	1.90	3
CL923	0.58	0.87	0.58	2.47	4
						Unigene21385	0.59	0.76	0.59	2.01	5
Unigene16229	0.83	0.63	0.83	2.47	6
						CL2601	1.09	0.81	1.09	4.44	7
Unigene24500	2.02	0.69	2.02	7.86	8

表6 RefFinder综合性分析候选内参基因的表达稳定性

基于表6的结果可知，通过RefFinder软件对geNorm，NormFinder和BestKeeper分析结果进行综合评定，候选内参基因中Unigene21385的稳定性最高，在紫外线胁迫下该内参基因不会受外源性或内源性因素的影响，仍能保持稳定表达。

实施例2：Unigene21385的引物设计

在转录组数据中得到燕麦基因编码区(CDs区)序列如下：

“ATGGTTTCTCAAATCAAAGCCGAAATGGAGAAAACTTTGCGATGGCTTGTCCCCATTGCAAATAACACGACTAAGGCACACCATGGCTTTGGTTGGGTTGGAGAGTGGGCAAATACAGGATCTGAACTGAACTGCAAGCTATCAGGACAGATGGACTTGACCCGAATTGAAACACTGTATCATGCTGAGAAGGACAAGACTGAAGCATATATCCTTGAGCTTGTTGTGTGGCTTCATCATCTCATCAGTAGATACAGAGCTGCTAATGGAGATGTAAGGTCTCCTATCAAATCTCCTGTCCGTTCACCAACACAGAAGGGCCGCACAATCAGGTTGCAGCAGCCAGACCAAGCGAATGGTTCATCGCCGATTCTCACACCAGAGGATCAGGATATGCTAAGCTGTGTCAAGTACAGGAAATTTGTCCCTGGGATAAGCAAAAGTCAAGAATTTGACACAAAGTCAAGGCACAACAAGCAGGATAGATTGTGCAAGAGCAATAGCCATTCTCCAACCAGTGGCAACAGGAAAGATTTGCTCTCAGTTAGGAGGTTCTCCCTACTTCCTGTCATAGACTTCGAGATTGATAGGACAAAAGCTTTGGATTTAATCGACAGGCTTGATGATCTCAAAACACAGTGA”

使用PrimerPremier 5.0设计用于实时荧光定量PCR的引物，设计时Unigene21385引物参数如下：引物长度为20-24bp，引物的退火温度为55-65℃，引物的GC含量为45-60％，产物大小为100-150bp，最后得到的引物核苷酸序列如序列2-3所示：

序列2：正向引物：5’-TGGAGAGTGGGCAAATACAGG-3’；

序列3：反向引物：5’-AAGCCACACAACAAGCTCAAG-3’；

进行如实施例1的方法步骤进行荧光定量PCR扩增反应后。扩增产物基因序列如下：

“TGGGCAAATACAGGATCTGAACTGAACTGCAAGCTATCAGGACAGATGGACTTGACCCGAATTGAAACACTGTATCATGCTGAGAAGGACAAGACTGAAGCATATATCCTTGAGCTTGTTGTGTGGCTT”。

实施例3：Unigene21385作为紫外线胁迫下的燕麦内参基因稳定性验证将筛选出的燕麦特异性内参基因Unigene21385在紫外线(500μW·cm^-2)进行胁迫，在0h、3h、6h、12h、24h、48h将幼苗的根、茎和叶取下进行基因表达量实时荧光定量PCR分析，得到了不同时间点、不同组织部位中能获得相似强度的荧光信号，特异性内参基因Unigene21385在紫外胁迫下植株根茎叶三个组织部位表达量情况如图2至图4，根据结果表明燕麦在紫外胁迫下植株根茎叶三个组织部位都含有特异性内参基因Unigene21385，且该基因具有不同组织部位非特异性，说明该基因具有种内稳定性、拷贝数恒定，可以作为燕麦基因定量PCR检测的内参基因。

为了验证内参基因筛选结果的可靠性，本发明分别以稳定性排名前两位的Unigene21385与CL923，以及最不稳定的Unigene24500为内参基因，分析苯丙氨酸解氨酶(PhenylalanineAmmonia-Lyase，PAL)基因在紫外线处理后不同时间点的相对表达量，得到的结果如图5所示。其中验证基因PAL的引物序列为：

正向引物：5’-GCAACTTCCAGGGCACCC-3’，

反向引物：5’-CTCCGAGAACTGAGCGAACAT-3’，

分析图5结果可知，在以Unigene21385、CL923以及Unigene21385+CL923做为归一化对照时，紫外胁迫下燕麦叶中PAL基因的表达量随着胁迫时间的增加，PAL的表达量呈现出明显的一致性变化趋势，然而以最不稳定基因Unigene24500进行归一化数据时，PAL的表达量变化则很小，呈现出与稳定内参基因不同的变化趋势，由此说明RefFinder软件分析的内参基因结果可靠，Unigene21385基因稳定性较高。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (2)

1.紫外线胁迫下燕麦的内参基因，其特征在于，所述紫外线胁迫下的燕麦内参基因为Unigene21385，其核苷酸序列如序列1所示。

2.紫外线胁迫下燕麦内参基因的应用，其特征在于，所述内参基因为Unigene21385，其核苷酸序列如序列1所示，所述基因在紫外线胁迫条件下表达稳定一致，可用于分析评价紫外线胁迫条件下相关功能基因表达的情况。