CN115873982B - 用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因及其引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因和扩增所述内参基因的专用引物对。本发明还公开了所述内参基因或专用引物对在芍药不同发育阶段茎秆的实时荧光定量PCR中的应用。本发明还公开了一种实时荧光定量PCR检测试剂盒所述检测试剂盒包括引物对。本发明还公开了所述专用引物对或实时荧光定量PCR检测试剂盒在筛选芍药茎秆中稳定表达的内参基因中和/或在验证芍药茎秆中的内参基因表达稳定性中的应用。本发明筛选了10个内参基因，并通过综合分析筛选到最优用于芍药茎秆中基因表达的内参基因是微管蛋白γ‑TUB基因和微管蛋白α‑TUB基因，有利于提高芍药茎秆中基因表达水平研究的稳定性和可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物内参基因及其引物，尤其涉及一种用于芍药茎秆中基因表达的内参基因及其扩增引物和应用，属于植物生物技术领域。
背景技术
基因的表达模式可以为探索其生物学功能提供线索。目标基因的表达水平通常采用实时荧光定量PCR技术进行检测，而内参基因是其中必不可少的，可以标准化实验结果，减少实验误差(Bustin SA,et al.Quantitative real-time RT-PCR–aperspective.Journal of Molecular Endocrinology,2015,34:597-601)。许多研究证实，植物中缺乏通用内参基因，它们在不同的发育阶段和环境条件下并不能够完全稳定表达(Ma L,et al.Screening and verification of reference genes for analysis ofgene expression in winter rapeseed(Brassica rapa L.)under abiotic stress.PLoSOne,2020,15:e0236577；Yang AP,et al.Screening potential reference genes inTutaabsolutawith real-time quantitative PCR analysis under different experimentalconditions.Genes,2021,12:1253)。因此，有必要根据实验具体要求筛选出在特定条件下相对稳定表达的基因作为内参基因。
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是芍药科芍药属的一种多年生宿根草本花卉，它不仅花朵硕大，而且色彩鲜艳、花型丰富，是目前市场上广受欢迎的鲜切花。在芍药切花标准中，花茎挺直程度是一个十分重要的指标(刘燕,等.芍药鲜切花质量等级.中华人民共和国林业行业标准.2008)。为了满足芍药切花对花茎品质的要求，开展与花茎强度相关基因表达水平研究将为进一步调控芍药花茎挺直程度奠定基础。因此，筛选能够在芍药茎秆发育中稳定表达的内参基因，对于实时荧光定量PCR检测结果分析的准确性起着关键作用。而前人只在芍药不同发育阶段的叶片以及盛花期不同组织中开展过内参基因筛选(ZhaoDQ,et al.Actin as an alternative internal control gene for gene expressionanalysis in herbaceous peony(Paeonia lactiflora Pall.).African Journal ofAgricultural Research,2012,7:2153-2159)，而专门用于芍药茎秆中基因表达的内参基因一直未见报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于芍药茎秆中基因表达的内参基因及其扩增引物和应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因，所述用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因包括微管蛋白γ-TUB基因、微管蛋白α-TUB基因、葡萄糖醛酸苷酶β-GUS基因、真核生物翻译起始因子eIF-2B基因、泛素连接酶UBI-E3基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD(P)基因、RNA聚合酶IIRNA polⅡ基因、蛋白磷酸酶PP D1/2基因或组蛋白His-H3基因中的一种或几种；所述微管蛋白γ-TUB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述微管蛋白α-TUB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述葡萄糖醛酸苷酶β-GUS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述真核生物翻译起始因子eIF-2B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述泛素连接酶UBI-E3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD(P)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述RNA聚合酶IIRNA polⅡ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述蛋白磷酸酶PPD1/2基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述组蛋白His-H3基因的核苷酸序列如SEQID NO.10所示。
其中，所述用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因包括微管蛋白γ-TUB基因和微管蛋白α-TUB基因。
本发明还提供扩增所述芍药茎秆发育中基因表达的内参基因的专用引物对，所述微管蛋白γ-TUB基因的引物对序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述微管蛋白α-TUB基因的引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；所述葡萄糖醛酸苷酶β-GUS基因的引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述真核生物翻译起始因子eIF-2B基因的引物序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；所述泛素连接酶UBI-E3基因的引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示；所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD(P)基因的引物序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；所述RNA聚合酶IIRNA polⅡ基因的引物序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示；所述蛋白磷酸酶PP D1/2基因的引物序列如SEQ IDNO.27和SEQ ID NO.28所示；所述组蛋白His-H3基因的引物序列如SEQ ID NO.29和SEQ IDNO.30所示。
本发明还提供所述的内参基因在芍药不同发育阶段茎秆的实时荧光定量PCR中的应用。
本发明还提供所述的专用引物对在芍药不同发育阶段茎秆的实时荧光定量PCR检测中的应用。
其中，所述不同发育阶段包括现蕾期、硬蕾期、露色期、松瓣期和盛花期。
本发明还提供一种实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的引物对。
其中，所述试剂盒还包括荧光定量PCR所用的其他试剂。
本发明还提供所述的专用引物对或所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒在筛选芍药茎秆中稳定表达的内参基因和/或在验证芍药茎秆中的内参基因表达稳定性中的应用。
其中，所述稳定性表达的内参基因包括γ-TUB和α-TUB。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
本发明筛选了10个用于芍药茎秆中基因表达谱中稳定表达的候选内参基因，并通过综合分析筛选到最优用于芍药茎秆中基因表达的内参基因是微管蛋白γ-TUB基因和微管蛋白α-TUB基因，有利于提高芍药茎秆中基因表达水平研究的稳定性和可靠性。
附图说明
图1是本发明10个候选内参基因实时荧光定量PCR的扩增曲线；
图2是本发明10个候选内参基因实时荧光定量PCR的溶解曲线；
图3是本发明10个候选内参基因实时荧光定量PCR的标准曲线；
图4是本发明10个候选内参基因在茎秆中基因表达的Ct值；
图5是GeNorm软件对10个候选内参基因表达稳定值(M)的排序；
图6是GeNorm软件对10个候选内参基因表达最佳内参基因数量(V值)；
图7是NormFinder软件对10个候选内参基因表达稳定值的排序；
图8是BestKeeper软件对10个候选内参基因表达稳定值的排序；
图9是RefFinder软件对10个候选内参基因表达稳定值的综合排序；
图10是综合4个分析软件对10个候选内参基因表达稳定值的综合排序；
图11是对10个候选内参因表达稳定性的验证。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：用于芍药茎秆中基因表达的候选内参基因筛选
基于种植于扬州大学国家芍药种质资源库中芍药茎秆直立品种‘红峰’和茎秆弯曲品种‘夕霞映雪’不同发育阶段茎秆的RNA-seq数据库，获得113,974个Unigene的RPKM值，找到10个稳定表达的Unigene作为候选内参基因(表1)。
表1 10个Unigene的RPKM值
针对以上找到的10个在茎秆中稳定表达的候选内参基因，采用Premier 5.0软件设计并合成用于实时荧光定量PCR检测的引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察PCR产物的条带，检测产物特异性。选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，筛选后得到的引物序列如表2所示。
表2 10个在茎秆中稳定表达的候选内参基因扩增引物序列
实施例2：候选内参基因的表达稳定性分析
用于芍药茎秆中基因表达的内参基因在芍药茎秆中的稳定性分析：以芍药主栽品种‘红艳争辉’现蕾期(S1)、硬蕾期(S2)、露色期(S3)、松瓣期(S4)和盛花期(S5)花下12cm的茎秆为植物材料，采后使用液氮速冻，并保存在-80℃下。
样品使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒进行RNA提取，并使用核酸蛋白仪检测RNA浓度和OD值，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；采用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme)试剂盒进行cDNA的合成。以获得的cDNA产物作为PCR扩增的模板，内参基因采用表2的引物组合，试剂为
SYBR qPCR SuperMix Plus(Novoprotein)试剂盒。
分别对10个候选基因进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR反应总体系为10μL，包含5μL的2×
SYBR qPCR SuperMix，正向引物/反向引物各0.4μL，cDNA模板0.8μL，灭菌蒸馏水3.4μL；
反应程序95℃预变性30s，接下来95℃～5s、55℃～30s和72℃～30s共40个循环；循环结束后绘制溶解曲线：65℃加热至95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每次反应要重复三次；在PCR完成后，获得相应的域值循环数，即Ct值(图4)。
其中，微管蛋白γ-TUB基因(γ-TUB)、微管蛋白α-TUB基因(α-TUB)、葡萄糖醛酸苷酶β-GUS基因(β-GUS)、真核生物翻译起始因子eIF-2B基因(eIF-2B)、泛素连接酶UBI-E3基因(UBI-E3)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因(GAPDH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD(P)基因(NAD(P))、RNA聚合酶IIRNA polⅡ基因(IIRNA polⅡ)、蛋白磷酸酶PP D1/2基因(PPD1/2)、组蛋白His-H3基因(His-H3)。通过对芍药10个候选参考基因的qRT-PCR数据进行分析，发现3次重复的扩增曲线相对一致(图1)；溶解曲线3次重复溶解温度具有一致性，均出现单一特异峰，均为特异性扩增，符合qRT-PCR分析的引物标准(图2)；当相关系数R2≥0.99时标准曲线的线性关系较好，表明10个候选参考基因的线性整体上比较符合要求(图3)。
GeNorm软件分析：通过计算出每个内参基因表达稳定性的M值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M值越小则内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差；软件默认值为1.5，M值小于1.5的基因可以作为内参基因使用，且M值越低表示基因越稳定。利用GeNorm分析了10个候选内参基因在芍药不同发育阶段茎秆中基因表达稳定性的M值，结果显示10个候选内参基因的M值最小的为γ-TUB(图5)；按M值对其稳定性进行排序，依次为γ-TUB>β-GUS>RNA polⅡ>α-TUB>GAPDH>PP D1/2>UBI-E3>NAD(P)>eIF-2B>His-H3。此外，GeNorm软件分析后推荐的最佳内参基因数量为2个(图6)。
NormFinder软件分析：通过获得每个内参基因表达稳定性S值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为S值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。利用NormFinder分析了10个候选内参基因在芍药不同发育阶段茎秆中基因表达稳定性S值，结果显示10个候选内参基因的S值在三次评价中最小的为γ-TUB；按S值对其稳定性进行排序，依次为γ-TUB>α-TUB>GAPDH>β-GUS>RNA polⅡ>eIF-2B>PP D1/2>UBI-E3>NAD(P)>His-H3(图7)。
BestKeeper软件分析：通过分析和评估每个内参基因表达的标准差(SD)值和变异系数(CV)值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为SD值和CV值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。利用BestKeeper分析了10个候选参考基因在芍药不同发育阶段茎秆中基因表达的SD值和CV值，结果显示10个候选内参基因按SD及CV值对其稳定性进行排序，依次为α-TUB>UBI-E3/γ-TUB/eIF-2B>β-GUS/RNA polⅡ>GAPDH>NAD(P)>PP D1/2>His-H3(图8)。
RefFinder软件分析：通过综合GeNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta CT分析结果来筛选出稳定性较好的内参基因。按综合评价对10个候选内参基因在芍药不同发育阶段茎秆中基因表达的稳定性进行排序，依次为γ-TUB>α-TUB>β-GUS>eIF-2B>GAPDH>RNApol II>UBI-E3>PP D1/2>NAD(P)>His-H3(图9)。
候选内参基因的表达稳定性综合评价：综合考虑GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件分析结果，对10个候选内参基因在芍药不同发育阶段茎秆中基因表达的稳定性进行排序，依次为γ-TUB>α-TUB>β-GUS>GAPDH/RNA polⅡ>eIF-2B>UBI-E3>PP D1/2>NAD(P)>His-H3(图10)，表明γ-TUB和α-TUB是芍药茎秆中基因表达最稳定的内参基因。
候选内参基因的表达稳定性验证：为进一步验证评价结果的可靠性，利用已明确在芍药不同发育阶段茎秆中表达模式的PlCOMT1基因(MK395538)进行候选内参基因的表达稳定性验证。结果表明，当以γ-TUB和/或α-TUB作为内参基因时，PlCOMT1基因在芍药茎秆不同发育阶段中的表达模式与报道一致(图11)。表明筛选出的γ-TUB和α-TUB是用于芍药茎秆中基因表达的最稳定的内参基因组合，可以用于芍药茎秆中基因表达水平的检测。
Claims (9)
1.用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因，其特征在于，所述用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因为微管蛋白γ-TUB基因或微管蛋白α-TUB基因或微管蛋白γ-TUB基因和微管蛋白α-TUB基因的组合；所述微管蛋白γ-TUB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述微管蛋白α-TUB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.扩增如权利要求1所述的芍药茎秆发育中基因表达的内参基因的专用引物对，其特征在于，所述微管蛋白γ-TUB基因的引物对序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述微管蛋白α-TUB基因的引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
3.权利要求1所述的内参基因在芍药不同发育阶段茎秆的实时荧光定量PCR中的应用。
4.权利要求2所述的专用引物对在芍药不同发育阶段茎秆的实时荧光定量PCR检测中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述不同发育阶段包括现蕾期、硬蕾期、露色期、松瓣期和盛花期。
6.一种实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求2所述的专用引物对。
7.根据权利要求6所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光定量PCR所用的其他试剂。
8.权利要求2所述的专用引物对或权利要求6所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒在筛选芍药茎秆中稳定表达的内参基因和/或在验证芍药茎秆中的内参基因表达稳定性中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述稳定性表达的内参基因为微管蛋白γ-TUB基因或微管蛋白α-TUB基因或微管蛋白γ-TUB基因和微管蛋白α-TUB基因的组合；所述微管蛋白γ-TUB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述微管蛋白α-TUB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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