CN113174445B - 分析慈姑不同组织的内参基因及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及分析慈姑不同组织的内参基因及其筛选方法和应用，本发明根据RNA‑Seq测序数据分析，利用软件评估并分析各个候选内参基因在慈姑不同组织中的表达稳定性，最终筛选出比常用的管家基因更为稳定的内参基因C36425，该内参基因能在慈姑根、茎、叶、花、匍匐茎和球茎中均能稳定表达，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，为后期利用q RT‑PCR探索慈姑生长发育相关功能基因表达研究提供了科学依据。

Description

分析慈姑不同组织的内参基因及其筛选方法和应用
【技术领域】
本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及分析慈姑不同组织的内参基因及其筛选方法和应用。
【背景技术】
慈姑(Sagittaria sagittifolia L.)是泽泻科(Alismataceae)慈姑属宿根性水生草本，原产中国。欧洲多用于观赏，中国、日本、印度和朝鲜用于蔬菜。以球茎作蔬菜食用，为冬春蔬菜供应淡季的主要水生蔬菜之一。慈姑含有很高的营养和药用价值，可药食兼用，具有很大的应用市场和开发潜力。种植慈姑已成为农民增收经济来源，脱贫致富的有效途径之一。
基因的表达分析被广泛应用于生物科学领域研究。RT-qPCR由于灵敏度高、稳定性好，是目前基因表达分析常用的方法之一。在转录水平进行基因表达分析，选择最佳内参基因是实现荧光定量PCR结果准确性的必要前提，对于探讨基因的表达情况、基因功能研究等方面起到至关重要的作用。内参基因稳定性高，才能准确地对目的基因达进行校正。然而内参基因的稳定性是相对的，在不同的细胞类型、试验环境中，相同的内参基因表达却不同。
近年来，植物内参基因的筛选已有许多报道，而对慈姑在不同试验中内参基因的筛选的报道还较少，也没有关于慈姑不同组织中内参基因的报道。利用实时荧光定量方法探究慈姑不同组织下功能基因的差异表达分析，就需要稳定可靠的内参因。因此，有必要对慈姑不同组织部位中内参基因进行筛选。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要挖掘慈菇的内参基因，可以很好针对对慈姑不同组织部位中内参基因进行筛选。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
慈姑内参基因C36425，所述内参基因C36425的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明还包括检测所述慈姑内参基因C36425的引物对，所述引物对其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
本发明还包括所述的慈姑内参基因C36425在慈菇不同组织进行荧光定量表达分析的应用。
进一步的，所述不同组织为慈姑的根、茎、叶片、匍匐茎、花和球茎。
进一步的，所述荧光定量表达分析优选的引物对其上游序列如序列表SEQ IDNO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述荧光定量表达分析的PCR反应体系为：2X SYBR Green MasterMix10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、ddH2O 7.2μl、cDNA2μl；反应程序为：预变性95℃，5min；95℃变性10s，55℃退火10s，总共45个循环；采集荧光信号。
本发明的慈姑内参基因C36425，筛选方法为：1、采集慈姑的根、茎、叶片、匍匐茎、花和球茎为材料，提取慈姑不同组织的RNA；2、合成相应的慈姑球茎cDNA；3、根据不同基因设计不同引物并在荧光定量PCR仪上进行反应，绘制溶解曲线，进行稳定性分析，获得稳定性好、表达效果好的内参基因。
本发明具有如下有益效果：
本发明根据RNA-Seq测序数据分析，利用软件评估并分析各个候选内参基因在慈姑不同组织中的表达稳定性，最终筛选出比常用的管家基因更为稳定的内参基因C36425，该内参基因能在慈姑根、茎、叶、花、匍匐茎和球茎中均能稳定表达，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，为后期利用qRT-PCR探索慈姑生长发育相关功能基因表达研究提供了科学依据。
【附图说明】
图1是本发明实施例各个样品的RNA凝胶电泳图，图中1、根；2、茎；3、叶片；4、匍匐茎；5、花；6、球茎；
图2为C21425基因的qPCR溶解曲线图；
图3为C36745基因的qPCR溶解曲线图；
图4为C36425基因的qPCR溶解曲线图；
图5为C72145基因的qPCR溶解曲线图；
图6为C87309基因的qPCR溶解曲线图；
图7为C64246基因的qPCR溶解曲线图；
图8为内参基因在慈姑生长发育不同组织中表达情况图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
本实施例为内参基因C36425的获得，其通过如下方法得到：
一、本实施例的试验材料
材料为慈姑主栽品种“桂慈1号”，于2019年9-12月期间，上午9:00，先后采集慈姑的根、茎、叶片、匍匐茎、花和球茎，共6份材料,每份材料3次生物学重复。不同组织液氮速冻后，于-80℃冰箱存储保存备用。
二、总RNA提取、检测与c DNA合成
每份样品称取0.1g，液氮研磨，利用TRNzol Universal提取不同样品中RNA。NanoDrop2000C超微量紫外分光光度计和1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度、浓度以及完整性。以慈姑不同组织样品总RNA为模板，用试剂盒
Prime Script II(Ta Ka Ra)合成cDNA第一链。用紫外分光光度计检测cDNA纯度，获得高质量cDNA后，-20℃冰箱冻存备用。
三、内参基因的选择与特异性引物的设计
(1)通过详细比较慈姑二代、三代转录组结果，参考其他植物常用内参基因，选取注释为18S r RNA、EF1α、ACT、GAPDH、TUB和UBQ共6个基因作为候选内参基因。
(2)在候选基因中，通过慈姑转录组数据查找管家基因的同源基因，选择6个较高表达基因(C21425、C36745、C36425、C72145、C87309和C64246)作为内参基因(基因表达量见表1)。使用Primer5软件对筛选的6个候选基因进行引物设计(见表2)。
表1 5个较高表达基因份表达量
不同组织 根 茎 叶片 匍匐茎 花 球茎
C21425 945 765 774 936 1062 960
C36745 656 89 721 598 531 533
C36425 508 446 458 463 497 443
C72145 1046 1228 1480 1361 1178 1058
C87309 824 778 752 815 847 708
C64246 1553 1060 1166 1365 1421 1279
从表1可见，上述几个基因在慈菇的不同组织都表达出了较高的表达量。
四、内参基因的qPCR：
将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。定量PCR实验，采用的仪器为：AceQ_qPCR_SYBR Green_Master_Mix定量PCR仪：德国AnalytikJena qTOWERE2.2。
所述荧光定量表达分析的PCR反应体系为：2X SYBR Green Master Mix 10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、ddH2O 7.2μl、cDNA 2μl；
反应程序为：预变性95℃，5min；95℃变性10s，55℃退火10s，总共45个循环；采集荧光信号。
上述PCR反应过程中各基因所用到的引物如表2所示：
表2
Figure BDA0003030804860000041
将表2的引物针对性分别放入上述的PCR反应体系，按照PCR反应程序放入96孔板放在AnalytikJena qTOWERE2.2荧光定量PCR仪中进行反应，反应结束后进行内参基因表达的稳定性分析。
五、内参基因表达稳定性分析：
通过Excel 2013软件对慈姑不同组织q RT-PCR数据整理和汇总。利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件对6个内参基因稳定性评价，评估6个内参基因在慈姑不同组织中的表达稳定性。
六、结果与分析
总RNA样品与引物特异性检测
经1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。结果如图1所示，图1为各个样品的RNA凝胶电泳图；图中从左到右依次为1、根；2、茎；3、叶片；4、匍匐茎；5、花；6、球茎；。从图可见，慈姑根、茎、叶片、匍匐茎、花和球茎的RNA条带单一且较清晰明亮RNA条带，总RNA完整性好，符合试验要求。可用于后续q RT-PCR试验分析。
图2为C21425基因的qPCR溶解曲线图、图3为C36745基因的qPCR溶解曲线图、图4为C36425基因的qPCR溶解曲线图、图5为C72145基因的qPCR溶解曲线图、图6为C87309基因的qPCR溶解曲线图、图7为C64246基因的qPCR溶解曲线图。
从图2-图7可见，上述6个候选内参基因均有明显的单一溶解峰，无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，检测引物均具有较好的特异性，可用于慈姑荧光定量PCR的内参引物试验。qPCR结果表明，所选择的6个候选内参基因的Ct值范围为19.68～34.26，其中C87309的Ct值最低，平均值为19.26，C36745的Ct值最高，其平均值为33.41，表明各候选内参在不同样品中的表达量存在差异。
荧光定量PCR仪进行Ct计算，通过ge Norm软件评估平均稳定指数M值、NormFinder及Best Keepeer软件比对各个候选内参基因的标准差(SD)、变异系数(CV)对候选内参基因的稳定性进行综合分析。结果如表3、表4所示：
表3 ge Norm软件与Normfinder软件候选内参基因稳定性评价
Figure BDA0003030804860000051
表4 Best Keeper分析候选内参基因的表达稳定性
C21425 C36745 C36425 C72145 C87309 C64246
平均值ct 28.64 33.64 25.79 33.12 22.56 28.04
Max 29.65 34.17 26.78 34.69 24.51 25.30
min 27.36 32.14 24.33 31.60 19.80 29.84
SD 0.768 0.893 0.748 1.14 1.61 1.593
CV(％) 2.68 2.9 2.65 3.44 7.13 5.6
r 0.595 0.573 0.930 0.956 0.406 0.697
从表3-表4可知，3款软件稳定性排序一致，综合几种软件计算结果，稳定性由高到低排序分别为C36425>C21425>C36745>C72145>C64246>C87309，C36425和C21425稳定性最好，C36425表达量显著高于C21425，C36425可作为慈姑RT-q PCR分析首选内参基因。
实施例2：
根据实施例1筛选出来的稳定性最佳的基因C36425作为内参基因，验证内参基因表达稳定性，保证得出真实可靠的定量数据。选择慈姑不同组织部位(根、茎、叶片、匍匐茎、花和球茎)，RT-qPCR分析内参基因在慈姑生长发育的6个组织中表达情况，具体如下：
分别提取慈姑不同组织部位(根、茎、叶片、匍匐茎、花和球茎)的RNA并通过逆转录为cDNA，并将cDNA为作为定量PCR的模板，以C36425基因为内参基因，上游引物为：5’-GTCGTCCGCAAGGACCGCT-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物为：5’-GCAGATGGAAGACCGAGAA-3’(SEQID NO.3)在实时荧光定量PCR检测仪上进行荧光定量反应，反应的PCR反应体系为：2X SYBRGreen Master Mix 10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM上游引物0.4μl、ddH2O 7.2μl、cDNA 2μl；PCR反应程序为95℃预变性5min；预变性95℃，5min；95℃变性10s，55℃退火10s，总共45个循环；采集荧光信号。
反应结束后使用2-ΔΔCT法所有的数据均表示为平均值±标准偏差。实时荧光定量PCR数据分析用SPSS 17.0和Microsoft Office Excel 2007进行统计分析，采用SPSS17.0软件方差分析，采用Excel 2010软件制图。
结果如图8所示，从图8可见，内参基因C36425在慈姑球茎发育不同组织部位均能稳定的表达。
综上所述，基因C36425可在慈姑球茎发育不同组织部位：根、茎、叶片、匍匐茎、花和球茎均能进行稳定表达，能做为慈姑球茎发育不同组织部位荧光定量的内参基因，能为今后对慈菇重要功能性状基因的研究奠定基础。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 分析慈姑不同组织的内参基因及其筛选方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggcgctcc tccgtccttt cacgtttttt ttgtatatat caattttgta aactagatca 60
ccaaaaactt ccccctctcc ctctcccctt cccccacctc tcctcctcct cttcttcctc 120
ttccacaaac atcacccccc accaccccac cccgcaacca tgagagagat cctccacatc 180
caggccggcc agtgcgggaa ccagatcggc ggcaagttct gggaggttgt ctgcgacgag 240
cacggcatcg actccaaagg gaactacgtc ggagactcca acctccagct cgagagggtc 300
aatgtgtact acaacgaggc cagcggaggg aggtacgtgc ccagggctgt cctcatggac 360
cttgagcctg ggaccatgga tgcactcagg accggaccgt atggccagat cttccgcccg 420
gacaacttcg tgttcggaca gaacggggca gggaataact gggccaaagg gcattacacc 480
gagggagcag agctgatcga tgccgtgcta gatgtggtca ggaaggaggc tgagaactgc 540
gattgcctgc aaggtatggt ttttttctct tttttctttt tagggttctc tctctctctc 600
tcgacatttt tctctcgatc tcgatattat ggtgttggtt tgttttgagt tttggctttg 660
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cacgttattt gggcgttgtg atgagctgtc gccatttatt tataaatcaa gcgccggttt 1260
ttttttttct tcaccccttc gaggttggtg ttggtgaatc cggtaatgtc gtaccaaata 1320
gattctgtca aaaatctgga ttcttggaga ataccacaca tcttatgggt tatttttcaa 1380
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gtcatatgaa aagccgtttt gtggtagtac atagtacatt tttctgatat ataaataaat 1500
ccaagaggat taggagcgcc atctagtgtc cctactaaaa acggtgccta acaaacctgt 1560
cttggaaccc gattccaagt cgctggacgt tccaacacca tgtggattct ggatctagaa 1620
accaggaccg gattggttgc atagaatgta atgcgtcttt gaatttatca aattcataag 1680
atccatgatc ggattctcta aaatctagat tgtcacagga ttaccatccc accaagaacc 1740
ccaaacagac agacagggta tgcctccacg aataccagta cccgtgctcc catcaagcct 1800
tttcagcagt ctagaaaatc aatagaaacc acaagtctat ggctgtcaac gtgctggtgt 1860
cggtaggtta caggctgctt cacatcatca ccagctgtat gaatccctgt cattcttcag 1920
atctgtcgct gtcggttgag ttagatccgg tttgggatgc tgtcatcata acatggacat 1980
tcgcaatggt tataaggtcc tggtagatcg tttccactgg ggagtttgca aatcttgttg 2040
taaacacgtt tttcaatctt tatggatata aaatctttat acacaagatt gattgatgga 2100
gtccggaaat ttcttgaaat tcaggattct gaaatttttt tcggactaga aattaatgag 2160
aaaatctgag atttagaata ggacccacca tttggttcat ttttccatga atctagattc 2220
ctgaaactag gaaccaaatg aaaagctgaa caaaatgggc cctaaaaacc acaatcaagc 2280
aggtctcgtg ctggagctat tgttggcagg tcaggttgtt tgttctgaaa atattgcaag 2340
attttttttt atttgtttac gtacacgatc aatggtagca tcgatgttca gcactgaaca 2400
tcgtcgagat atgcgttcgg aaagcttcct ctttttcaac aacatctact gaaactttta 2460
ggcctttagc tcaacatcat cataatcatc ctcagtactg ccaaccaaga caaccctaaa 2520
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tccagatctg ccactccctc ggcggtggca ctgggtccgg gatgggcacc ctcctcatct 2640
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aattcatctt taataataat atatgtatat agacacatac atgatggata gagttgtttt 3000
atatcaataa tgatttatta taataataat aattattatt attattgatg gccacatctg 3060
tttctagtcg gcgatctcaa ccacctcatc tccaccacca tgagcggcgt gacgtgctgc 3120
ctgcgcttcc ctggccagct caactccgac ctccgcaagc tggccgtcaa cctcatcccc 3180
ttcccccgcc tccatttctt catggtcggc ttcgcccccc tgacctcccg cggctcgcag 3240
cagtaccgcg cactcaccat ccccgagctc acccagcaga tgtgggacgc caagaacatg 3300
atgtgcgccg ccgacccgcg ccacggccga tacctcaccg cctccgccat gttccggggc 3360
aagatgtcca ccaaggaggt ggacgagcag atgatcaacg tccagaacaa gaactcatcc 3420
tacttcgtcg agtggatccc caacaacgtc aagtccagcg tctgcgacat acctccacgg 3480
gggctctcca tgtcgtccac cttcatgggc aactccacct ccatccagga gatgttcaag 3540
cgcgtgtccg agcagttcac cgtcatgttc aggaggaagg ctttcttgca ctggtacact 3600
ggggaaggga tggatgagat ggagttcacc gaggcggaga gcaacatgaa tgatctcgtg 3660
tccgagtacc agcagtacca ggatgcggtc gccgaggagg aggatgacta cgttgaggag 3720
gccgaggagc agtagatacg gttttatata taatatttct atattcggga gcgtcagcga 3780
gcaaaagagt gtttgtaaga agacccgcca ccaccgacag taaacgcatt cgtatcacta 3840
tccatccatc catcatcgta caatttctct ctctatatgt aatttgtatg ttcacccaga 3900
tacctatgct tgtttgcaaa atttggcact gaaccggggc aacgggggga ggatgggggc 3960
gtcttttcct atgttatcat catatttttt tattgccatt tgtatttaag cattcttctg 4020
ctgtaacctt ccctattgtt actatcatta ttctgagtgc tttcattttg aagtccagct 4080
ccttttgctt ttttttactt ctgccccacg ccaattatac gaagggaata ttccccctgt 4140
gctacatata aagccgaagg ctacttttac ccacttctga aatggtaaaa tataactaga 4200
c 4201
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgtccgca aggaccgct 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagatggaa gaccgagaa 19

Claims (1)

1.慈姑内参基因C36425，其特征在于，所述内参基因C36425的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1所示。
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