CN108707686B - 川贝母特异内源基因及真伪快速检测引物组和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了川贝母的内源性基因，解决了现有技术中川贝母分子鉴定技术价格高、时效性差、图谱模糊不利判定、假阳性假阴性等问题。本发明所述的川贝母特异内源基因，包括如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本发明还提供了一种精准检测川贝母真伪的引物组以及利用该引物组检测川贝母真伪的方法。引物组上游引物和下游引物的序列分别如下：BMH‑YF：CAGCAGGAATCCCAAGC；BMH‑YR：GGTTGGCACAGTTGGAGG。本发明以首次克隆得到川贝母物种特异性内源基因序列为依据，设计特异性引物，建立高特异性PCR检测技术体系，建立了简单、高效、准确的川贝母真伪鉴定的的高特异性PCR分子检测技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术分析方法领域，具体涉及川贝母特异内源基因及真伪检测引物组和方法。
背景技术
川贝母为百合科Liliaceae贝母属Fritillaria L.多种植物(川贝母(卷叶贝母)(Fritillaria cirrhosa D.Don)、暗紫贝母(Fritillaria unibracteataHsiaoetK.C.Hsia)、甘肃贝母(Fritillariaprzezvalskii Maxim)、梭砂贝母(Fritillariadelavayi Franch)、太白贝母(Fritillariataipaiensis P.Y.Li)或瓦布贝母(Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C Hsia van wabuensis(Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen)干燥鳞茎的总称。它生长在广大高海拔地区，处在青藏高原的边界。它味道微苦，具有清热润肺、止咳化痰的功效，是中医治疗中常用的名贵药材，也是许多保健食品的重要原料。由于受限于生长环境条件和栽培技术，川贝母类资源短缺，商品价格一直居高不下，需求量又大，致使一些惟利是图的不法分子用其他类似的药材混充川贝母销售，导致市场上出现了众多的混淆品和伪品，严重影响川贝母的市场秩序，损害消费者的利益。中药材是传统医术指导下应用的原生药材，讲究地道药材。其品质和疗效受品种、特定自然条件、生态环境的地域影响明显。药材是否真实、正统，直接影响其使用价值和经济价值。
浙贝母(Fritillariae thunbergii Miq.)、湖北贝母(FritillariahupehensisHsiao et K.C.Hsia)、平贝母(Fritillaria ussuriensis Maxim.)、伊贝母(Fritillariapallidiflora Schrenk.)、土贝母(Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franque.)、光慈姑(Tulipa edulis(Miq.)Baker)等是常见的川贝母的混淆品及伪品。通常情况下，贝母伪品与正品虽然外观相似，但药用价值和营养价值相差甚远，甚至还含有对人体有害的成分，对药用和食用安全造成极大的威胁。因此，建立科学有效的川贝母真伪鉴定技术对于打击制售假的不法行为、保障人民群众用药及食用安全具有非常重要意义。
川贝母真伪鉴定主要通过性状、显微、理化等传统的鉴别方法来实现，因受主观经验判断或环境因素影响大，从而影响其判定准确度。随着科学技术的不断发展，分子检测技术在中药材鉴定中逐渐得到应用和推广，川贝母鉴定手段从传统的形态表征扩展到了遗传物质DNA，从经验宏观视角进入了微观探测。《中国药典》2015版对川贝母进行了收录和描述，并收录了聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)鉴定方法。该方法是基于贝母属核糖体DNA(nr DNA)中的Internal Transcribed Spacer(ITS)区核酸序列建立的，然后根据川贝母ITS1中的第75位特异碱基C，采用限制性内切酶Sma I酶切来区别川贝母与非川贝母类，较好地体现了分子生物技术专一性强、灵敏度高、操作简单等优点，是目前川贝母鉴定的重要参考技术。但该方法不适用于川贝母药材(干鳞茎)的常规鉴定，PCR结果常出现干扰后续判断的非特异性条带，酶切结果模糊的缺点。2016年鲍方名和薛满报道了该方法的改进优化条件，但经本项目组数次实践证明，对中药材川贝母的鉴定过程中仍然存在PCR扩增产生非特异条带的情况发生。而且，该方法需要经过内切酶对进行PCR反应产物进行酶切后凝胶电泳检测，耗时相对较长。陈士林报道了基于ITS2序列构建NJ树的川贝母条形码检测技术，可实现川贝母的真伪鉴定。但该法需要PCR扩增外，还需要测序比对，耗时长，费用高。CN201710421403发明专利中采用三级PCR技术鉴定川贝母，亦是存在耗时长，时效性差的缺点。CN 201610234695和CN201710595182发明专利中分别使用和探针法荧光PCR技术鉴定川贝母。采用SYBR Green I法鉴定川贝母的方法产生的非特异性产物较多，易导致高背景和假阳性而影响鉴定结果准确性。而探针法需要合成价格较高的探针和费用高昂的设备配套，经济适用性差，不利于推广。因此，有必要建立一种更快速简便而行之有效方法用于川贝母的真伪鉴定工作中。
高特异PCR分子检测技术，具有快速、高效、准确的特点，是建立新的川贝母真伪鉴定技术较好的选择。而要建立用于川贝母鉴定的高特异PCR分子检测技术，找到川贝母物种特异基因序列是需要克服的首要问题。然而，迄今为止还未有川贝母内参基因或物种特异基因的研究报道。《中国药典》2015版中川贝母分子鉴定PCR-RFLP方法，以及专利CN201710421403和CN201710595182中川贝母鉴定技术都是基于ITS区序列建立的。ITS1和ITS2是中度保守区域,其保守性表现为种内相对一致,种间差异明显的特点，使ITS常用于物种的分子鉴定以及属内物种间或种群的系统发育关系分析。但由于ITS片段不加入成熟核糖体，在物种进化过程中承受的自然选择压力小，容易发生碱基突变。这可能是导致川贝母PCR-RFLP鉴定方法中PCR扩增出现非特异性条带或条带模糊不清重要原因。同样基于ITS序列建立川贝母鉴定方法的CN201710421403和CN201710595182，其中的技术亦存在同一品种因物种进化、ITS序列发生变异而不被探及而导致假阴性发生的可能。皂苷是川贝母的有效成分之一。已有研究表明，川贝母中总皂苷含量明显高于浙贝母、伊贝母和平贝母等易混品，这种成分含量的显著差异为解释川贝母的独特药理活性提供了新的思路，根据川贝母特有活性成分合成途径及其相关基因揭示川贝母与其他贝母品质差异的根源，寻求新的物种鉴定技术提供了新的线索和方向。因此，提供能有效区别川贝母物种与其他易混淆品和伪品的基因、引物组和方法，更准确、快速、简单、检测周期更短、经济高效，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。我们已筛选得到川贝母中皂苷类物质合成相关基因的特异序列，经验证属川贝母内源基因，拟作为物种鉴定的特异性内源基因标记，以此为基础建立川贝母真伪鉴定新的技术体系，将很好地解决上述问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提供川贝母的内源性基因，用于其真伪检测，解决现有技术中川贝母分子鉴定技术价格高、时效性差、图谱模糊不利判定、假阳性假阴性等问题。
本发明还提供了一种精准检测川贝母真伪的引物组
本发明又提供了利用该引物组检测川贝母真伪的方法。
本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的川贝母特异内源基因，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体为：
本发明所述的一种检测川贝母真伪的引物组，所述引物组用于检测如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分别如下：
BMH-YF：CAGCAGGAATCCCAAGC；
BMH-YR：GGTTGGCACAGTTGGAGG。
本发明所述的一种利用如上所述的引物组检测川贝母真伪的方法，包括以下步骤：
步骤1.合成引物；
步骤2.制备DNA稀释液；
步骤3.配制PCR反应体系；
步骤4.PCR及电泳检测。
进一步地，步骤1中合成的引物浓度均为10μmol/l，步骤2中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
进一步地，步骤3中所述的配制PCR反应体系为将步骤2制得的DNA稀释液加入到25μl反应体系中，所述25μl的反应体系包括以下组分：
进一步地，步骤4中，所述PCR的反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；然后延展72℃延伸7min。
进一步地，步骤4中，所述电泳检测的检测条件为：将PCR扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶90V电泳40min后凝胶成像仪照相分析。
进一步地，所述方法的结果判断标准为：若阳性对照和待检测样品均扩增出234bp目标条带，而空白对照未出现条带，则可判定检测的样品中含有川贝母成分；若阳性对照扩增出条带，空白对照未出现条带，待检测对照未扩增出条带，则可判定检测的样品中不含有川贝母成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次克隆得到川贝母物种特异性内源基因序列。
本发明首次考虑到采用物种内源基因序列为基础，设计引物建立高特异性PCR分子检测技术鉴定川贝母真伪，不同于现有以ITS区序列为基础建立的分子检测方法。
本发明以首次克隆得到川贝母物种特异性内源基因序列为依据，设计特异性引物，建立高特异性PCR检测技术体系，建立了简单、高效、准确的川贝母真伪鉴定的的高特异性PCR分子检测技术，克服了现有川贝母分子鉴定技术价格高、时效性差、图谱模糊不利判定、假阳性假阴性等问题。本发明除了能有效地区别川贝母物种与其他易混淆品和伪品，还能探及含有川贝母成分的产品。
本发明特异性强、扩增效率高、准确度高、重复性好。可直接对基因组DNA为模板进行PCR反应，流程少、操作简单，稳定，检测成本低，易推广至普通检测机构中运用，具有更强的适用性。
本发明为川贝母真伪鉴定技术标准化奠定基础，对于有效打击制假、售假的不法行为，保障消费大众食药用安全，具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的川贝母特异内源基因部分序列及引物位置示意图。
图2川贝母内源基因序列的获得和物种特异性验证电泳图谱。
图3为本发明方法特异性检测川贝母的结果示意图。其中，附图标记对应的名称为：M：2000marker(天根)；1：卷叶贝母；2：甘肃贝母；3：瓦布贝母；4：暗紫贝母；5：梭砂贝母；6：浙江贝母；7：平贝母；8：伊贝母；9：湖北贝母；10：土贝母，11：光慈姑；12：贝母花；13：提取空白；14：水；15：其他作物DNA混合物；16：阳性对照品。
图4为本发明对川贝母检测灵敏度结果示意图。其中，附图标记对应的名称为：M：2000marker(天根)；1：50ng川贝母DNA为模板扩增产物；2：10ng川贝母DNA为模板扩增产物；3：2ng川贝母DNA为模板扩增产物；4：400pg川贝母DNA为模板扩增产物；5：80pg川贝母DNA为模板扩增产物；6：16pg川贝母DNA为模板扩增产物；7：3.2pg川贝母DNA为模板扩增产物；8：无菌水H2O。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
川贝母特异内源基因，包括如如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种检测川贝母真伪的引物组，所述引物组用于检测如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分别如下：
BMH-YF：CAGCAGGAATCCCAAGC
BMH-YR：GGTTGGCACAGTTGGAGG。
一种利用如上所述的引物组检测川贝母真伪的方法，包括以下步骤：
步骤1.合成引物；
步骤2.制备DNA稀释液；
步骤3.配制PCR反应体系；
步骤4.PCR及电泳检测。
步骤1中合成的引物浓度均为10μmol/l，步骤2中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
步骤3中所述的配制PCR反应体系为将步骤2制得的DNA稀释液加入到25μl反应体系中，所述25μl的反应体系包括以下组分：
步骤4中，所述PCR的反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；然后延展72℃延伸7min。
步骤4中，所述电泳检测的检测条件为：将PCR扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶90V电泳40min后凝胶成像仪照相分析。
所述方法的结果判断标准为：若阳性对照和待检测样品均扩增出234bp目标条带，而空白对照未出现条带，则可判定检测的样品中含有川贝母成分；若阳性对照扩增出条带，空白对照未出现条带，待检测对照未扩增出条带，则可判定检测的样品中不含有川贝母成分。
实施例1
本实施例提供了川贝母内源基因序列的获得和物种特异性验证。
我们拟筛选川贝母中皂苷类物质合成相关基因的特异序列作为物种鉴定的特异性内源基因标记，以此为基础建立川贝母真伪鉴定新的技术体系。在项目进行中，本项目组在对川贝母特征性代谢物甾体皂苷合成途径中的关键合成酶的研究中，克隆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因时，从川贝母基因组DNA中都得到一段342bp未知功能基因序列(如图2中A所示)，将该条带回收测序，在NCBI GenBank数据库中BLAST比对，未找到同源序列，以此确定为新的不同于HMGR基因的川贝母特有基因序列。我们根据该序列进一步设计目标片段大小为120bp的特异性引物，采用普通PCR技术对8个贝母样品进行检测，结果仅在卷叶贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母、甘肃贝母五种川贝母药材基因组DNA中扩增得到目标条带(如图2中B所示)。与此同时，采用PCR-RFLP鉴定方法同步检测，结果两种方法对川贝母真伪识别效果一致。进一步，根据所得序列进行步移克隆测序，拼接得到610bp核酸序列。再根据该段序列设计目标片段大小为352bp的特异性引物，采用普通PCR技术对8个贝母样品进行检测，结果仅在川贝母药材基因组DNA中扩增得到目标条带(如图2中C所示)。因此，确定该段基因序列为川贝母特异内源基因部分序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
实施例2
本实施例提供了本发明方法的特异性试验，具体步骤如下：
(1)合成PCR检测引物组，所述引物组的核苷酸序列如下所示：
BMH-YF：CAGCAGGAATCCCAAGC
BMH-YR：GGTTGGCACAGTTGGAGG。
本实施例引物配制工作浓度均为10μmol/l。
以上引物核苷酸序列是基于川贝母中特异内源基因特定位点设计，该内源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过该设计分别扩增234bp大小的目标片段，可以精准有效地检测到所有川贝母及含有川贝母成分的产品。
(2)制备DNA模板溶液；从卷叶贝母、梭砂贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、甘肃贝母、浙贝母、平贝母、湖北贝母、伊贝母、土贝母、光慈姑、贝母花等样品中提取的DNA、以及从玉米、水稻、大豆、油菜、鸡、猪等其他物种的DNA浓度稀释为50ng/μl的DNA稀释液，作为待测检测样品。从阳性对照品(标准物质，购于购于中国食品药品检定研究院)提取的DNA溶液作为阳性对照，提取空白、灭菌纯水(H2O)作为空白对照。
(3)配制PCR反应体系；即将制备好的DNA稀释液加入25μl反应体系中。
以上25μl反应体系包括以下组分：
本实施例中采用的PCR试剂为Taq PCR Master Mix(ABI,Canada)、QuickHSDyeMix(Toyobo Co.,Ltd.,Osaka,Japan)、Multiplex PCR Kit(QIAGEN Group,Sample&Assay Technologies,Japan)三种试剂任意一种均可，根据不同试剂采用相应PCR反应体系。
(4)PCR扩增：
所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；然后延展72℃延伸7min。
本实施例中采用的是ABI公司生产的PCR仪(ABI applied BiosystemsVeriti96well Thermal Cycler仪器)或Eppendorf公司生产的PCR仪(EppendorfMastercycler)。
(5)电泳检测分析：扩增完毕后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出目标条带而判定样品中是否存在川贝母成分。
该步骤中，对扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳分析
扩增结果分析：若阳性对照和待检测样品均扩增出234bp目标条带，而空白对照未出现条带，则可判定检测的样品中含有川贝母成分；若阳性对照扩增出条带，空白对照未出现条带，待检测对照未扩增出条带，则可判定检测的样品中不含有川贝母成分。
按照以上实施例，便可很好地实现本发明。
本实施例中采用高特异性PCR技术，引物组BMH-YF/BMH-YR对川贝母对照品、卷叶贝母、梭砂贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、甘肃贝母、浙贝母、平贝母、湖北贝母、伊贝母、土贝母、光慈姑、贝母花等样品和其他几种物种的基因组DNA的扩增结果如图3所示。附图3中的“M”指的是DNA标记(DNAmarker)，其具有多个条带，分别用于表示不同大小的DNA片段。
结果显示，附图3中只有川贝母阳性对照、卷叶贝母、梭砂贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、甘肃贝母样品中扩增出234bp目标条带(泳道1-5，16)，浙贝母、平贝母、湖北贝母、伊贝母等易混品、光慈姑、土贝母等伪品及提取空白、试剂空白对照(水)、玉米、水稻、大豆、油菜籽、鸡、猪等其他物种的DNA中未能扩增出条带(泳道6～15)。这说明引物组BMH-YF/BMH-YR对川贝母特异性非常高，可准确地检测到川贝母的几个不同的品种。
采用Taq PCR Master Mix(ABI,Canada)、QuickHS DyeMix(Toyobo Co.,Ltd.,Osaka,Japan)、Multiplex PCR Kit(QIAGEN Group,Sample&AssayTechnologies,Japan)等不同厂家试剂，采用本实施例的引物组和检测方法均可从阳性对照(购于中国食品药品检定研究院的川贝母对照标准物质)和搜集到的川贝母样品中得到目标带，该结果可多次重复再现，具有可重复性。因此，本方法对川贝母样品真伪检测结果稳定可靠。
实施例3
本实施例提供了本发明方法的灵敏度试验。
以50ng/μl的川贝母DNA溶液，采用TE buffer 5倍稀释成7个不同的浓度梯度。分别取1μl为模板，相当于反应体系中，DNA模板量分别为50ng、10ng、2ng、400pg、80pg、16pg、3.2pg，采用本发明中的引物和PCR技术进行扩增。结果见图4，附图中的“M”指的是DNA标记(DNAmarker)，其具有多个条带，分别用于表示不同大小的DNA片段。灵敏度实验结果表明，反应体系中低至16pg量(泳道6)的川贝母DNA含量均可以检测到。该结果很好地表明本方法灵敏度高。
实施例4
本实施例提供了采用本发明方法进行不同的样本测试。
采用实施例2的引物组和检测方法，对15份贝母样品进行检测，并用PCR-RFLP方法同时进行验证。结果表明，电泳图谱中条带大小直观明了，准确率100％，可根据清晰的图谱明确的作出判断。采用PCR-RFLP方法对其中两个样本(样本序号：2和11)的鉴定过程中，存在条带模糊不清不利判断情况。实际样本测试统计结果见表1。
表1样本测试结果统计表
通过以上实施例结果可得知，本发明的扩增效率高、准确度高、灵敏度高、重复性好，结果稳定可靠。该方法对于鉴别川贝母特异性强，可行性高，具有较好的应用前景。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明的保护范畴限制，在本发明技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (7)
1.一种分离的用于检测川贝母的特异内源基因，其特征在于，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种检测川贝母真伪的引物组，其特征在于，所述引物组用于检测权利要求1所述的核苷酸序列，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分别如下：
BMH-YF：CAGCAGGAATCCCAAGC；
BMH-YR：GGTTGGCACAGTTGGAGG。
3.一种利用权利要求2所述的引物组检测川贝母真伪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.合成引物；
步骤2.制备DNA稀释液；
步骤3.配制PCR反应体系；
步骤4.PCR及电泳检测；
所述方法的结果判断标准为：若阳性对照和待检测样品均扩增出234bp目标条带，而空白对照未出现条带，则可判定检测的样品中含有川贝母成分；若阳性对照扩增出条带，空白对照未出现条带，待检测对照未扩增出条带，则可判定检测的样品中不含有川贝母成分。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1中合成的引物浓度均为10μmol/l，步骤2中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3中所述的配制PCR反应体系为将步骤2制得的DNA稀释液加入到25μl反应体系中，所述25μl的反应体系包括以下组分：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述PCR的反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；然后延展72℃延伸7min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述电泳检测的检测条件为：将PCR扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶90V电泳40min后凝胶成像仪照相分析。
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