CN102492773B

CN102492773B - 筛查16SrI组植原体的芯片及其应用

Info

Publication number: CN102492773B
Application number: CN 201110402761
Authority: CN
Inventors: 张永江; 牟海青; 赵文军; 朱水芳
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2011-12-07
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2031-12-07
Also published as: CN102492773A

Abstract

本发明公开了一种筛查16SrI组植原体的芯片及其应用。本发明的筛查16SrI组植原体的探针，由5条探针组成，所述5条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。还提供了筛查16SrI组植原体的基因芯片，为将上述的探针固定在芯片表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对16SrI组植原体的16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准植原体样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查16SrI组植原体的芯片可用于16SrI组植原体的检疫鉴定。

Description

筛查16SrI组植原体的芯片及其应用

技术领域

本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查16SrI组植原体的芯片及其应用。

背景技术

16SrI组为翠菊黄化组(Ca.Phytoplasma asteris)，组下分为11个亚组，目前16SrI组是含有植原体种类最多的组，含有二百余个植原体株系，主要包括翠菊黄化植原体、洋葱黄化植原体、马铃薯紫顶病植原体、苜蓿矮化植原体、草莓矮化植原体、泡桐丛枝植原体等。危害症状主要包括叶片黄化(yellowing)或变红(reddening ofleaves)、节间缩短(shortening of internodes)，矮化(stunt)，小叶(little leaves)、枝条过度增生而导致的丛枝(excessive proliferation of shoots resulting in awitches’broom)、变叶(phyllody，leaf-like petals and sepals)、绿变(virescence，excess ive greening of floral tissue)、花不育(sterile flowers)，韧皮部组织坏死(necrosis)、木本植物的枯梢(dieback)以及植株的生长衰退(decline)和死亡等。

与其它16SrI组植原体相比，泡桐丛枝植原体在我国发生与分布范围相对较广。六十年代之后，大规模泡桐人工造林运动的开展和全国规模的种苗调运，泡桐丛枝病的发生和危害逐渐加重，目前除少数泡桐生长区外，各泡桐产区都普遍遭受此病的危害。在重病区的河南、山东、陕西等省区，苗期发病率为1-8％，1-3年生幼树发病率为5％-10％，3-5年中幼龄树可达30-50％，10年生树可达100％。此病害造成直接经济损失包括死苗和幼树的死亡，成年树干型差和材积的减少。据报道，1990年对河南、山东、陕西、河北、安徽、甘肃、江苏和山西等省的调查显示，全国丛枝病发生面积达88万公顷，每年造成直接经济损失超过一亿元。

目前用于16SrI组植原体的检测方法包括普通PCR、荧光PCR、电子显微镜技术、荧光显微镜等，该类方法存在特异性不强、步骤繁琐等局限性，而且对于未知的、新发的植原体无法进行检测与监测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种筛查16SrI组植原体的探针。

本发明提供的筛查16SrI组植原体的探针，由5条探针组成，所述5条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。

上述探针中，16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

本发明的另一个目的是提供一种筛查16SrI组植原体的基因芯片。

本发明提供的筛查16SrI组植原体的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。

在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是博奥生物有限公司晶

微阵列基片，产品目录号：420022。

在上述基因芯片中，所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

本发明的第三个目的是提供一种筛查16SrI组植原体的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。

在上述试剂盒中，还包括如下引物组：

所述引物组由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物对C由引物5和引物6组成；

所述引物对D由引物7和引物8组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7；

所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8；

所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9；

所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10；

所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11；

所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12；

所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13；

上述试剂盒由上述的基因芯片和上述引物组组成。

上述试剂盒中，所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

本发明的第四个目的是提供一种用于筛查16SrI组植原体的引物组。

本发明提供的引物组，由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物对C由引物5和引物6组成；

所述引物对D由引物7和引物8组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7；

所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8；

所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9；

所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10；

所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11；

所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12；

所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13；

所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

本发明还提供一种用于筛查16SrI组植原体的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、dNTP、PCR缓冲液和聚合酶组成。

上述PCR试剂中，上述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的浓度均为0.2mmol/L。

上述探针、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在鉴定或辅助鉴定16SrI组植原中的应用也是本发明保护的范围。

上述探针、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在制备鉴定或辅助鉴定16SrI组植原产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第五个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测样品感染16SrI组植原体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品的基因组DNA进行标记，得到标记后产物；

2)将步骤1)得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；

2)将步骤1)得到的杂交后芯片扫描；

若所述基因芯片上至少一条所述探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3.0，则待测样品感染或候选感染16SrI组植原体。

所述至少一条所述探针为5条探针。

在上述方法中，步骤1)中，所述标记为以待测样品的基因组DNA为模板，以上述引物组进行PCR扩增，得到标记后产物；

在上述方法中，步骤2)中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h。

在上述方法中，在所述步骤2)后和步骤3)前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤。

在上述方法中，所述16SrI组植原体具体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

本发明的实验证明，本发明提供的筛查16SrI组植原体的芯片中的探针具有16SrI组植原体组水平上的高兼容性和植原体组内的特异性，数小时内完成对待检样品中可能存在的新发植原体的筛查，所需的样品量极少，一般仅需0.1g。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对16SrI组植原体的16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准植原体样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查16SrI组植原体的芯片可用于16SrI组植原体的检疫鉴定。

附图说明

图1为16SrI组植原体筛查芯片探针点阵示意图(5×6)

图2为应用草莓枝状果植原体标准样品验证16SrI组植原体筛查芯片的结果

图3为应用泡桐丛枝植原体标准样品验证16SrI组植原体筛查芯片的结果

图4为筛查芯片灵敏度检测结果

图5为PCR灵敏度检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、筛查16SrI组植原体的芯片的制备

1、组级高兼容性寡核苷酸探针的设计

1)从美国国立生物技术信息中心(NCBI)及核糖体数据库项目官方网站(RDP)数据库下载16SrI组植原体全基因组及核酸序列数据用于设计探针。

2)整理植原体核酸序列，去除小于200bp长度的核酸序列并分组；同一组内所有植原体序列简称为组内序列，非本组的所有植原体序列简称为组外序列。

3)使用ClusterW联配组内序列，寻找序列保守区域设计探针。探针设计时在序列保守区域内以2～3个碱基作为间隔，连续提取所有19bp的核酸序列，对选取的核酸序列进行筛选，标准为GC含量在40％及60％之间，没有大于3bp的连续重复碱基，以及不会形成大于3bp的发卡结构。

4)使用自编程序将通过步骤3)筛选的探针序列与组外序列联配，程序计算二级结构的自由能、MMPD(The distance of the mismatch in the middle position)、最长相同片段等条件进行综合打分，弃用高于模拟杂交标准分的探针。

5)使用自编程序将通过步骤4)筛选的探针序列与组内序列进行比对，程序计算打分，弃用低于模拟杂交标准分的探针。

6)使用BLASTN将通过步骤5)筛选得到的探针序列与步骤2)得到的特异性数据库进行特异性比对，Word size设为7，筛选标准为Max Score小于15分，并且无7bp以上的相同片段

7)对于剩余的每一条探针进行排序，排序标准依次为探针对组内序列模拟杂交总分、探针对组外序列模拟杂交总分及探针对特异性数据库的BlastN Max Score总分，取排名前两名的两条探针为组特异性探针。

8)如果经过步骤7)无法达到每组至少2个探针对应的标准，则在步骤3)降低序列保守性标准，重新设计，依此循环直到所有16SrI组序列都有2个探针对应。如果无法从保守区域设计探针，或16SrI组内序列无保守区域，则使用所有16SrI组全长序列设计探针。探针设计标准与步骤3)到步骤7)相同。

根据上述原则设计了16S rDNA区域的1条探针(探针1)、tuf的2条探针(探针57和探针58)、16S-23S rDNA spacer的1条探针(探针73)、及imp基因的1条探针(探针76)，其核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、2、3、4、5所示。

可以人工合成上述5条探针。

2、芯片的制备

将上述1得到的5条探针用点样缓冲液(博奥生物有限公司晶

芯片点样液，产品目录号：440010)溶解，浓度为50μM，每条探针横向重复3点点在醛基化玻璃片基芯片(博奥生物有限公司晶

微阵列基片，产品目录号：420022)上，每点约0.25nL，点直径约180μm，点间距为300μm，点样均匀度的标准方差为15％。将芯片点有探针的一面在65℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42℃预热，0.5％SDS清洗10min。将芯片转移到42℃预热蒸馏水中清洗2min。把芯片放在50ml锥形离心管中，2000rpm离心1min，以去除芯片表面的液体，获得筛查16SrI组植原体的芯片。

筛查16SrI组植原体的芯片如图1所示，图1中1、57、58、73、76为16SrI组植原体筛查芯片探针1、57、58、73、76(对应序列1-5)，Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。

实施例2、筛查16SrI组植原体的芯片的应用

一、筛查16SrI组植原体的芯片检测样品

1、用于检测的样品总DNA提取

1)取感染草莓枝状果植原体的草莓叶片(拉丁名：Strawberry Phylloid FruitPhytoplasma，记载在：Molecular Identification and Classification of Strawberry PhylloidFruit Phytoplasma in Group 16SrI，New Subgroup.Plant disease，2002，86(8)：920.，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。)和感染泡桐丛枝植原体的泡桐叶片(拉丁名：Paulownia witches′broom phytoplasma.记载在：泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白抗血清的制备及应用，植物病理学报，2011，41(2)：161-170.)各0.1g，取适量液氮研磨，再加入研磨液2ml充分研磨，4℃20000rpm离心20min，弃上清。

2)加入1mlDNA提取液，40ul蛋白酶K(5mg/ml)，轻轻混匀，加入160ul 10％十二烷肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1～2小时，期间不断的颠倒混匀，4℃6000rpm，10min，取上清。

3)加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻混匀，-20℃保持至少30min，4℃12000rpm，15分钟，弃上清。

4)加入600ul带有RNase的水液，加入30ulSDS，12ul蛋白酶K，轻轻彻底混匀，37℃温育60分钟。

5)加100ul 5M NaCl混匀，再加入84ulCTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10分钟。

6)加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀，4℃12000rpm，10分钟，重复直至无中间白色层。

7)上层水相加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，4℃12000rpm，10分钟。

8)上清液加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃保持至少30分钟，4℃12000rpm，10分钟，弃上清液。

9)加入1ml 70％乙醇12000rpm离心1分钟。洗涤两次。加入30ul TE混匀溶解，分别得到草莓枝状果植原体基因组DNA和泡桐丛枝植原体基因组DNA。

2、样品标记与杂交

标记体系为20μL，即在每个0.2mL的反应管中加入2μL上述1得到的基因组DNA、上游引物0.2μL(终浓度为0.2mmol/L)、下游引物0.2μL(终浓度为0.2mmol/L，5’端TAMARA标记)、dNTP Mix(10mmol/L)1.6μL、LA-Taq酶0.5μL、10×Buffer(Mg2+)2μL及DEPC-H2O 13.5μL。

上下游引物由分别用于扩增包括16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp及tuf探针序列的引物对组成，

上述用于扩增16S rDNA的引物对由序列表中的序列6和序列表中的序列7组成；

上述用于扩增16S-23S rDNA spacer的引物对由序列表中的序列8和序列表中的序列9组成；

上述用于扩增imp的引物对由序列表中的序列10和序列表中的序列11组成；

上述用于扩增tuf的引物对由序列表中的序列12和序列表中的序列13组成。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min 30sec，35cycles；72℃10min。

杂交：杂交液包括2.4μL 3×SSC、0.32μL 0.2％SDS、4μL25％甲酰胺、0.32μL外标、1.6μL5×Denhard’s及标记样品7.36μL；95℃变性3min，冰浴5min，瞬时离心；将杂交液加到由实施例1得到的16SrI组植原体筛查芯片上，盖薄片盖好，42℃水浴杂交过夜(12h)。

分别得到杂交后的芯片(草莓枝状果植原体)和杂交后的芯片(泡桐丛枝植原体)。

3、洗涤、扫描

清洗体系及程序如下：

先将洗液I、II放在微波炉中预热到42℃，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50ml锥形离心管中，2000rpm离心1min，除去芯片表面的液体，分别得到待检测芯片(草莓枝状果植原体)、待检测芯片(泡桐丛枝植原体)。

将上述待检测芯片(草莓枝状果植原体)、待检测芯片(泡桐丛枝植原体)置于扫描仪中进行扫描分析；PMT设为900，获得各点荧光强度、背景强度等数据。

使用博奥生物开发的LuxScan 3.0从扫描的芯片中提取数据，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背景值的中位值。信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与背景值中位值的比值。

若至少一条所述探针的信号绝对值均大于5000且信噪比均大于3.0，判为阳性(为16SrI组植原体感染)；探针的信号绝对值均小于5000且信噪比均小于2.0，判为阴性(不为16SrI组植原体感染)；如果信号模糊且信噪比介于2.0和3.0之间，判为可疑，实验需重复验证。

图2、图3的探针排列与图1相同，阳性探针均为1、57、58、73、76。

草莓枝状果植原体的结果如图2所示，探针1、57、58、73、76所在位置的信号绝对值均为7000；且信噪比均为4，说明本发明可以检测16SrI组植原体的草莓枝状果植原体；

泡桐丛枝植原体的结果如图3所示，探针1、57、58、73、76所在位置的信号绝对值均为7500；且信噪比均为4.5，说明本发明可以检测16SrI组植原体的泡桐丛枝植原体；

上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂交信号强而无背景噪音，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。

二、筛查16SrI组植原体芯片与PCR检测灵敏度比较

准确称取0.1g泡桐丛枝植原体侵染的泡桐叶片，提取基因组DNA，分别用于16SrI组植原体筛查芯片检测和PCR检测，两者所用的DNA均进行5⁰、5^-1、5^-2、5^-3和5^-4倍梯度稀释。

芯片检测的方法同上述的一，

芯片检测实验结果如图4所示，图4的探针排列与图1相同，其中A：5^-2稀释；B：5^-3稀释；C：5^-4稀释；可以看出，16SrI组植原体筛查芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为5⁴。

PCR检测的引物为

上游引物：5’-CCTGTTAACTGGCTTTCTCCTA-3’；

下游引物：5’-GGAGGTTTTTGGCATTATCG-3’。

PCR检测的结果如图5所示，1：5⁰稀释；2：5^-1稀释；3：5^-2稀释；4：5^-3稀释；5：5^-4稀释；M：Marker DL2000，可以看出，均得到34Ibp的产物(Genbank号NC 005303的第688569-688909位核苷酸)，待检对象的最高稀释倍数为5³。

因此，16SrI组植原体筛查芯片检测灵敏度比PCR方法高5倍。

Claims

1.一种筛查16SrI组植原体的探针，由5条探针组成，所述5条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

3.一种筛查16SrI组植原体的基因芯片，为将权利要求1或2所述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。

4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于：所述片基为醛基化玻璃片基；所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

5.一种筛查16SrI组植原体的试剂盒，包括权利要求3或4所述的基因芯片。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下引物组：

所述引物组由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物对C由引物5和引物6组成；

所述引物对D由引物7和引物8组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7；

所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8；

所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9；

所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10；

所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11；

所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12；

所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13；

所述试剂盒由权利要求3或4所述的基因芯片和所述引物组组成；

所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

7.一种用于筛查16SrI组植原体的引物组，由如下引物对A-引物对D的4对引物对组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物对C由引物5和引物6组成；

所述引物对D由引物7和引物8组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列6；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列7；

所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列8；

所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列9；

所述引物5的核苷酸序列为序列表中的序列10；

所述引物6的核苷酸序列为序列表中的序列11；

所述引物7的核苷酸序列为序列表中的序列12；

所述引物8的核苷酸序列为序列表中的序列13；

所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

8.权利要求1或2所述探针、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7所述的引物组在鉴定或辅助鉴定16SrI组植原中的应用；

所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

9.权利要求1或2所述探针、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7所述的引物组在制备鉴定或辅助鉴定16SrI组植原产品中的应用；

所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。

10.一种筛查或辅助筛查待测样品感染16SrI组植原体的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品的基因组DNA进行标记，得到标记后产物；

2)将步骤1)得到的标记后产物与权利要求3或4所述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；

3)将步骤1)得到的杂交后芯片扫描，

若所述基因芯片上至少一条所述探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3.0，则待测样品感染或候选感染16SrI组植原体；

步骤1)中，所述标记为以待测样品的基因组DNA为模板，以权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7所述的引物组中的引物组进行PCR扩增，得到标记后产物；

步骤2)中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；

在所述步骤2)后和步骤3)前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；

所述16SrI组植原体为草莓枝状果植原体或泡桐丛枝植原体。