CN102719562B - 筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片及其应用。本发明提供的鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针，由9条探针组成，所述9条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。还提供了筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对椰子死亡类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片可用于椰子死亡类病毒属类病毒的检疫鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片及其应用。
背景技术
椰子死亡类病毒属类病毒（Cocadviroid）属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae），根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy ofViruses,ICTV）第八次分类报告，该属包括柑橘类病毒IV(Citrus viroid IV，CVd-IV)、椰子死亡类病毒(Coconut cadang-cadang viroid，CCCVd)、椰子败生类病毒(Coconuttinangaja viroid，CTiVd）及啤酒花潜隐类病毒(Hop latent viroid，HLVd)等4种类病毒。其中椰子死亡类病毒和椰子败生类病毒是2007年发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中的检疫性有害生物。
该属的类病毒可侵染椰子(Cocos nucifera)、油棕(Elaeis guineensis)、长柄贝叶棕(Corypha elata)，人工接种寄主有槟榔(Areca catechu)、散尾葵(Chrysalidocapruslutescens)、枣椰(Phoenix dactylifera)、大王椰(Roystonea regia)、圣诞椰(Veitchiamerrillii)、甜橙(Citrus sinensis)和枸橼(Citrus medica)等多种重要的作物。椰子死亡类病毒是我国进境植物检疫性有害生物，也是国际上著名的检疫性有害生物，它严重危害椰子和油棕等棕榈科植物的生产，主要分布于菲律宾。1937年首次报道在菲律宾的椰子死亡病，病树根部坏死，顶芽枯死，底部叶脱落，花序短小、坏死；1976年确定该病病原体为椰子死亡类病毒。菲律宾从1914年发现椰子死亡病以来，约有3亿株椰子树死亡，据估算每株感病椰子的经济损失约为80～100美元。菲律宾每年约有50万株病树枯死，仅1986年由新出现的病树引起的直接经济损失达2000万美元以上。
椰子是我国热带主要果树之一，具有很高经济价值，在热带作物种植业中占据重要地位。海南岛是我国椰子分布最集中的地方，是我国椰子的主产区，全省椰子种植面积达到68万亩，年产椰子2.26亿个，产量占全国的99％。此外，椰子在粤西的雷州半岛和西双版纳以及西沙群岛也都有少量栽培。观赏棕榈植物种植是当前农业开发的热点，不断从国外引进棕榈科观赏植物新品种，椰子类病毒传入我国的可能性加大。因此，建立该属类病毒的筛查方法，对防止该属类病毒传入我国，保护我国棕榈科植物的生产和环境、旅游资源，具有重要经济意义。
由于本属具有潜在新发检疫性类病毒的可能，而目前用于该属类病毒检测的方法如指示植物法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、核酸斑点杂交技术及分子生物学技术等只能对该属已知类病毒进行特异性检测，对于未知及新发的类病毒监测无能为力，所以容易造成危险性类病毒漏检并传播扩散，进而导致巨大的经济损失和不良的社会影响。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针组。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针组，由探针1-探针9共9条探针组成，所述探针1-探针9的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。
上述探针中，所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。
本发明的另一个目的是提供一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片。
本发明提供的筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。
在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是博奥生物有限公司晶芯微阵列基片,产品目录号:420022。
在上述基因芯片中，所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。
本发明的第三个目的是提供一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。
上述试剂盒还包括用于扩增所述椰子死亡类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子组成；所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。
上述探针组、上述基因芯片或上述试剂盒在如下1）-4）中的应用，也是本发明保护的范围：
1）鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒；
2）制备鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒产品；
3）鉴定或辅助鉴定待测植物感染椰子死亡类病毒属类病毒；
4）制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染椰子死亡类病毒属类病毒产品。
上述应用中，所述待测植物为椰子、柑橘或啤酒花；所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。
本发明的第四个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测植物感染椰子死亡类病毒属类病毒的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；
2）将步骤1）得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；
3）将步骤2）得到的杂交后芯片扫描，
若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3.0，则待测植物感染或候选感染椰子死亡类病毒属类病毒。
上述方法中，步骤1）中，所述标记为以所述cDNA为模板，以上述的试剂盒中的任一所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；
步骤2）中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；
在所述步骤2）后和步骤3）前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；
所述至少一条所述探针为所述探针组中的任意一条；
所述待测植物为啤酒花，所述组织为叶片；
所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。
本发明的实验证明，本发明提供的筛查椰子死亡类病毒属类病毒芯片中的探针具有椰子死亡类病毒属类病毒属水平上的高兼容性和属内的特异性，所需的样品量少，一般仅需0.1g。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对椰子死亡类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该属的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片可用于椰子死亡类病毒属类病毒的检疫鉴定。
附图说明
图1为椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片探针点阵示意图（6×7）
图2为应用啤酒花潜隐类病毒样品验证属筛查芯片的特异性
图3为应用啤酒花潜隐类病毒样品验证属筛查芯片的灵敏度检测结果
图4为PCR灵敏度检测结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片的制备
1、属级高兼容性寡核苷酸探针的设计
从美国国立生物技术信息中心（NCBI）及国际病毒学分类委员会(ICTV)数据库下载类病毒属全基因组及核酸序列；去除90%以上长度与其它序列有95%相似度的核酸序列；以5个碱基作为间隔，连续提取所有40mer的核酸序列；以40%≤GC含量≤60%、单个碱基含量≤50%、连续重复碱基数目≤4，且无大于6个碱基的发卡结构为标准对提取的核酸序列进行筛选，并在NCBI数据库中进行同源性比较以保证所获得探针的特异性。
根据上述原则设计了椰子死亡类病毒属类病毒的9条探针（探针1-探针9），其核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1-9所示。
可以人工合成上述9条探针。
2、芯片的制备
将上述1得到的9条探针分别用点样缓冲液（博奥生物有限公司晶芯芯片点样液,产品目录号:440010）溶解，浓度为50μM，每条探针横向重复3点点在醛基化玻璃片基芯片（博奥生物有限公司晶芯微阵列基片,产品目录号:420022）上，每点约0.25nL，点直径约180μm，点间距为300μm，点样均匀度的标准方差为15％。将芯片点有探针的一面在65℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42℃预热，0.5％SDS清洗10min。将芯片转移到42℃预热蒸馏水中清洗2min。把芯片放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，以去除芯片表面的液体，获得筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片。
筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片如图1所示，图1中1-9为椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片探针1-9（对应序列1-9），Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。
实施例2、筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片的应用
一、筛查芯片检测样品
1、用于检测的样品总RNA提取
1）取感染啤酒花潜隐类病毒的啤酒花组织（啤酒花潜隐类病毒拉丁名Hop latentviroid，记载在：First report of Hop latent viroid(HLVd)in China，BSPP-New DiseaseReports，2007，16,17.，公众可从中国检验检疫科学研究院获得；啤酒花记载在：；啤酒花记载在：啤酒花防癌,《健康人生》,2006年第2期;公众可从中国检验检疫科学研究院获得）0.1g样品，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5mL离心管中，然后加入1mL的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；
2）4℃，12000rpm离心10min，将上清液转入一新的1.5mL离心管中；
3）加0.5mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置15min；4℃，12000rpm离心15min；
4）将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温保持15min；
5）4℃，12000rpm离心10min；倒掉上清液，加入75%的冷乙醇洗涤沉淀，然后4℃，12000rpm离心5min，弃乙醇；
7）沉淀室温下充分干燥后，溶于40μL双蒸水（DEPC处理）中，-20℃保存备用，得到RNA。
2、样品标记与杂交
将上述得到的RNA反转录得到cDNA。
PCR扩增，即在0.2mL的反应管中加入cDNA产物2μL、上游引物0.5μL（终浓度为0.5mmol/L）、下游引物0.5μL（终浓度为0.5mmoL/L）、dNTP Mix（10mmol/L）0.5μL、Taq酶（5U/μL）0.5μL、PCR缓冲液（10×）2μL及DEPC-H2O 14μL，然后按照PCR反应程序进行扩增。
上下游引物由用于扩增啤酒花潜隐类病毒的引物组成，
上游引物：5’-ACCTACTCGAGCGAGGCGGAG-3’（序列10）；
下游引物：5’-GCACGAACTGGCGCTCGAT-3’（序列11）；
其PCR反应程序为：94℃5min;94℃30s、58℃30s、72℃30s;共30个循环;72℃延伸8min。
Klenow酶标记体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入PCR产物5μL，9N随机引物（invitrogen，Cat.No.48190-011）（100μmol/L）2μL及H2O 12μL，95℃变性3min，冰浴5min。然后向反应管中加入10×Klenow酶缓冲液2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，cy3-dCTP 0.5μL（Amersham,Cat.No.PA 53021终浓度为5nmol/L），klenow酶（5U/μL）1μL。37℃反应1.5h，70℃变性5min，冰浴5min，得到标记样品。
杂交：体系为16μL，包括2.4μL SSC（终浓度3×）、0.32μLSDS（终浓度0.2％）、4μL甲酰胺（终浓度25%）、1.6μLDenhardt’s（Ameresco，Cat.No.E717，终浓度5×）和标记样品7.68μL。95℃变性3min，冰浴5min，瞬时离心。将杂交液加到芯片上，盖玻片盖好，42℃水浴杂交过夜（12h），分别得到杂交后的芯片（啤酒花潜隐类病毒）。
3、洗涤、扫描
清洗体系及程序如下：
先将洗液I、II放在微波炉中预热到42℃，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，除去芯片表面的液体，分别得到待检测芯片（啤酒花潜隐类病毒）。
将上述待检测芯片（啤酒花潜隐类病毒）置于扫描仪中进行扫描分析；PMT设为900，获得各点荧光强度及背景强度等数据。
使用博奥生物公司LuxScan 3.0芯片扫描仪从芯片中提取数据，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背景值的中位值。信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与背景值中位值的比值。
若至少一条所述探针的信号值≥600且信噪比≥3，判为阳性（为椰子死亡类病毒属类病毒感染）；探针的信号值＜600且信噪比＜2，判为阴性（不为椰子死亡类病毒属类病毒感染）；其余情况判为可疑，需重复验证。
图2的探针排列与图1相同，阳性探针均为1-9。
椰子死亡类病毒的结果如图2所示，探针1、2所在位置的信号值分别为1272、984，均大于600；且信噪比分别为8、6，均大于3，说明本发明可以检测椰子死亡类病毒属类病毒的啤酒花潜隐类病毒；
上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂交信号强，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。
二、筛查的芯片与PCR检测灵敏度比较
准确称取0.1g感染啤酒花潜隐类病毒的啤酒花组织，提取总RNA，分别用于椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片检测和PCR检测，两者所用的RNA均进行101和102倍梯度稀释。
芯片检测的方法同上述的一，结果如图3所示，图3的探针排列与图1相同，其中A：101稀释；B：102稀释。A中探针1所在位置的信号值别为652，信噪比为7，可以判定探针1为阳性。B无信号。因此，椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片可检测到待检对象101稀释倍数。
PCR检测的引物为
上游引物：5’-ACCTACTCGAGCGAGGCGGAG-3’；
下游引物：5’-GCACGAACTGGCGCTCGAT-3’。
PCR检测的结果如图4所示，1：100稀释；2：101稀释；3：102稀释；M：Marker DL2000，可以看出，100、101和102稀释模板均得到256bp的产物（Genbank号NC_003611的第1-256位核苷酸），待检对象的最高稀释倍数为101。
因此，椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片检测灵敏度与PCR方法灵敏度相当。
Claims (10)
1.一种鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针组，由探针1-探针9共9条探针组成，所述探针1-探针9的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。
2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于：所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。
3.一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片，为将权利要求1或2所述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于：所述片基为醛基化玻璃片基；所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。
5.一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的试剂盒，包括权利要求3或4所述的基因芯片和用于扩增所述椰子死亡类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子组成；所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。
6.权利要求1或2所述探针组在如下1）或2）中的应用：
1）鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒；
2）制备鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒产品。
7.权利要求3或4所述的基因芯片在如下1）或2）中的应用：
1）鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒；
2）制备鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒产品。
8.权利要求5所述的试剂盒在如下1）或2）中的应用：
1）鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒；
2）制备鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒产品。
9.一种筛查或辅助筛查待测植物感染椰子死亡类病毒属类病毒的方法，包括如下步骤：
1）将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；
2）将步骤1）得到的标记后产物与权利要求3或4所述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；
3）将步骤2）得到的杂交后芯片扫描，
若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600，且信噪比不小于3.0，则待测植物感染或候选感染椰子死亡类病毒属类病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述标记为以所述cDNA为模板，以权利要求5所述的试剂盒中的任一所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；
步骤2）中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；
在所述步骤2）后和步骤3）前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；
所述至少一条所述探针为所述探针组中的任意一条；
所述待测植物为啤酒花，所述组织为叶片；
所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。
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