CN102168142A

CN102168142A - 大洋臀纹粉蚧的实时荧光pcr引物、探针及检测方法

Info

Publication number: CN102168142A
Application number: CN 201110049923
Authority: CN
Inventors: 焦懿; 徐浪; 余道坚; 陈志粦; 康林
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2011-08-31

Abstract

本发明公开了大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法，本发明设计了适用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR快速检测的引物和寡核苷酸探针，克服了现有形态学鉴定方法检测周期长、需要制作玻片标本和需要丰富经验的缺点，也克服了现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、特异性不强、重复性不好等缺点；由于本发明检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求较强的场合使用。

Description

大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法。

背景技术

大洋臀纹粉蚧Planococcus minor (Maskell)是“中华人民共和国进出境植物检疫性有害生物名录”中的有害生物，同时也是欧洲、美洲等许多国家或地区十分关注的检疫性有害生物。该虫在亚洲、非洲、美洲的许多国家或地区广泛分布，已记录寄主植物多达60余个科共250余种，为害多种水果、林木和观赏植物。主要寄主植物有榴莲、甘橘、葡萄、芒果、香蕉、人心果、西瓜、甜瓜、咖啡、可可、大豆、玉米、马铃薯、观赏花卉植物等。大洋臀纹粉蚧极易随上述寄主植物传入我国，对我国的农业生产构成潜在威胁，因此，需要在口岸检疫部门严格加强检疫工作，防止该虫传入我国。

在蚧虫鉴定中，只有成熟、完整的雌成虫才能进行准确的形态鉴定，若口岸截获到若虫，必须花费较长时间将其饲养为成虫；若截获到不完整的死虫，根本无法鉴定其种类。蚧虫鉴定前，需先将其制作成玻片标本。玻片标本制作的技术性较强，制作人员需经专门培训，才能制作出合格的标本。蚧虫鉴定十分困难，需要经验丰富的蚧虫专家才能准确鉴定其种类。本发明弥补了蚧虫形态学鉴定的不足，可以更为快捷、准确地鉴定出口岸截获的蚧虫是否为大洋臀纹粉蚧。

发明内容

本发明的目的在于提供大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法，旨在解决蚧虫形态鉴定耗时长、鉴定困难的问题。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。

一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其中，所述MGB探针是一段两端分别用不同的染料标记的寡核苷酸，在5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭基团和一个MGB基团，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO.3所示。

所述的用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其中，所述报告荧光基团为荧光染料FAM，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团。

一种检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其中，包括以下步骤：

1）先对大洋臀纹粉蚧及其近似种转录间隔区进行序列测定及比较分析，分别找出大洋臀纹粉蚧不同于其它近似种的独有的碱基位点，然后设计用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的上游引物、下游引物和MGB探针；

2）提取待测样品DNA;

3）设置实时荧光PCR的反应体系：5μl 2×TaqMan^®Gene Expression Master Mix，10pM的上游引物和下游引物各0.25μl，10pM的MGB探针0.2μl，待测样品DNA 1μl，加水补足总体积10μl；同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照；

4）进行实时荧光PCR反应，并检测荧光信号：反应条件为50℃，2min；95℃，10min；95℃，10s；60℃，1min；40个循环；

5）根据荧光信号的检测结果，判断是否为大洋臀纹粉蚧。

所述的检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其中，所述阳性对照为大洋臀纹粉蚧DNA，阴性对照为南洋臀纹粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠萝灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、气生根粉蚧DNA、双条拂粉蚧DNA，空白对照为去离子水。

本发明的有益效果：设计了适用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR快速检测的引物和寡核苷酸探针，克服了现有形态学鉴定方法检测周期长、需要制作玻片标本和需要丰富经验的缺点，也克服了现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、特异性不强、重复性不好等缺点；由于本发明检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求较强的场合使用。

附图说明

图1是本发明实施例中实时荧光PCR检测大洋臀纹粉蚧的荧光信号结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。

TaqMan MGB探针实时荧光PCR是在反应体系中加入一条荧光。TaqMan MGB探针是一段两端分别用不同的染料标记的寡核苷酸，即在5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个非荧光淬灭基团和一个MGB基团。当探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被非荧光淬灭基团吸收。在PCR扩增时，加入一对引物的同时加入一条这种特异性的荧光双标记探针，TaqMan MGB探针同PCR产物杂交，在延伸阶段，Taq酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和非荧光淬灭基团分离，报告荧光基团染料发出的荧光不再转换给非荧光淬灭基团，导致荧光量的增加，荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果以每一个循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线，即扩增曲线。当样品中含有所要检测的靶核酸序列时，所得到的曲线呈“S”形；而当样品中不含靶核酸序列时，则没有发生PCR扩增，探针不被水解，也就检测不到荧光信号，扩增曲线为一水平线。

利用上述TaqMan MGB探针，本发明提供的大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR的检测方法，包括如下步骤：

（1）先对大洋臀纹粉蚧及其近似种转录间隔区（ITS）进行序列测定及比较分析，分别找出大洋臀纹粉蚧不同于其它近似种的独有的碱基位点；

（2）设计大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针；

（3）对所设计的探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出优化的引物和探针，并优化出合适的反应体系和反应条件；

（4）加入上述的引物、探针进行大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR反应；

（5）根据实时荧光PCR结果，判断检测样品是否为大洋臀纹粉蚧。

用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的引物，其序列（SEQ ID NO.1-2）如下：

COI- PM-F：5’-TGCTATTCCTACAAGAATTAAAATCTTTAGA-3’；

COI- PM-R：5’-GACGGGGTATTCCATTTATTCCT-3’。

用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其包括特异性检测大洋臀纹粉蚧的TaqMan MGB探针和特异结合的寡核苷酸序列，其序列（SEQ ID NO.3）如下：

COI-PM-MGB：FAM-CAATTGGATTCATCATTATAT-MGB。

其中，MGB探针的5’端用荧光染料FAM作为报告荧光基团，3’端的MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团。

采用上述检测方法的结果判定标准是：1）若定量PCR仪检测到以大洋臀纹粉蚧DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的蚧虫是大洋臀纹粉蚧；2）若定量PCR仪检测到以大洋臀纹粉蚧DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果报告荧光也没有荧光信号增长，则表示所检测的蚧虫不是大洋臀纹粉蚧。

实施例1 引物和探针的准备

对大洋臀纹粉蚧及其近似种转录间隔区（ITS）进行序列测定及比较分析，设计用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的引物序列如下：

COI- PM-F：5’-TGCTATTCCTACAAGAATTAAAATCTTTAGA-3’；

COI- PM-R：5’-GACGGGGTATTCCATTTATTCCT-3’。

用于大洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的MGB探针的序列如下：

COI-PM-MGB：FAM-CAATTGGATTCATCATTATAT-MGB。

其中，MGB探针的5’端用荧光染料FAM为报告荧光基团，3’端的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针的3’端上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团。

实施例2

利用大洋臀纹粉蚧TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法对进口泰国榴莲Durio zibethinus Murray中截获粉蚧进行鉴定。

所用引物和MGB探针是实施例1中的引物和MGB探针。

利用大洋臀纹粉蚧TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测的过程如下：

1、提取待测样品DNA：将从进口泰国榴莲中发现的粉蚧，按照常规的DNA提取方法进行DNA提取。

2、实时荧光PCR反应，并进行荧光检测：

TaqMan MGB探针实时荧光PCR扩增反应在ABI 7700型PCR仪的96孔板上进行，TaqMan MGB探针荧光PCR的反应体系：5μl 2×TaqMan^®Gene Expression Master Mix，上、下游引物(10pM)各0.25μl，MGB探针(10pM)0.2μl，待测样品DNA 1μl(约10ng)，加水补足总体积10μl。同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照：以大洋臀纹粉蚧DNA为阳性对照、以南洋臀纹粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠萝灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、气生根粉蚧DNA、双条拂粉蚧DNA为阴性对照，以去离子水为空白对照。

PCR反应条件：50℃，2min；95℃，10min；95℃，10s；60℃，1min；40个循环。

根据报告荧光基团的类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录实时荧光PCR检测结果。

3、根据检测结果，判断是否为大洋臀纹粉蚧。

从进口泰国榴莲中发现的粉蚧，按照上述的方法和条件进行检测，实时荧光PCR检测结果为：以大洋臀纹粉蚧DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照报告荧光没有荧光信号增长，而从进口泰国榴莲果实上截获的粉蚧DNA模板的检测结果为阳性，检测结果如图1所示，表明所检测进口泰国榴莲携带的粉蚧为大洋臀纹粉蚧。

采用本发明的方法检测大洋臀纹粉蚧比传统形态学方法更加快速、准确，且易于推广应用。综上所述，采用本发明能对实际检疫和田间调查过程中所发现的粉蚧进行大洋臀纹粉蚧分子生物学鉴定或检测，其意义重大。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。

2.一种用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其特征在于，所述MGB探针是一段两端分别用不同的染料标记的寡核苷酸，在5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭基团和一个MGB基团，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的用于检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其特征在于，所述报告荧光基团为荧光染料FAM，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团。

4.一种检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

2）提取待测样品DNA；

5）根据实时荧光PCR检测结果，判断是否为大洋臀纹粉蚧。

5.根据权利要求4所述的检测大洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其特征在于，所述阳性对照为大洋臀纹粉蚧DNA，阴性对照为南洋臀纹粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠萝灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、气生根粉蚧DNA、双条拂粉蚧DNA，空白对照为去离子水。