CN103255223A - 一种利用est微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法，步骤如下：（1）提取蓟马基因组DNA；（2）以蓟马基因组DNA为模板对其进行PCR扩增；（3）对步骤（2）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明所述的鉴别方法，为筛选西花蓟马与其他3种蓟马提供了简便稳定的分子标记，为今后的西花蓟马的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。

Description

一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法

技术领域

本发明涉及一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

西花蓟马(Frankliniella occidentalis)是一种世界性入侵害虫。除对植物造成危害外，还传播多种植物病毒，给花卉、农作物造成严重损失。西花蓟马已广泛分布于美国、荷兰、日本等60多个国家和地区。在我国于2000年首次在云南省昆明国际花卉节参展的缅甸盆景上截获该虫，2003年在北京温室的辣椒上首次发现其危害，随后在云南、山东、江苏等地陆续被发现。西花蓟马与其他蓟马混合发生，若虫期形态相似，不易区分。有效区分西花蓟马是防治该虫的前期和基础，其对于西花蓟马的综合防控具有重要的理论意义和指导价值。

EST来自转录区，其保守性较高，在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记更高，另外还具有开发简单、快捷、费用低等特点。EST微卫星标记已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面。但利用EST微卫星标记构建区分西花蓟马的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物及方法。

一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

正义引物EST-F：5’-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3’；SEQ ID NO.1

反义引物EST-R：5’-TGGATTTTCTTTACTTTGGT’；SEQ ID NO.2

一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的方法，步骤如下：

（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有234bp的一条条带时，则该被检测样品为西花蓟马；当PCR产物电泳图谱显示无234bp的条带时，则该被检测样品不是西花蓟马。

所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq Buffer（缓冲液）2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

上述步骤（1）中提取蓟马基因组DNA和步骤（3）中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版（北京：科学出版社，2002）。

有益效果

1、本发明所述鉴别西花蓟马的引物能够扩增蓟马基因组DNA中的核基因，为鉴定西花蓟马与其他蓟马提供了简便稳定的分子标记，解决了区分西花蓟马的难题。

2、本发明从分子水平探索了西花蓟马与其他蓟马EST序列的不同，探索建立了西花蓟马的鉴别技术，为今后西花蓟马的种群动态鉴定、生物学以及入侵机制的研究奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中A、花蓟马，B、黄胸蓟马，C、棕榈蓟马，D、西花蓟马，M：DL2000DNA Marker。

图2是实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中A、西花蓟马，B、花蓟马C、黄胸蓟马，D、棕榈蓟马，M：DL2000DNA Marker。

图3是实施例3中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中A、花蓟马，B、黄胸蓟马，C、棕榈蓟马，D、西花蓟马，M：DL2000DNA Marker。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1、2中所述蓟马于2011年采集于山东省济南市；按照（PC Brunner et al.，2002.Amolecular identification key for economically important thrips species(Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-based approach.Agricultural and ForestEntomology，4(2):127-136.）中记载的方法对上述蓟马进行检测，采集于山东省济南市的蓟马分别为花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、西花蓟马。

实施例3中所述蓟马于2011年采集于山东省青岛市；按照（PC Brunner et al.，2002.Amolecular identification key for economically important thrips species(Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-based approach.Agricultural and ForestEntomology，4(2):127-136.）中记载的方法对上述蓟马进行检测，采集于山东省青岛市的蓟马分别为花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、西花蓟马。

实施例所述Tris-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。

实施例1

（1）蓟马基因组DNA的提取

将单头待鉴定样品置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1%SDS（十二烷基硫酸钠），用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，制得基因组DNA溶液。

（2）蓟马COI基因的PCR扩增

以步骤（1）制得的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

基因组DNA溶液：3μl；20μM引物：0.5μl；5U/μl Taq酶：0.5μl；10×Taq Buffer：5μl；10mM dNTP：1μl；ddH₂0补至50μl；

引物序列如下：

正义引物EST-F：5’-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3’；SEQ ID NO.1

反义引物EST-R：5’-TGGATTTTCTTTACTTTGGT’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测。经多个待鉴定样品检测，只有西花蓟马检测出一长度在234bp的条带（如图1所示），花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马中均未检测出长度在234bp条带，经检测，序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2

一种鉴别西花蓟马的方法，步骤如下：

（1）将采集于山东省济南市的单头蓟马个体置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA、1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的EST序列进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

引物序列如下：

正义引物EST-F：5’-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3’；SEQ ID NO.1

反义引物EST-R：5’-TGGATTTTCTTTACTTTGGT’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤（2）制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像胶片上有一条片段长度234bp的条带，该蓟马为西花蓟马；其他3种蓟马在成像胶片上均无234bp的条带，结果如图2所示。与按照（PCBrunner et al.，2002.A molecular identification key for economically important thrips species(Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-based approach.Agricultural and Forest Entomology，4(2):127-136.）中记载的方法进行检测的结果一致。

实施例3

如实施例2所述的鉴别西花蓟马的方法，不同之处在于，所述蓟马于2011年采集于山东省青岛市。

结果显示，成像胶片上有一条片段长度234bp的条带，该蓟马为西花蓟马；其他3种蓟马在成像胶片上均无234bp的条带，结果如图3所示。与按照（PC Brunner et al.，2002.Amolecular identification key for economically important thrips species(Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-based approach.Agricultural and ForestEntomology，4(2):127-136.）中记载的方法进行检测的结果一致。

Claims (4)

1.一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的引物，所述引物为一对，分别为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.一种利用EST微卫星标记鉴别西花蓟马的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有234bp的一条条带时，则该被检测样品为西花蓟马；当PCR产物电泳图谱显示无234bp的条带时，则该被检测样品不是西花蓟马。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq缓冲液2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

Images