CN103088136B - 一种鉴别日光蜂不同遗传支系的引物及鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别日光蜂不同遗传支系的引物及鉴别方法，步骤如下：（1）提取日光蜂基因组DNA；（2）以日光蜂基因组DNA为模板对其线粒体COI基因进行PCR扩增；（3）对步骤（2）制得的PCR产物用限制性内切酶Alu I酶切，得酶切产物；（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选两种遗传支系的日光蜂提供了简便稳定的酶切标记，同时探索建立了两种遗传支系的日光蜂的鉴别技术，为今后的两种遗传支系的日光蜂的种群动态鉴定、生物学以及传播机制的研究奠定了基础。

Description

一种鉴别日光蜂不同遗传支系的引物及鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种基于PCR-RFLP技术鉴别日光蜂遗传支系的引物及鉴别方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

苹果绵蚜Eriosoma lanigerum(Hausmann)是苹果属的重要害虫，也是国内外重要的检疫对象,近年来，在我国危害日趋严重，并有进一步扩大蔓延的趋势。苹果绵蚜主要以无翅胎生蚜聚集在果树枝干的病虫伤口、剪锯口、老皮裂缝、新梢叶腋、短枝果，果实的梗洼、萼洼和果柄以及根部等处寄生危害。被害部位的皮层组织细胞分裂逐渐形成瘤状突起，严重影响果树产量和果实品质，甚至导致整株果树衰竭死亡。苹果绵蚜的寄生性天敌苹果绵蚜蚜小蜂Aphelinus mali（Haldeman），又名日光蜂，属于膜翅目、蚜小蜂科、蚜小蜂属，是寄生苹果绵蚜的内寄生蜂，专一性强，也是我国苹果绵蚜的优势种天敌，在苹果绵蚜的所有天敌中，该寄生蜂对苹果绵蚜的制约作用最大，寄生率高达80%以上。

日光蜂原产于美国和加拿大东部，20世纪20年代从北美洲引种到世界各地，开始用于防治苹果绵蚜。我国于1942年从日本引种到大连，20世纪50年代从苏联引种到青岛，并与当地种杂交。有关日光蜂的遗传分化情况，国内外还未见报道。目前国内日光蜂有Clade1、Clade2两种遗传支系。采用传统测序的方法鉴别日光蜂遗传支系费时，且费用高，不利于日光蜂遗传支系的快速鉴定。精确区分不同遗传支系，进而明确不同遗传支系日光蜂的生物学特性，探究其对苹果绵蚜的寄生能力差异，对于苹果绵蚜的综合防控具有重要的理论意义和指导价值。

PCR-RFLP（限制性片段长度多态性聚合酶链反应）技术，又称为CAPS技术（CleavedAmplilfed Polymorphism Sequences），其基本原理是先利用已知位点的DNA序列资源（基因数据库、基因组或cDNA克隆及克隆的RAPD条带等）设计一套特异性的PCR引物（19～27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。该技术揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。PCR-RFLP是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度-能够揭示单个碱基的差异。另外，由于很多限制性内切酶均可与DNA扩增片段酶切，所以检测到多态性机会较大。

目前利用PCR-RFLP技术构建区分日光蜂遗传支系的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别日光蜂遗传支系的引物及鉴别方法。

一种鉴别日光蜂遗传支系的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

正义引物Clade-F：5’-TCTCATATAATTTGTAATGAAAG-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Clade-R：5’-TGATAACTAGGAGGAAAATTTAT-3’；SEQ ID NO.2

一种鉴别日光蜂遗传支系的方法，步骤如下：

（1）提取日光蜂基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述的一对引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）用限制性内切酶Alu I酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在150bp与600bp左右出现两条带时，为日光蜂遗传支系1（Clade1）；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在150bp、300bp和400bp左右出现三条带时，则为日光蜂遗传支系2（Clade2）。

优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液3μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq Buffer（缓冲液）2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

优选的，所述步骤（3）中限制内切酶Alu I酶切反应条件如下：37℃酶切1小时。

上述步骤（1）中提取日光蜂基因组DNA和步骤（4）中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版（北京：科学出版社，2002）。

有益效果

1、本发明所述鉴别日光蜂遗传支系的引物能够扩增日光蜂基因组DNA中的线粒体COI基因，为鉴定日光蜂鉴别遗传支系1（Clade1）和遗传支系2（Clade2）提供了简便稳定的分子标记，解决了区分遗传支系日光蜂的难题。

2、本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选两种类型日光蜂提供了简便稳定的酶切标记。

3、本发明从分子水平探索了遗传支系日光蜂线粒体COI基因的不同，探索建立了遗传支系日光蜂的鉴别技术，为今后遗传支系日光蜂的种群动态鉴定、生物学以及传播机制的研究奠定了基础。

附图说明

图1是PCR产物未经Alu I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

其中Clade1泳道为遗传支系1的电泳结果、Clade2泳道为遗传支系2的电泳结果，M：2000bp DNA Marker；

图2是实施例1中PCR产物经Alu I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

其中Clade1泳道为遗传支系1的电泳结果、Clade2泳道为遗传支系2的电泳结果，M：2000bp DNA Marker；

图3是实施例2中PCR产物经Alu I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

其中Clade1泳道为遗传支系1的电泳结果、Clade2泳道为遗传支系2的电泳结果，M：2000bp DNA Marker；

图4是实施例3中PCR产物经Alu I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

其中Clade1泳道为遗传支系1的电泳结果、Clade2泳道为遗传支系2的电泳结果，M：2000bp DNA Marker。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1～2中所述日光蜂于2007年采集于山西省运城市；对上述日光蜂进行检测，采集于山西省运城市的日光蜂为遗传支系1和遗传支系2。

实施例3中所述日光蜂于2007年采集于山西省长治市；对上述日光蜂进行检测，采集于山西省长治市的日光蜂为遗传支系1和遗传支系2。

实施例4中所述日光蜂于2007年采集于辽宁省大连市；对上述日光蜂进行检测，采集于大连市的日光蜂均分为遗传支系2。

实施例所述Alu I内切酶、Tris-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。

实施例1

（i）日光蜂基因组DNA的提取

将单头日光蜂置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1%SDS（十二烷基硫酸钠），用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，制得日光蜂基因组DNA溶液。

（ii）日光蜂COI基因的PCR扩增

以日光蜂基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

日光蜂基因组DNA溶液：3μl；20μM引物：0.5μl；5U/μl Taq酶：0.25μl；10×Taq Buffer：2.5μl；10mM dNTP：0.5μl；ddH₂0补至25μl；

引物序列如下：

正义引物Clade-F：5’-TCTCATATAATTTGTAATGAAAG-3’；

反义引物Clade-R：5’-TGATAACTAGGAGGAAAATTTAT-3’；

PCR扩增条件如下：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（iii）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测，均检测出一长度在700bp左右条带（如图1所示），对该条带进行双向测序，发现采集的日光蜂有两个遗传支系，遗传支系1得到的条带序列如SEQ ID NO.3所示，日光蜂遗传支系2得到的条带序列如SEQ ID NO.4所示。

（iv）利用限制性内切酶酶切位点分析软件WatCut(该分析软件可登陆如下网址使用http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=restriction_new)，分析可得遗传支系1有一个酶切位点，遗传支系2有两个酶切位点（酶切位点AGCT）。

实施例2

一种鉴别日光蜂遗传支系的方法，步骤如下：

（1）将采集于山西省运城市的单头日光蜂个体置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA、1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

基因组DNA溶液3μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer 2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，ddH₂0补至25μl；

引物序列如下：

正义引物Clade-F：5’-TCTCATATAATTTGTAATGAAAG-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Clade-R：5’-TGATAACTAGGAGGAAAATTTAT-3’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用限制性内切酶Alu I酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

酶切体系如下：10×NEB缓冲液2μl；PCR扩增产物7μl；Alu I内切酶0.4μl。

反应条件如下：37℃水浴3小时。

（4）用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤（3）制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，PCR产物电泳图谱显示被测样品在150bp与600bp左右出现两条带时，为日光蜂遗传支系1；PCR产物电泳图谱显示被测样品在150bp、300bp和400bp左右出现三条带时，则为日光蜂遗传支系2，结果如图2所示。

实施例3

如实施例1所述的鉴别日光蜂遗传支系的方法，不同之处在于，所述日光蜂于2007年采集于山西省长治市。

结果显示，PCR产物电泳图谱显示被测样品在150bp与600bp左右出现两条带时，为日光蜂遗传支系1；PCR产物电泳图谱显示被测样品在150bp、300bp和400bp左右出现三条带时，则为日光蜂遗传支系2，结果如图3所示。

实施例4

如实施例1所述的鉴别日光蜂遗传支系的方法，不同之处在于，所述日光蜂于2007年采集于辽宁省大连市。

结果显示，PCR产物电泳图谱显示被测样品在150bp、300bp和400bp左右出现三条带，都为日光蜂遗传支系2，结果如图4所示。

Claims (5)

1.一种鉴别日光蜂遗传支系的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。 

2.一种鉴别日光蜂遗传支系的方法，其特征在于，步骤如下： 

（1）提取日光蜂基因组DNA，得基因组DNA溶液； 

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的一对引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； 

（3）用限制性内切酶Alu I酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物； 

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在400bp左右没有条带时，为日光蜂遗传支系1；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在400bp左右有条带时，则为日光蜂遗传支系2。 

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为： 

基因组DNA溶液3μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq缓冲液2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，ddH₂0补至25μl。 

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下： 

94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。 

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中限制内切酶Alu I酶切反应条件如下：37℃酶切1小时。 

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