KR101047322B1 - 앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ｄｎａ 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명의 뱀장어 유전자 감별법은 뱀장어 종간의 다형성 및 특정 서열의 반복횟수를 PCR을 이용하여 정확하게 구분할 수 있으므로 미량의 뱀장어 조직을 이용하여 간편하고 신속한 방법으로 국내산 실뱀장어와 외국산 실뱀장어를 정확하게 판별할 수 있다.

뱀장어, 유전자 감별법, RAPD, SCAR, PCR, 다형성

Description

앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ＤＮＡ 마커{DNA markers for identification of Anguilla eel species}

본 발명은 형태학적 특성으로 구분이 매우 어려운 국내산 뱀장어(A. japonica)와 외국산 뱀장어(A. bicolor bicolor , A. anguilla, A. rostrata)를 신속 정확하게 구분할 수 있는 유전자 감별법에 관한 것이다.

뱀장어는 동부 아시아에서 가장 선호하는 강장식품 중 하나이며 비타민 A, 타우린 및 도코사헥사에노산(docosahexaenoic acid) 및 에코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid) 등의 불포화 지방산이 풍부하다. 뱀장어는 1960년에 최초로 국내 농업 기술 개발을 위하여 들여왔다. 국내 종의 하나인 앵귈라 자포니카(Anguilla japonica)는 한국 수산 시장에서 가장 상업적으로 가치 있는 수종이다. 그러나 매년 상기 국내산 뱀장어(앵귈라 자포니카)는 포획량이 감소하여 국내에서 생산된 성어만으로는 수요를 충족할 수 없는 실정이다. 뱀장어 양식 어업인들은 수년 전부터 값싼 유럽산(앵귈라 앵귈라, A. anguilla), 북미산(앵귈라 로스트라타, A. rostrata) 및 적도산(앵귈라 바이칼라 바이칼라, A. bicolor bicolor) 실뱀장어를 외국으로부터 대량으로 국내에 이식하고 있다.

에지에 의해 설명되고[Ege V, (1939) Dana-Report Carlsberg Foundation 16, 1-256], 캐슬 등에 의해 수정된[Castle PHJ. et al.(1974) Copeia 2, 569570] 전통적 장어 분류표는 앵귈라 속을 15개 종으로 분류하고, 그 중 세 종은 두 개의 하위 종으로 더 세분화된다. 한국 시장에 가장 일반적으로 유통되는 4개의 앵귈라 종은 앵귈라 자포니카, 앵귈라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타 및 앵귈라 앵귈라이다. 앵귈라 자포니카의 경우 국내 생산 종의 뛰어난 신선도와 안전 때문에 다른 앵귈라 종보다 높은 가격에 거래되고 있다.

뱀장어는 <동의보감>에서는 옛 말로 배얌당어, <난호어목>과 <전어지>에서는 배가 하얀 까닭에 백선, 뱀과 비슷하여 뱀고기라고도 불렀다고 한다. 보통 60~70 ㎝ 정도이며 최대 1 m 정도까지 성장한다.

뱀장어는 산란을 위해 하류로 내려가는 독특한 생활주기 물고기의 연구 모델로서 주목받고 있다[Gagnaire PA. et al.(2007) J. Fish Biol. 71, 279-287]. 생물 연구 목적을 위해서도, 모호하지 않은 수종 식별 방법을 정립할 필요가 있다. 상기 앵귈라 뱀장어는 모든 뱀-유사 종에서처럼, 매우 종-특이적인 생태학적 및 형태학적 특징을 가진다[Tesch FW (1999) Verlag Paul Parey, Hamberg]. 그들의 생태학적 및 형태학적 특징은 비교적 서로 유사하다. 캐슬 등에 의해 기술된 형태학적 특징에 대한 간단한 설명은[Castle PHJ. et al.(1974) Copeia 2, 569570], 수종 간의 차이점을 직접적으로 파악할 수 없기 때문에 유생(leptocephalus) 및 실뱀장 어의 식별 단계에서 오인의 가능성이 크다고 기재하였다[Miller ML. et al.(2004) An introduction to the Leptocephali: Biology and Identificaion. Ocean Research Institute, The University of Tokyo, Tokyo; Watanabe S. et al.(2004) Mar. Biotech . 6, 566-574]. 이에, 형태학적 분화가 일어나기 전에, 앵귈라 종의 차이점을 식별하기 위한 더욱 강력한 기술이 요구된다.

중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 기법은 특이적 또는 비특이적 DNA 단편을 증폭시키는 방법이다[Mullis KB. et al.(1987) Methods Enzymol 155, 335-350; Saiki RK. et al.(1985) Science 230, 1350-1354]. 최근 몇 년간 PCR-기반 기술은 생물종 동정에 널리 사용되고 있다. 앵귈라 로스트라타와 앵귈라 앵귈라는 너무 밀접하여 미토콘드리아 DNA 분석을 통해서도 그들을 구분하기가 쉽지 않으나[Avise JC. et al.(1986) Proceedings of the National Academy of Science , USA, 83, 43504354]고 보고되었다. 그래서 5S rDNA 프라이머를 이용한 PCR을 이용하여 구분될 수 있다[Nieddu M. et al.(1998) Genome 41, 728-732]. 또한, 앵귈라 앵귈라와 앵귈라 자포니카를 구분하는데 단염기 다형성(SNP) 기반-PCR도 사용되고 있다[Itoi S. et al.(2005) Fisheries Sci . 71, 1356-1364]. 그러나 앵귈라 자포니카, 앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타 및 앵귈라 앵귈라 사이에서 명확하게 차이점을 구별할 수 있는 방법은 아직 없다. 또한, 미토콘드리아 DNA 단편의 PCR-증폭을 통하여 제한효소 절편길이 다형성(restriction flagment-lengh polymorphism, RFLP) 분석이 뱀장어 종의 구별에 유용하게 쓰일 수 있지만, 이러한 방법은 부계의 정보를 가지고 있지 않아 여전히 종내 다형성[Gagnaire PA. et al.(2007) J. Fish Biol . 71, 279-287] 및 자연적 교잡종의 가능성[Albert V. et al.(2006) Mol . Ecol. 15, 1903-1916; Frankowski J. et al.(2008) Biol . Invasions (Online version)]의 문제를 해결할 수 없다.

랜덤 프라이머를 사용한 임의 증폭 DNA 다형성(random amplified polymorphic DNA, RAPD)-PCR은 DNA 서열에 대한 사전 지식 없이, 유전체 간의 DNA 다형성을 성공적으로 찾아낼 수 있다[Welsh J. et al.(1990) Nucleic Acids Res 18: 7213-7218]. 또한, 미토콘드리아 DNA의 모계 유전의 단점을 극복할 수 있다.

보존된 서열을 증폭할 때 사용되는 특이적 프라이머의 디자인을 위하여 RAPD 단편으로부터 정보를 얻는 것은 바람직하지 않다[Garner KJ. et al.(1996) Insect Mol. Biol. 5, 81-91; Ouellet T. et al.(1993) Phytopathology 83, 10031007; Paran I. et al.(1993) Theor . Appl . Genet. 85, 985993]. RAPD 마커를 서열 특이적 증폭 부위(sequence-characterized amplified region, SCAR) 마커로 변환하는 것은 생물체 인증[Dnyaneshwar W. et al.(2006) Biol . Phar . Bull. 29, 2313-2316; Adinolfi B. et al.(2007) Fitoterapia 78, 43-43], 마커-연관 선별을 포함하는 다른 유전학적 응용[Aranead C. et al.(2005) Aquaculture 247, 67-73]에 성공적으로 사용되어 왔다.

외국산 뱀장어가 국내산으로 둔갑하여 유통되는 것을 방지하여 뱀장어 시장의 유통질서를 확립하고, 국민에게 안정적인 수산물 공급하며, 국내산 뱀장어 양식어업인을 보호하기 위하여, 국내산 뱀장어와 외국산 뱀장어를 정확하게 판별할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은, 앵귈라 속의 형태학적 차이를 이용한 분류 방법의 한계를 극복하기 위하여 민감하고 강력한 PCR 방법을 기반으로, 앵귈라 뱀장어(Anguilla eel) 종간의 차이를 판별할 수 있는 유전자 감별법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. 이로써, 외국산 뱀장어가 국내산으로 둔갑하여 유통되는 것을 방지할 수 있어 뱀장어 시장의 유통질서를 확립하고 국민에게 안정적인 수산물 공급할 수 있으며, 국내산 뱀장어 양식어업인을 보호할 수 있다.

본 발명의 목적은 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되고, 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 뱀장어 판별용 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 뱀장어 판별용 키트를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 이용하여 뱀장어의 수종을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되고, 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 뱀장어 판별용 프라이머 쌍을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 뱀장어 판별용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 이용하여 뱀장어의 수종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명은 외국산 뱀장어가 국내산으로 둔갑하여 유통되는 것을 방지할 수 있어 뱀장어 시장의 유통질서를 확립하고 국민에게 안정적인 수산물 공급할 수 있으며, 국내산 뱀장어 양식어업인을 보호할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 앵귈라 자포니카(Anguilla japonica) 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2로 기재되는 앵귈라 바이칼라 바이칼라(A. bicolor bicolor) 및 앵귈라 로스트라타(A. rostrata) 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3으로 기재되는 앵귈라 앵귈라(A. anguilla) 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4로 기재되는 앵귈라 자포니카 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5로 기재되는 앵귈라 바이칼라 바이칼라 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드; 및, 서열번호 6으로 기재되는 앵귈라 로스트라타 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 국내산 뱀장어(앵귈라 자포니카)와 외국산 뱀장어(앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타, 앵귈라 앵귈라)의 게놈 DNA에 대하여, 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 임의 증폭 DNA 다형성(random amplified polymorphic DNA, RAPD)―PCR을 수행한 후, 종간 특이적인 증폭 양상을 보이는 350 bp 내지 400 bp 및 500 bp 내지 600 bp의 PCR 밴드를 분리하였다(도 1 참조). 상기 PCR 산물의 길이 및 염기서열을 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.

PCR 산물	앵귈라 자포니카	앵귈라 바이칼라 바이칼라	앵귈라 로스트라타	앵귈라 앵귈라
500 bp~600 bp	서열번호 1 (577 bp)	서열번호 2 (540 bp)	서열번호 2 (540 bp)	서열번호 3 (509 bp)
350 bp~400 bp	서열번호 4 (362 bp)	서열번호 5 (375 bp)	서열번호 6 (375 bp)	서열번호 7 (375 bp)

상기 서열번호 1 내지 3의 염기서열을 조사한 결과, 특정 폴리뉴클레오티드 반복 서열의 개수 차이에 의해 DNA 단편의 길이에 차이가 생긴 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 상기 서열번호 4 내지 7을 조사한 결과, 앵귈라 자포니카에서 13개 뉴클레오티드가 결손(deletion)되어있는 것을 확인하였다(도 3 참조). 상기 350 bp~400 bp PCR 산물의 염기서열 분석 결과, 다형성으로 인해 각 뱀장어 종의 게놈 DNA에서 제한효소 부위에 차이가 있음을 알았다. 앵귈라 바이칼라 바이칼라는 MaeI 사이트를 가지지만, 나머지 세 종은 가지지 않고, 앵귈라 자포니카는 TaqI 사이트가 없지만 나머지 세 종에는 존재한다. 이런 특성을 근거로 서열 특이적 증폭 부위(sequence-characterized amplified region, SCAR) 마커를 개발하고자, 서열번호 4 내지 7의 폴리뉴클레오티드 서열 내의 특정 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 제작하였다(도 3 참조). 이때, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 산물의 길이가 종간 차이가 생길 수 있도록 제작하거나[서열번호 9(A1F)/서열번호 10(A1R)], 결손 부위를 인지하는 프라이머를 제작하여 결손된 부위가 있는 DNA는 증폭이 되지 않도록 하거나[서열번호 11(A2F)/서열번호 12(A2R)], 제한효소로 절단하였을 때 DNA 절편의 길이에 차이가 생길 수 있도록 제작하였다[서열번호 9(A1F)/서열번호 10(AR)과 서열번호 13(A3F)/서열번호 14(A3R)]. 이후, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍을 이용하여 계통 간의 PCR 밴드 크기가 차이를 나타내는 것을 확인하였고, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍을 이용하여 결손이 있는 앵귈라 자포니카에서 증폭이 되지 않는 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍을 이용하여 얻은 PCR 산물을 TaqI 및 MaeI으로 처리하여 앵귈라 자포니카와 앵귈라 바이칼라 바이칼라에서만 각각 다른 절단 패턴을 보이는 것을 확인하였고, 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 얻은 DNA를 Tru9I 제한효소로 절단하여 DNA 절편 길이에 차이가 있음을 확인하였다(도 5 참조).

이로써, 상기 DNA 마커들을 활용하여 국내산 뱀장어와 외국산 뱀장어를 판별할 수 있었을 뿐만 아니라, 상기 결과들을 조합하여 앵귈라 뱀장어 4 종을 정확히 구분할 수 있었다.

이에, 본 발명의 서열번호 1 내지 7의 폴리뉴클레오티드는 뱀장어의 수종 판별 용으로 유용하게 쓰일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 4 내지 서열번호 7로 기재되는 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에서 선택되며, 서열번호 4 내지 서열번호 7 또는 그에 상보적인 서열에 공통적으로 엄격한 조건하에서 혼성화되는 15~50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 뱀장어 판별용 프라이머 쌍을 제공한다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중에서 임의로 선택될 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어 32℃에서의 5X SSC, 5X denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃에서의 5X SSC, 5X denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃에서의 5X SSC, 5X denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

상기 프라이머 쌍은 본 발명의 서열번호 4 내지 7의 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있도록 설계된 15 내지 50머의 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 15 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 가능하나, 바람직하게는 상기 프라이머 쌍은 서열번호 9(A1F) 및 서열번호 10(A1R)과 서열번호 13(A3F) 및 서열번호 14(A3R)로 기재된 프라이머 쌍으로 구성된다.

또한, 본 발명은 서열번호 5 내지 서열번호 7로 기재되는 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에서 선택되며, 서열번호 5 내지 서열번호 7 또는 그에 상보적인 서열에 공통적으로 엄격한 조건하에서 혼성화하되, 서열번호 4 또는 그의 상보적인 서열에는 하이브리드하지 않는 올리고뉴클레오티드를 적어도 하나 이상 포함하는 앵귈라 자포니카(국내산 뱀장어) 판별용 프라이머 쌍을 제공한다.

상기 프라이머 쌍은 본 발명의 서열번호 4 내지 7의 뱀장어 판별용 게놈 DNA 유래 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있으나, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드는 증폭할 수 없도록 설계된 15 내지 50머의 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 15 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 가능하나, 바람직하게는 상기 프라이머 쌍은 서열번호 11(A2F) 및 서열번호 12(A2R)로 기재된 프라이머 쌍으로 구성된다.

상기 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 각 앵귈라 뱀장어의 서열번호 및 길이를 표 2와 같다.

정방향 프라이머	역방향 프라이머	앵귈라 자포니카	앵귈라 바이칼라 바이칼라	앵귈라 로스트라타	앵귈라 앵귈라
서열번호 9 (A1F)	서열번호 10 (A1R)	서열번호 15 (290 bp)	서열번호 16 (303 bp)	서열번호 17 (303 bp)	서열번호 18 (303 bp)
서열번호 11 (A2F)	서열번호 12 (A2R)	-	서열번호 19 (243 bp)	서열번호 20 (243 bp)	서열번호 21 (243 bp)
서열번호 13 (A3F)	서열번호 14 (A3R)	서열번호 22 (130 bp)	서열번호 23 (130 bp)	서열번호 24 (130 bp)	서열번호 25 (130 bp)

또한, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍을 포함하는 국내산 뱀장어 판별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 추가로 제한효소를 포함할 수 있으며, 상기 제한효소는 TaqI인 것이 바람직하지만 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍을 및 뱀장어의 내재 유전자에 대한 프라이머 쌍을 포함하는 국내산 뱀장어 판별용 키트를 제공한다.

상기 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍 및 뱀장어의 내재유전자에 대한 프라이머 쌍을 동시에 사용하여 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 수행할 수 있다. 이 경우 복수 프라이머의 상호 작용을 계산하여 프라이머가 다이머(dimer)를 형성하지 않는 프라이머 조합을 만들어야 한다. 또 복수의 PCR 산물 크기를 아가로즈 겔에서 충분히 구별할 수 있어야 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍 및 제한효소를 포함하는 뱀장어 판별용 키트를 제공한다.

상기 제한 효소는 TaqI 또는 MaeI인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍 및 제한효소를 포함하는 뱀장어 판별용 키트를 제공한다.

상기 제한효소는 TaqI, MaeI 및 Tru9I인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다.

상기 키트들은 DNA 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 DNA 추출용 시약, 데옥시뉴클레오티드, DNA 증폭 반응에 적합한 열안정성 폴리머라제 및 핵산의 표지화 및 검출용 시약을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 뱀장어로부터 DNA를 분리하는 단계;

2) 상기 DNA를 주형으로 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

3) 단계 2)의 PCR 산물 중, 500 bp 내지 600 bp의 PCR 산물의 길이 또는 염기서열을 분석하는 단계; 및,

4) 상기 분석 결과로부터

ⅰ) 길이가 577 bp이거나 염기서열이 서열번호 1로 구성된 경우, 앵귈라 자포니카로;

ⅱ) 길이가 540 bp이거나 염기서열이 서열번호 2로 구성된 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라 또는 앵귈라 로스트라타로; 및,

ⅲ) 길이가 509 bp이거나 염기서열이 서열번호 3으로 구성된 경우, 앵귈라 앵귈라로 판별하는 단계를 포함하는, 앵귈라 뱀장어(Anguilla eel) 종의 판별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 뱀장어로부터 DNA를 분리하는 단계;

2) 상기 DNA를 주형으로 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

3) 단계 2)의 PCR 산물 중, 350 bp 내지 400 bp의 PCR 산물의 길이 또는 염기서열을 분석하는 단계; 및,

4) 상기 분석 결과로부터

ⅰ) 길이가 362 bp이거나 염기서열이 서열번호 4로 구성된 경우, 앵귈라 자포니카로;

ⅱ) 길이가 375 bp이거나 염기서열이 서열번호 5로 구성된 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라로;

ⅲ) 길이가 375 bp이거나 염기서열이 서열번호 6로 구성된 경우, 앵귈라 로스트라타로; 및,

ⅳ) 길이가 375 bp이거나 염기서열이 서열번호 7로 구성된 경우, 앵귈라 앵귈라로 판별하는 단계를 포함하는, 앵귈라 뱀장어 종의 판별 방법을 제공한다.

상기 단계 3) 이후에

3-1) 상기에서 분석한 DNA를 TaqI으로 절단하는 단계;

3-2) 절단 여부 및 DNA 절편의 길이를 분석하는 단계;

3-3) 상기 분석 결과로부터

ⅰ) 절단되지 않으면 앵귈라 자포니카로,

ⅱ) DNA 절편의 길이가 171 bp 및 132 bp인 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타, 또는 앵귈라 앵귈라로 판별하는 단계

및/또는

3-1) 상기에서 분석한 DNA를 MaeI으로 절단하는 단계;

3-2) 절단 여부 및 DNA 절편의 길이를 분석하는 단계;

3-3) 상기 분석 결과로부터

ⅰ) 절단되지 않으면 앵귈라 자포니카, 앵귈라 로스트라타, 또는 앵귈라 앵귈라로,

ⅱ) DNA 절편의 길이가 274 bp 및 29 bp인 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 뱀장어로부터 DNA를 분리하는 단계;

2) 상기 DNA를 주형으로 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 프라이머 쌍 및 뱀장어의 내재유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍의 혼합물을 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

3) 단계 2)의 PCR 산물의 증폭 여부 및 길이를 분석하는 단계; 및,

4) 상기 분석 결과로부터,

ⅰ) 뱀장어의 내재유전자만 증폭되었을 경우, 국내산 뱀장어(앵귈라 자포니카)로; 및,

ⅱ) 길이가 243 bp인 경우, 외국산 뱀장어(앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타 및 앵귈라 앵귈라)로 판별하는 단계를 포함하는, 국내산 뱀장어의 판별 방법을 제공한다.

상기 단계 3) 이후에

3-1) 서열분석을 추가로 실시하는 단계; 및,

3-2) 상기 분석 결과로부터,

ⅰ) 염기서열이 서열번호 19로 구성된 경우, 외국산 뱀장어(앵귈라 바이칼라 바이칼라)로;

ⅱ) 염기서열이 서열번호 20로 구성된 경우, 외국산 뱀장어(앵귈라 로스트라타)로; 및,

ⅲ) 염기서열이 서열번호 21로 구성된 경우, 외국산 뱀장어(앵귈라 앵귈라)로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명은 1) 뱀장어로부터 DNA를 분리하는 단계;

2) 상기 DNA를 주형으로 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

3) 단계 2)의 PCR 산물을 Tru9I로 절단하는 단계;

4) DNA 절편의 길이를 분석하는 단계; 및,

5) 상기 분석 결과로부터,

ⅰ) DNA 절편의 길이가 71 bp, 34 bp 및 25 bp인 경우, 앵귈라 로스트라타로,

ⅱ) DNA 절편의 길이가 96 bp 및 34 bp인 경우, 앵귈라 자포니카, 앵귈라 바이칼라 바이칼라, 또는 앵귈라 앵귈라로 판별하는 것을 특징으로 하는, 앵귈라 뱀장어 종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 뱀장어의 유전자 감별 방법을 이용하여 우리나라에 수입되고 있는 실뱀장어와 국내산 실뱀장어의 구분이 가능하였으며, 또한, 수입한 뱀장어 간에서도 종 구분이 가능하였으므로, 본 발명의 뱀장어의 유전자 감별용 키트를 사용하여 신속하고 정확하게 국내산 뱀장어와 외국산 뱀장어를 판별할 수 있다.

이로써, 본 발명의 뱀장어의 유전자 감별 방법을 이용하여 우리나라에 수입되고 있는 실뱀장어와 국내산 실뱀장어의 구분이 가능하였으며, 또한, 수입한 뱀장어 간에서도 종 구분이 가능함을 확인하였다. 따라서 본 발명의 뱀장어 유전자 감별 방법은 PCR이라는 간편하고 신속한 방법을 이용하여 정확하게 국내산 뱀장어와 외국산 뱀장어를 구분할 수 있는 방법이다. 아울러, 본 발명의 감별 방법은 미토콘드리아 DNA를 이용하는 방법이 아니라 게놈 DNA를 이용하는 판별법으로 뱀장어 종간 교잡종의 구분도 가능할 것으로 사료된다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 뱀장어의 게놈 DNA 분리

남부내수면연구소에서 얻은 일본 뱀장어(국내산 뱀장어, Japanese eel, Anguilla japonica), 인도네시아 쇼트핀 뱀장어(Indonesian shortfin eel, Anguilla bicolor bicolor), 유럽 뱀장어(European eel, Anguilla anguilla) 및 미국 뱀장어(American eel, Anguilla rostrata) 각 4마리를 본 발명에서 사용하였다. 실뱀장어(또는 유리뱀장어)를 통째로 95% 에탄올에 유전자 분석을 위하여 보관하였다. 게놈 DNA를 TNES-요소 버퍼 방법[(Asahida T. et al.(1996) Fisheries Sci. 62:727-730]을 사용하여 근육과 지느러미로부터 추출하였다.

실시예 2: 뱀장어 게놈 DNA 의 RAPD 분석

<2-1> RAPD - PCR

각 뱀장어 수종별 임의 증폭 DNA 다형성(random amplified polymorphic DNA, RAPD)-PCR 밴드 패턴의 차이를 보기위해 하기 실험을 수행하였다. 임의 증폭 DNA 다형성(random amplified polymorphic DNA, RAPD) 분석을 위한 PCR 조건 및 프라이머는 강 등[Kang, H. W. et al.(2002) Mol. Cells 13:281-287]에 의해 발표된 내용을 알맞게 각색하여 사용하였다. 실시예 1에서 추출한 게놈 DNA 50 ng, 서열번호 8로 기재되는 유니버셜 라이스 프라이머 4(universal rice primer 4, URP4, 도 2)(5-AGGACTCGATAACAGGCTCC-3) 200 ng, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% 젤라틴, dNTP 각 200 및 Taq DNA 폴리머라제(Promega, 미국) 2.5 유니트를 사용하여 50 ㎕ 볼륨으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성해 주고, 95℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 2분의 조건으로 35 회전을 돌린 후, 72℃에서 7분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃로 냉각시켜주었다. 상기의 반응 완료 후 생성된 PCR 산물을 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동 시킨 뒤, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)로 염색하여 관찰하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 350 bp 내지 400 bp 및 500 bp 내지 600 bp의 PCR 밴드에서, 4 종류의 뱀장어 간에 PCR 밴드 패턴에 차이가 나는 것을 확인하였다.

<2-2> PAPD 단편의 클로닝 및 서열분석

실시예 2-1에서 확인한 밴드 패턴의 차이를 정확히 분석하기 위하여, 상기 실시예 2-1의 PCR 산물 중 350 bp 내지 400 bp 및 500 bp 내지 600 bp의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, 미국)을 사용하여 아가로즈 겔로부터 용출하여 임의 증폭 DNA 다형성(random amplified polymorphic DNA, RAPD)-PCR 분석에 사용하였다. 상기 용출된 DNA 단편을 pGEM-T Vector System II(Promega)를 사용하여 pGEM-T 벡터에 삽입한 후, E. coli DH5 적격 세포(competent cell)에 형질전환시킨 다음, 흰 콜로니를 선별하여 배양하였다. 이후, QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)을 사용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 상기 플라스미드 DNA를 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems, 미국)으로 서열분석을 수행하였다(ABI 3100xl automated sequencer, Applied Biosystems).

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 실시예 2-1에서 500 bp 내지 600 bp 길이였던 PCR 산물을 클로닝한 경우, 앵귈라 자포니카(서열번호 1)는 577 bp, 앵귈라 바이칼라 바이칼라(서열번호 2) 및 앵귈라 로스트라타(서열번호 3)는 540 bp, 앵귈라 앵귈라(서열번호 3)는 509 bp의 폴리뉴클레오티드 길이인 것을 확인하였다. 상기의 DNA 길이의 차이는 37 bp의 폴리뉴클레오티드 반복 서열(도 2에서 박스로 표시된 부분)의 반복 개수의 차이에 기인한 것으로 앵귈라 자포니카는 10번 반복, 앵 귈라 바이칼라 바이칼라와 앵귈라 로스트라타 뱀장어는 9번 반복, 앵귈라 앵귈라 뱀장어는 8번이 반복되어 있음을 서열분석을 통하여 확인하였다.

또한, 도 3에서 나타난 바와 같이 대략 370 bp의 길이였던 PCR 산물을 클로닝한 경우, 앵귈라 자포니카(서열번호 4)는 362 bp, 앵귈라 바이칼라 바이칼라(서열번호 5), 앵귈라 로스트라타(서열번호 6) 및 앵귈라 앵귈라(서열번호 7)는 375 bp의 폴리뉴클레오티드 길이인 것을 확인함으로써, 국내산 뱀장어는 외국산 뱀장어와 비교하여 13 bp가 결손(deletion)되어 있음을 확인하였다. 또한, 상기 서열번호 4 내지 7을 조사한 결과, 다형성으로 인해 각 뱀장어 종의 게놈 DNA에서 제한효소 부위에 차이가 있음을 알았다. 앵귈라 바이칼라 바이칼라는 MaeI 사이트를 가지지만, 나머지 세 종은 가지지 않고, 앵귈라 자포니카는 TaqI 사이트가 없지만 나머지 세 종에는 존재하며, 앵귈라 로스트라타에는 Tru9I 사이트가 있지만, 나머지 세 종에는 없었다.

실시예 3: 뱀장어 게놈 DNA 의 RAPD 마커를 SCAR 마커로 변환

클로닝된 RAPD 마커를 서열 특이적 증폭 부위(sequence-characterized amplified region, SCAR) 분석을 위한 단일-부위 PCR 마커로 변환하기 위하여, 상기 서열번호 4 내지 7의 폴리뉴클레오티드 서열 내의 특정 부위를 증폭할 수 있는 세 가지 특이적 프라이머 쌍을 구상하였다(도 3). 구체적으로, 실시. 이때, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 산물의 길이가 계통 간 차이가 생길 수 있도록 제작하거나[서열번호 9(A1F)/서열번호 10(A1R)], 결손 부위를 인지하는 프라이머를 제작하여 결손된 부위가 있는 DNA는 증폭이 되지 않도록 하거나[서열번호 11(A2F)/서열번호 12(A2R)], 제한효소로 절단하였을 때 DNA 절편의 길이에 차이가 생길 수 있도록 제작하였다[서열번호 13(A3F)/서열번호 14(A3R)]:

1)A1F(서열번호 9): (5-TTTCAGGCACCCAATCTACCA-3) 및

A1R(서열번호 10): (5-CGTGTATAGCCATTCAACTCC-3),

2)A2F(서열번호 11): (5-ACAGAAAGCAGCATTTGAAG-3)및

A2R(서열번호 12): (5-TACGTGTATAGCCATTCAAC-3),

3)A3F(서열번호 13): (5-CAGCAAACCGCCAAACAA-3) 및

A3R(서열번호 14): (5-TTTGGAGTGAGATAACTGAG-3).

실시예 1에서 추출한 게놈 DNA 50 ng, 프라이머 각 5 pmol, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, dNTP 각 0.2 mM 및 Taq DNA 폴리머라제 0.2 유니트(Takara, 일본)을 사용하여 20 ㎕ 볼륨으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성해 주고, 94℃ 30초, 60℃(A1F/A1R 프라이머 쌍), 60℃(A2F/A2R 프라이머 쌍) 또는 55℃ (A3F/A3R 프라이머 쌍) 30초, 72℃ 30초의 조건으로 35 회전을, 72℃에서 10분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃로 냉각시켜주었다. 상기의 반응 완료 후 생성된 PCR 산물을 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동 시킨 뒤, 염색하여 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 A1F/A1R 프라이머 쌍의 PCR 패턴에서 앵귈라 자포니카(레인 1 내지 4)는 290 bp의 PCR 산물이 생성되었고, 앵귈라 바이칼 라 바이칼라(레인 5 내지 8), 앵귈라 로스트라타(레인 9 내지 12), 앵귈라 앵귈라(레인 13 내지 16)는 303 bp의 PCR 산물이 생성되었다(도 4A), 또한, A2F/A2R 프라이머 쌍의 PCR 패턴에서 앵귈라 자포니카는 PCR 산물이 생성되지 않았고, 앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타, 앵귈라 앵귈라는 243 bp의 PCR 산물이 생성되었다(도 4B)

실시예 4: SCAR - PCR 단편의 제한효소 처리

실시예 3에서 수득한 A1F/A1R 프라이머 쌍의 PCR 산물을 TaqI(roche, 스위스)또는 MaeI(roche, 스위스) 제한효소로 각각 65℃ 및 45℃에서 처리하여 절단하였다. 또한, A3F/A3R 프라이머 쌍의 PCR 산물을 Tru9I(roche, 스위스) 제한 효소로 65℃에서 처리하여 절단하였다. 상기의 반응에서 생성된 DNA 단편을 3% 메타포 아가로즈 겔(FMC BioProducts, 미국)에서 전기영동 시킨 뒤, 염색하여 관찰하였다. A1F/A1R 프라이머 쌍의 PCR 산물을 TaqI으로 절단한 경우는 도 5A에, A1F/A1R 프라이머 쌍의 PCR 산물을 MaeI으로 절단한 경우는 도 5B에, A3F/A3R 프라이머 쌍의 PCR 산물을 Tru9I으로 절단한 경우는 도 5C에 관찰 결과를 나타내었다.

그 결과, 도 5A에서 나타난 바와 같이 앵귈라 자포니카는 절단되지 않았고, 앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타 및 앵귈라 앵귈라는 171 bp 및 132 bp의 DNA 단편으로 절단되었다. 또한, 도 5B에서 나타난 바와 같이, 앵귈라 자포니카, 앵귈라 로스트라타 및 앵귈라 앵귈라는 절단되지 않았고, 앵귈라 바이칼라 바이칼라는 274 bp 및 29 bp DNA 단편으로 절단되었다. 아울러, 도 5C에서 나타난 바와 같이, 앵귈라 로스트라타는 71 bp, 34 bp 및 25 bp의 DNA 단편으로, 앵귈라 자포니카, 앵귈라 바이칼라 바이칼라 및 앵귈라 앵귈라는 96 bp 및 34 bp DNA 단편으로 절단되었다.

도 1은 네 종류의 앵귈라 뱀장어의 게놈을 유니버샬 라이스 프라이머 4(universal rice primer 4, URP 4)를 이용하여 RAPD-PCR을 수행한 프로파일을 나타낸 도이다 [M: 1-kb DNA 사이즈 마커; 레인 1-4: 앵귈라 자포니카(A. japonica); 레인 5-8: 앵귈라 바이칼라 바이칼라(A. bicolor bicolor); 레인 9-12: 앵귈라 로스트라타(A. rostrata); 및, 레인 13-16: 앵귈라 앵귈라(A. anguilla)].

도 2는 500 bp 내지 600 bp 길이의 RAPD 마커 서열을 정렬하여 분석한 결과를 나타낸 도이다[앵귈라 자포니카(AJ), 앵귈라 바이칼라 바이칼라(AB), 앵귈라 로스트라타(AR) 및 앵귈라 앵귈라(AA)].

도 3은 350 bp 내지 400 bp 길이의 RAPD 마커 서열을 정렬하여 분석한 결과 및 PCR에 사용한 프라이머를 표기한 도이다.

도 4는 앵귈라 뱀장어 종들로부터 얻은 대략 370 bp 길이의 RAPD 마커 서열로 SCAR-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다. (A) A1F/A1R 프라이머쌍, (B) A2F/A2R 프라이머 쌍[M: 100-bp DNA 사이즈 마커; 레인 1-4: 앵귈라 자포니카; 레인 5-8: 앵귈라 바이칼라 바이칼라; 레인 9-12: 앵귈라 로스트라타; 및, 레인 13-16: 앵귈라 앵귈라].

도 5는 제한효소로 처리하여 생성된 PCR 산물의 밴드 패턴을 확인한 도이다[(A) A1F/A1R 프라이머쌍/TaqI, (B) A1F/A1R 프라이머쌍/MaeI, 및 (C) A2F/A2R 프라이머 쌍/Tru9I].

<110> National Fisheries Research and Development Institute <120> DNA markers for identification of Anguilla eel species <130> 9p-04-08 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 577 <212> DNA <213> Anguilla eel RAPD PCR maker 1 <400> 1 aggactcgat aacaggctcc gaagcagggc tgaagttaga ggaatgctaa tatgtactcg 60 ccaaacacaa gtgggtacac actgcagaca gccggcgagc ttcccatagc agcatacctg 120 tatttcatat ggagtcatgg agcctggtga gatagtacac actcactata taacacatgg 180 agcctggtca gatacacact cactatataa cacatggagc ctgatgagat agtacacact 240 cactatataa cacatgaagc ctggtcagat acacactcac tatataacac atggagcctg 300 gtgagatagt acacactcac tatataacac atggagcctg gtcagataca cactcactat 360 ataacacatg gagcctggtg agatagtaca cactcactat ataacacatg gagcctggtc 420 agatacacac tcactatata acacatggag cctggtcaga tacacactca ctatataaca 480 catggagcct ggtcagatac acactcacta tataacacat ggagcctggt cagatacaca 540 ctcactatat aacacatgga gcctgttatc gagtcct 577 <210> 2 <211> 540 <212> DNA <213> Anguilla eel RAPD PCR maker 2 <400> 2 aggactcgat aacaggctcc gaagcagggc tgaagttaga ggaatgctaa tatgtactcg 60 ccaaacacaa gtgggtacac actgcagaca gccggcgagc ttcccatagc agcatacctg 120 tatttcatgt ggagtcatgg agcctggtga gatactacac actcactata taacacatgg 180 aacctggtca gatacacact cactatataa cacatggagc ctagtgagat agtacacact 240 cactatataa cacatgaagc ctagtgagat agtacacact cactatataa cacatggagc 300 cgggtgagat acacactcac tatataacac atggaacctg gtcagataca cactcactat 360 gtaacatgtg gagcctggtg agatagtaca cactcactat ataacacatg gagccgggtg 420 agatacacac tcactatata acacgtggag ccgggtgaga tacacactca ctatataaca 480 catggagcct ggtcaaatac acactcacta tataacacat ggagcctgtt atcgagtcct 540 540 <210> 3 <211> 509 <212> DNA <213> Anguilla eel RAPD PCR maker 3 <400> 3 aggactcgat aacaggctcc gaagcagggc tgaagttaga ggaatgctaa tatgtactcg 60 ccaaacacaa gtgggtacac actgcagaca gccggtgagc ttcccatagc agcatacctg 120 tatttcatgt ggagtcatgg agcctggtga gatagtacac actcactata taacacatgg 180 agcctggtca gatacacact cacgatataa cacatggagc ctggtgagat agtacgtact 240 cattatataa cacatgaagc ctggtcagat agtacatact cactatataa cacatggagc 300 ctggtcagat agtacatact cattatataa cacatggagc ctggtcagat acacactcac 360 tatataacac atggagcctg gtcagataca cactcactat ataacacatg gagccgggtc 420 agatagtaca cactcactat ataacacatg gagcctggtc agatagtaca cactcactat 480 ataacacatg gagcctgtta tcgagtcct 509 <210> 4 <211> 362 <212> DNA <213> Anguilla eel RAPD PCR maker 4 <400> 4 aggactcgat aacaggctcc atgcacacag ctcagtgggt ggattttcag gcacccaatc 60 taccagggat tgttagtgtc atgaagagac gctggttgtg ttttaaacag aaagcagcaa 120 accgccaaac aacatcaggg tcagcaacta taagaaactc acttgataca ccaaacagca 180 taatctaaca tggtgctact ggaacaggat taattcaaca ttatctcagt tatctcactc 240 caaatgaact gaaagcaatt ttattgtata gtatgttaat tatggcaata tacaatggtg 300 caaacgtgtg tgtggagttg aatggctata cacgtatgcg taggagcctg ttatcgagtc 360 ct 362 <210> 5 <211> 375 <212> DNA <213> Anguilla eel RAPD PCR maker 5 <400> 5 aggactcgat aacaggctcc atgcacacag ctcaatgagt ggattttcag gcacccaatc 60 taccaggggt tgctagtgtc atgaagagac gctggttgtg ttttaaacag aaagcagcat 120 ttgaaggcag caaaccgcca aacaacatca aggtcagcaa ctataagaaa ctcactcgat 180 acaccaaaca gcgtaatcta acatggtgct actggaacag gattaattca acattatctc 240 agttatctca ctccaaatta actgaaagca attttattgt atagtatgtt aattatggca 300 atatacagta gtgcaaaagt gtgtgtggag ttgaatggct atacacgtat gcgtaggagc 360 ctgttatcga gtcct 375 <210> 6 <211> 375 <212> DNA <213> Anguilla eel RAPD PCR maker 6 <400> 6 aggactcgat aacaggctcc atgcacacag ctcagtgacc ggattttcag gcacccaatc 60 taccaggggt tgttagtgtc atgaagagac gctggttgtg ttttaaacag aaagcagcat 120 ttgaaggcag caaaccgcca aacaacatca gggtcagcaa ctataagaaa ctcactcgat 180 acaccaaaca gcgtaattta acatggtgct gctggaacag gattaattca acattatctc 240 agttatctca ctccaaatta actgaaagca attttattgt atagtatgtt aattatggca 300 atatacaatg gtgcaaaagt gtgtgtggag ttgaatggct atacacgtat gcataggagc 360 ctgttatcga gtcct 375 <210> 7 <211> 375 <212> DNA <213> Anguilla eel RAPD PCR maker 7 <400> 7 aggactcgat aacaggctcc atgcacacag ctcaatgacc ggattttcag gcacccaatc 60 taccaggggt tgttagtgtc atgaagagac actggttgtg ttttaaacag aaagcagcat 120 ttgaaggcag caaaccgcca aacaacatca gggtcagcaa ctataagaaa ctcactcgat 180 acaccaaaca gcgtaatcta acatggtgct gctggaacag gattaattca acattatctc 240 agttatctca ctccaaatta actgaaagca attttattgt atagtatgtt aattatggca 300 atatacaatg gtgcaaaagt gtgtgtggag ttgaatggct atacacgtat gcataggagc 360 ctgttatcga gtcct 375 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAPD PCR primer <400> 8 aggactcgat aacaggctcc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR PCR A1 forward primer <400> 9 tttcaggcac ccaatctacc a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR PCR A1 reverse primer <400> 10 ggagttgaat ggctatacac g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR PCR A2 forward primer <400> 11 acagaaagca gcatttgaag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR PCR A2 reverse primer <400> 12 gttgaatggc tatacacgta 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR PCR A3 forward primer <400> 13 cagcaaaccg ccaaacaa 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR PCR A3 reverse primer <400> 14 ctcagttatc tcactccaaa 20 <210> 15 <211> 290 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 1 <400> 15 tttcaggcac ccaatctacc agggattgtt agtgtcatga agagacgctg gttgtgtttt 60 aaacagaaag cagcaaaccg ccaaacaaca tcagggtcag caactataag aaactcactt 120 gatacaccaa acagcataat ctaacatggt gctactggaa caggattaat tcaacattat 180 ctcagttatc tcactccaaa tgaactgaaa gcaattttat tgtatagtat gttaattatg 240 gcaatataca atggtgcaaa cgtgtgtgtg gagttgaatg gctatacacg 290 <210> 16 <211> 303 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 2 <400> 16 tttcaggcac ccaatctacc aggggttgct agtgtcatga agagacgctg gttgtgtttt 60 aaacagaaag cagcatttga aggcagcaaa ccgccaaaca acatcaaggt cagcaactat 120 aagaaactca ctcgatacac caaacagcgt aatctaacat ggtgctactg gaacaggatt 180 aattcaacat tatctcagtt atctcactcc aaattaactg aaagcaattt tattgtatag 240 tatgttaatt atggcaatat acagtagtgc aaaagtgtgt gtggagttga atggctatac 300 acg 303 <210> 17 <211> 303 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 3 <400> 17 tttcaggcac ccaatctacc aggggttgtt agtgtcatga agagacgctg gttgtgtttt 60 aaacagaaag cagcatttga aggcagcaaa ccgccaaaca acatcagggt cagcaactat 120 aagaaactca ctcgatacac caaacagcgt aatttaacat ggtgctgctg gaacaggatt 180 aattcaacat tatctcagtt atctcactcc aaattaactg aaagcaattt tattgtatag 240 tatgttaatt atggcaatat acaatggtgc aaaagtgtgt gtggagttga atggctatac 300 acg 303 <210> 18 <211> 303 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 4 <400> 18 tttcaggcac ccaatctacc aggggttgtt agtgtcatga agagacactg gttgtgtttt 60 aaacagaaag cagcatttga aggcagcaaa ccgccaaaca acatcagggt cagcaactat 120 aagaaactca ctcgatacac caaacagcgt aatctaacat ggtgctgctg gaacaggatt 180 aattcaacat tatctcagtt atctcactcc aaattaactg aaagcaattt tattgtatag 240 tatgttaatt atggcaatat acaatggtgc aaaagtgtgt gtggagttga atggctatac 300 acg 303 <210> 19 <211> 243 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 5 <400> 19 acagaaagca gcatttgaag gcagcaaacc gccaaacaac atcaaggtca gcaactataa 60 gaaactcact cgatacacca aacagcgtaa tctaacatgg tgctactgga acaggattaa 120 ttcaacatta tctcagttat ctcactccaa attaactgaa agcaatttta ttgtatagta 180 tgttaattat ggcaatatac agtagtgcaa aagtgtgtgt ggagttgaat ggctatacac 240 gta 243 <210> 20 <211> 243 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 6 <400> 20 acagaaagca gcatttgaag gcagcaaacc gccaaacaac atcagggtca gcaactataa 60 gaaactcact cgatacacca aacagcgtaa tttaacatgg tgctgctgga acaggattaa 120 ttcaacatta tctcagttat ctcactccaa attaactgaa agcaatttta ttgtatagta 180 tgttaattat ggcaatatac aatggtgcaa aagtgtgtgt ggagttgaat ggctatacac 240 gta 243 <210> 21 <211> 243 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 7 <400> 21 acagaaagca gcatttgaag gcagcaaacc gccaaacaac atcagggtca gcaactataa 60 gaaactcact cgatacacca aacagcgtaa tctaacatgg tgctgctgga acaggattaa 120 ttcaacatta tctcagttat ctcactccaa attaactgaa agcaatttta ttgtatagta 180 tgttaattat ggcaatatac aatggtgcaa aagtgtgtgt ggagttgaat ggctatacac 240 gta 243 <210> 22 <211> 130 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 8 <400> 22 cagcaaaccg ccaaacaaca tcagggtcag caactataag aaactcactt gatacaccaa 60 acagcataat ctaacatggt gctactggaa caggattaat tcaacattat ctcagttatc 120 tcactccaaa 130 <210> 23 <211> 130 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 9 <400> 23 cagcaaaccg ccaaacaaca tcaaggtcag caactataag aaactcactc gatacaccaa 60 acagcgtaat ctaacatggt gctactggaa caggattaat tcaacattat ctcagttatc 120 tcactccaaa 130 <210> 24 <211> 130 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 10 <400> 24 cagcaaaccg ccaaacaaca tcagggtcag caactataag aaactcactc gatacaccaa 60 acagcgtaat ttaacatggt gctgctggaa caggattaat tcaacattat ctcagttatc 120 tcactccaaa 130 <210> 25 <211> 130 <212> DNA <213> Anguilla eel SCAR PCR maker 11 <400> 25 cagcaaaccg ccaaacaaca tcagggtcag caactataag aaactcactc gatacaccaa 60 acagcgtaat ctaacatggt gctgctggaa caggattaat tcaacattat ctcagttatc 120 tcactccaaa 130

Claims (27)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 서열번호 9(A1F)로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10(A1R)으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 11(A2F)로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12(A2R)로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 13(A3F)으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14(A3R)로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍, 상기 프라이머 쌍으로부터 수득한 PCR 산물을 절단하기 위한 제한효소, 및 뱀장어 내재유전자 증폭용 프라이머 쌍을 포함하는 앵귈라 뱀장어 종의 판별용 키트.
20. 제 19항에 있어서, 상기 제한효소는 TaqI, MaeI 및 Tru9I인 것을 특징으로 하는 앵귈라 뱀장어 종의 판별용 키트.
21. 삭제
22. 1) 뱀장어로부터 DNA를 분리하는 단계;

    2) 상기 DNA를 주형으로 제19항의 키트를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

    3) 단계 2)의 PCR 산물을 대상으로,

    ⅰ) 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍에 관하여, 단계 2)의 PCR 산물 중 290 bp 또는 303 bp의 PCR 산물의 길이 또는 염기서열을 분석;

    ⅱ) 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍, 및 뱀장어의 내재유전자 증폭용 프라이머 쌍에 관하여, 단계 2)의 PCR 산물의 증폭 여부 및 길이를 분석; 및,

    ⅲ) 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍에 관하여, 단계 2)의 PCR 산물을 Tru9Ⅰ으로 절단하여 DNA 절편의 길이를 분석하는 단계; 및,

    4) 상기 분석 결과로부터

    ⅳ) 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍에 관하여:

    길이가 290 bp이거나 염기서열이 서열번호 15로 구성된 경우, 앵귈라 자포니카로; 길이가 303 bp이거나 염기서열이 서열번호 16으로 구성된 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라로; 길이가 303 bp이거나 염기서열이 서열번호 17로 구성된 경우, 앵귈라 로스트라타로; 및, 길이가 303 bp이거나 염기서열이 서열번호 18로 구성된 경우, 앵귈라 앵귈라로 판별;

    ⅴ) 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍, 및 뱀장어의 내재유전자 증폭용 프라이머 쌍에 관하여:

    뱀장어의 내재유전자만 증폭되었을 경우, 앵귈라 자포니까로; 및 길이가 243 bp인 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타 또는 앵귈라 앵귈라로 판별; 및

    ⅵ) 서열번호 13으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍에 관하여:

    DNA 절편의 길이가 71 bp, 34 bp 및 25 bp인 경우, 앵귈라 로스트라타로; DNA 절편의 길이가 96 bp 및 34 bp인 경우, 앵귈라 자포니카, 앵귈라 바이칼라 바이칼라 또는 앵귈라 앵귈라로 판별하는 단계를 포함하는, 앵귈라 뱀장어 종의 판별 방법.
23. 제 22항에 있어서, 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍에 관하여, 상기 단계 3) 이후에

    3-1) 상기에서 분석한 DNA를 TaqI으로 절단하는 단계;

    3-2) 절단 여부 및 DNA 절편의 길이를 분석하는 단계;

    3-3) 상기 분석 결과로부터

    ⅰ) 절단되지 않으면 앵귈라 자포니카로,

    ⅱ) DNA 절편의 길이가 171 bp 및 132 bp인 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라, 앵귈라 로스트라타, 또는 앵귈라 앵귈라로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 앵귈라 뱀장어 종의 판별 방법.
24. 제 22항에 있어서, 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍에 관하여, 상기 단계 3)이후에

    3-1) 상기에서 분석한 DNA를 MaeI으로 절단하는 단계;

    3-2) 절단 여부 및 DNA 절편의 길이를 분석하는 단계;

    3-3) 상기 분석 결과로부터

    ⅰ) 절단되지 않으면 앵귈라 자포니카, 앵귈라 로스트라타, 또는 앵귈라 앵귈라로,

    ⅱ) DNA 절편의 길이가 274 bp 및 29 bp인 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 앵귈라 뱀장어 종의 판별 방법.
25. 삭제
26. 제 22항에 있어서, 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍에 관하여, 상기 단계 3) 이후에

    3-1) 서열분석을 추가로 실시하는 단계; 및,

    3-2) 상기 분석 결과로부터,

    ⅰ) 염기서열이 서열번호 19로 구성된 경우, 앵귈라 바이칼라 바이칼라로;

    ⅱ) 염기서열이 서열번호 20으로 구성된 경우, 앵귈라 로스트라타로; 및,

    ⅲ) 염기서열이 서열번호 21로 구성된 경우, 앵귈라 앵귈라로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 앵귈라 뱀장어 종의 판별 방법.
27. 삭제

Images