MX2012007136A - Metodos taqman de punto final para determinar cigocidad de maiz que comprende eventos tc1507. - Google Patents

Abstract

Se da a conocer un método para el análisis de cigosidad del evento TC1507 del maíz Cry1F; el método produce cebadores específicos para el evento TC1507 y cebadores específicos para el gen de referencia y combinaciones de sondas TaqMan para usar en un ensayo de PCR TaqMan biplex de punto final con capacidad para producir hallazgos de genotipos fuertes para asistir en la reproducción molecular de TC1507.

Description

MÉTODOS TAQMAN DE PUNTO FINAL PARA DETERMINAR CIGOCIDAD DE MAÍZ QUE COMPRENDE EVENTOS TC1507 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Herculex® I es un producto de maíz comercial, que comprende el evento de CryI F TC1507, que es resistente al daño ocasionado por insectos (especialmente por el barrenador europeo del maíz. El evento en sí ha sido descrito, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 7,605,310 y 7,449,564.

Se pueden utilizar diversos métodos para detectar la presencia de este evento en una muestra de maíz. Un ejemplo es la técnica de Pirosecuenciación descripta por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este método se diseña un oligonucleótido que se superpone al ADN genómico adyacente y el empalme del inserto de ADN. El oligonucleótido se híbrida un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) y es incubado en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Las DNTP son agregadas individualmente y la incorporación da lugar a una señal luminosa que se mide. La señal luminosa indica la presencia de un inserto de transgen/secuencia flanqueante debido a la amplificación satisfactoria, hibridación y extensión de una o más bases. (Esta técnica se utiliza habitualmente para la secuenciación inicial, no para la detección de un gen específico cuando se lo conoce).

La Polarización de Fluorescencia es otro método que se puede emplear para detectar un amplicón. Siguiendo este método, se diseña un oligonucleótido de manera que se superponga a la región genómica flanqueante y el empalme del inserto de ADN. El oligonucleótido se híbrida a un producto de PCR monocatenarío de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómico flanqueante) y se lo incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extensión de una sola base da lugar a la incorporación del ddNTP. La incorporación se puede medir como cambio de polarización utilizando un fluorómetro. Un cambio de la polarización indica la presencia del inserto de transgen/secuencía flanqueante debido a la amplificación, hibridación y extensión de base única favorables.

TAQMAN (Life Technologies, Foster City, Calif.) es un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN. En pocas palabras, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET con un oligo dentro del transgen y uno en la secuencia genómica flanqueante para la detección de eventos específicos. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. La hibridación de la sonda FRET da lugar a la escisión y liberación del resto fluorescente del resto supresor de la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/inserto de transgen debido a la amplificación e hibridación satisfactorias.

Se han descrito balizas moleculares para usar en la detección de secuencias. En pocas palabras, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que se superpone al empalme del ADN genómico flanqueante e insertado. La singular estructura de la sonda FRET hace que contenga una estructura secundaria que mantiene a los restos fluorescentes y supresores en estrecha proximidad. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. Después de la amplificación favorable por PCR, la hibridación de la sonda FRET a la secuencia objetivo da lugar a la remoción de la estructura secundaria de la sonda y a la separación espacial de los restos fluorescentes y supresores. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica flanqueante/inserto del transgen debido a la amplificación e hibridación favorables.

Otro desafío, entre muchos, consiste en hallar un gen de referencia adecuado para una prueba dada. Por ejemplo, como e señala en el resumen de Czechowski et al., "Un conjunto de datos excepcionalmente abundante de estudios con el GeneChip de genoma completo ATH1 de Affymetrix otorgó los medios para identificar una nueva generación de genes de referencia con niveles de expresión muy estables en la especie patrón de plantas de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Se encontraron cientos de genes de Arabidopsis que rinden mejor que los genes de referencia tradicionales en términos de estabilidad de expresión durante todo el desarrollo y en un rango de condiciones ambientales." (Czechowski et al. (2005) Genome-wide Identification and testing of superior reference genes for transcript in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17.) Brodmann et al. (2002) se relaciona con la detección por PCR cuantitativa en tiempo real del contenido de maíz transgénico en alimentos correspondiente a cuatro variedades diferentes de maíz aprobadas por la Unión Europea. Brodmann, P.D., P.D., llg E.C., Berthoud H., y Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methodos for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85 (3) Hernández et al. (2004) menciona cuatro genes posibles para usar con la PCR en tiempo real. Hernández, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pía, M. y Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reation systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agrie. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637.

Costa et al. (2007) examinaron estos cuatro genes (también en el contexto de PCR en tiempo real) y concluyeron que los genes de alcohol deshidrogenasa y zeína eran los mejores genes de referencia para detectar un "evento" en una muestra (un gen de lectina) en el caso de problemas de entremezclado de alimentos transgénicos. Costa, L. D. y Martinelli L.

Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Componentes. J. Agrie. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273.

Huang et al. (2004) utilizaron el plásmido pMulM2 como moléculas de referencia para la detección de los transgenes MON810 y NK603 en el maíz. Huang y Pan, "Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by múltiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods," J. Agrie. Food Chem., 2004, 52 (1 1 ), pp 3264-3268.

Gasparic et al. (2008) sugieren la tecnología LNA, partiendo de una comparación con la tecnología de sondas de ciclado, TaqMan y diversas químicas de PCR en tiempo real, para analizar cuantitativamente los eventos del maíz (tales como MON810). Gasparic, Cankar, 2el y Gruden, "Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms," BMC Biotechnol. 2008; 8: 26.

US 20070148646 se relaciona con un método de prolongación de cebadores para la cuantificación que requiere la dispensación controlada de nucleótidos individuales que pueden ser detectados y cuantificados por la cantidad de nucleótidos incorporados. Esto se diferencia del método de PCR TaqMan que utiliza un gen de referencia interno.

Para distinguir entre los genotipos homocigoto y hemicigoto de TC1507, se ha utilizado para este evento un ensayo de invasión. Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. y Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008, 21 , 173-181.

Huabang (2009) se relaciona con el análisis basado en PCR del maíz transgénico. Sin embargo, no parece utilizarse ningún gen de referencia. Huabang, "An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize," Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en parte, con un ensayo molecular para determinar la cigosidad del evento TC1507 en el maíz. Más específicamente, la presente invención se relaciona, en parte, con un ensayo de PCR de punto final TaqMan para detectar un evento de Herculex® I TC1507 en el maíz utilizando un gen de referencia endógeno de maíz. Algunas modalidades se relacionan con ensayos con capacidad de análisis de cigosidad de gran rendimiento. La presente invención se relaciona, además, en forma parcial, con el hallazgo de un gen de referencia preferido para usar en la determinación de la cigosidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra un ejemplo de gráfico de distribución entre los números de muestras y las relaciones absolutas de SOB1/SOB2.

Las figuras 2A - 2D son representaciones de la amplificación por PCR en tiempo real de la combinación biplex de TC1507 con diferentes genes de referencia investigados. Se exponen las representaciones de amplificación de PCR en tiempo real correspondientes al biplex de TC1507 con ivr (2A), hmg (2B), ivr104(2C) y ze/na (2D) con diluciones en serie al doble de ADN genómico de homocigotos CryI F, respectivamente. Los valores Ct con cada dilución están consignados dentro de sus correspondientes representaciones.

Las figuras 3A - 3D ilustran gráficos de distribución de determinaciones de cigosidad de CryIF con TaqMan de punto final utilizando genes de referencia. Los paneles son los siguientes, en el caso de los ensayos que utilizan: ivr104 (3A), /Vr (3B), hmg (3C) y zeína (3D) como genes de referencia. Al completarse la PCR y las lecturas de fluorescencia, se generaron gráficos de distribución: SOB1 = Señal sobre el fondo de FAM (señal de muestra sobre el promedio de la señal de fondo a 535 nm), SOB2 = Señal sobre fondo de Cy5 (señal muestra sobre el promedio de la señal de fondo a 670 nm). En el caso de ivr104 (3A), se pueden efectuar búsquedas de genotipo con SOB1/SOB2 < 0.5 en el caso del tipo salvaje, 0.5< SOB1/SOB2< 2 en el caso de los hemicigotos y SOB1/SOB2 > 2 en el caso de los homocigotos.

Las figuras 4A - 4C ilustran la validación de la determinación de cigosidad de CryIF con el ensayo TaqMan de punto final empleando ivr104 como gen de referencia en tres poblaciones (dos placas de 96 pocilios de ADN genómico por cada población). Al completarse la PCR y las lecturas de fluorescencia, se generó un gráfico de distribución: SOB1 = Señal sobre el fondo de FAM (relación de la señal de muestra sobre el promedio de la señal de fondo a 535 nm), SOB2 = Señal sobre fondo de Cy5 (relación de la señal de muestra sobre el promedio de la señal de fondo a 670 nm). Se realizaron búsquedas de genotipos de conformidad con cúmulos diferenciados de homocigotas, hemicigotas y tipos salvajes. La figura 4A es un gráfico de distribución de la determinación de la cigosidad de CryIF con el ensayo TaqMan de punto final en una población apilada de Cry34/35 PoCryIF. La figura 4B es un gráfico de distribución de la determinación de la cigosidad de CryIF con el ensayo TaqMan de punto final en una población de pila simple de PoCryIF. La figura 4C (PoCry1 F_NK603) sólo tuvo dos cúmulos (homocigotas y hemicigotas) puesto que las plantas WT (de tipo salvaje), como era de esperar, no sobrevivieron a la fumigación con herbicida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es una secuencia de la secuencia flanqueante 5' del evento de maíz TC1507.

SEQ ID NO: 2 es una secuencia de la secuencia flanqueante 3* del evento de maíz TC1507.

SEQ ID NO: 3 es una secuencia contigua correspondiente al evento de maíz TC1507 que incluye una secuencia flanqueante 5', el inserto cryl F y una secuencia flanqueante 3'.

SEQ ID NOs: 4 - 21 son cebadores y sondas ilustrativos para usar de acuerdo con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en parte, con un ensayo TaqMan de punto final basado en fluorescencia que utiliza un gen endógeno como control de referencia (número de copias) para el análisis de cigosidad de alto rendimiento de TC1507, un evento Cryl F del maíz. La presente invención se relaciona, además, en parte, con el descubrimiento de un gen de referencia preferido, el de invertasa. Se identificaron varios genes de referencia como opciones posibles.

La presente invención también se relaciona, en parte, con el desarrollo de una PCR Taqman biplex de punto final para el análisis ce cigosidad específico para el evento TC1507. Además, la presente invención se relaciona, en parte, con el desarrollo de kits de ensayo de reproducción de TC 507.

Los ensayos TaqMan de Punto final se basan en una estrategia de más/menos, en la cual "más" significa que la muestra es positiva respecto del gen analizado y un "menos" significa que la muestra es negativa respecto del gen analizado. Estos ensayos utilizan, por lo general, dos series de oligonucleótidos para la identificación de la secuencia del transgen TC1507 y la secuencia del gen de tipo salvaje, respectivamente, como así también las sondas con doble marca para medir el contenido de las secuencias del transgen y el tipo salvaje.

Si bien el ensayo Invader ha sido una técnica robusta para caracterizar estos eventos, es muy sensible a la calidad del ADN. Además, el ensayo requiere una elevada cantidad de ADN. El ensayo Invader requiere asimismo un paso adicional de desnaturalización que, si no se maneja correctamente, puede causar el fracaso del ensayo Invadeer. Por añadidura, el tiempo más prolongado del ensayo Invader lo limita en su flexibilidad para hacer frente con eficacia a grandes números de muestras de TC1507 para el análisis en un entorno comercial. Una de las principales ventajas de la presente invención es el ahorro de tiempo y la eliminación del paso de desnaturalización.

El presente análisis TaqMan de Punto Final para detectar eventos TC1507 ofrece asombrosas ventajas con respecto a Invader, especialmente al analizar grandes números de muestras. Sin embargo, su aplicación a TC1507 fue complicada. Por un lado, la región de borde de TC1507 no es una verdadera secuencia genómica. Por ejemplo, con tiene secuencias flanqueantes repetitivas. Es una secuencia única que contiene fragmentos del transgen y retrotransposones, que habrían sido vistos como obstáculo muy significativo para la implementación de la estrategia más/menos del ensayo TaqMan de punto final en este contexto.

Además, por ejemplo, se intentaron múltiples combinaciones de cebadores y sondas. Sin embargo, ninguna de estas combinaciones dio lugar a una señal robusta con capacidad para discriminar entre el alelo de tipo salvaje y el transgen.

En una modalidad, la reacción de PCR específica para el evento TC1507 amplifica un fragmento de 58 pb, característico del evento, como resultado de la inserción del cassette del constructo TC1507 en el ADN genómico del maíz. Una sonda oligonucleotídica específica del objetivo TC1507 se une al objetivo entre dos cebadores de PCR específicos para el evento y se la marca con una tintura fluorescente y un desactivador. Los marcadores fluorescentes posibles incluyen FAM como tintura reportera en el extremo 5' de la sonda TC1507 y un desactivador Black Hole Quencher 1 (BHQ1 ) como desactivador en el extremo 3' de la sonda TC1507.

Usando un rango de factores empíricos junto con nuestro criterio, identificamos de manera empírica los genes endógenos del maíz, con capacidad para la amplificación de PCR de una sola o un bajo número de copias, sonda que se puede conservar en numerosos cultivares. Muchísimos genes de referencia eran posibles. Los que seleccionamos para la evaluación inicial fueron evaluados como posibles genes de referencia para el análisis de cigosidad de TC1507. Se eligieron cinco series de oligos (Cuadro 1 ): ivr, ivr104 (fragmentos de 79 y 104 pb de la invertasa), adh (fragmento de 136 pb adh1), hmg (fragmento de 79bp de hmga), y zeína (fragmento de 72 pb de zeína). Se evaluaron cebadores específicos para el gen y una sonda específica para el gen, en una modalidad marcados con Cy5 en el extremo 5' de la sonda y un Black Hole Quencher 2 (BHQ2) en el extremo 3' de la sonda, para usar en la cuantificación rápida para los genes endógenos del maíz evaluados como genes de referencia posibles para el análisis de cigosidad de TC1507.

Los cebadores y sondas de genes específicos para el gen CryI F y los genes endógenos del maíz fueron analizados para detectar las eficiencias de PCR. También se aprovecharon las combinaciones de cebadores y sondas de los genes endógenos del maíz que habían demostrado tener eficiencias de PCR relativamente similares a la de los cebadores y sondas específicos del evento Cry F para la capacidad de multiplexdo y el ensayo de cigosidad TaqMan de punto final.

Se analizaron todos los oligos para determinar la eficiencia de PCR. Los oligos con eficiencias de PCR relativamente aproximadas a los oligos específicos del evento fueron aprovechados además para el multiplexado y el ensayo de cigosidad TaqMan de punto final.

En algunas modalidades, este análisis de cigosidad utiliza un biplex de oligonucleótidos específicos del evento TC1507 y para el evento del gen de referencia endógeno del maíz (invertasa en algunas modalidades preferidas) en el mismo ensayo de amplificación. La cigosidad se determina por la intensidad relativa de la fluorescencia específica del Evento TC1507 en comparación con el ADN de referencia.

En algunas modalidades, el ensayo específico del evento TC1507 amplifica un fragmento de 58 pb, característico del evento, que es el resultado de la inserción del cassette del constructo TC1507 en el ADN genómico del maíz. Una sonda oligonucleotídica de objetivo específico se une al objetivo entre dos cebadores de PCR específicos del evento TC1507 PCR y se la marca con dos tinturas fluorescentes: FAM como tintura reportera en su extremo 5' y BHQ como tintura desactivadora en su extremo 3'. Se miden los productos de PCR tras el número óptimo de ciclos, cuando la reacción se encuentra en la fase exponencial temprana.

En algunas modalidades, el sistema específico del maíz amplifica un fragmento de 104 pb del gen de invertasa. Se utiliza un par de oligos específicos de la invertasa y una sonda específica para el gen de invertasa marcada con Cy5 en el extremo 3' y una BHQ en el extremo 5' para la cuantificación rápida.

En algunas modalidades, el ensayo TaqMan de punto final basado en fluorescencia para el análisis de cigosidad de TC1507 permite la lectura directa de los resultados en un lector de placas para la identificación del Evento Herculex® I TC1507 en el maíz y el gen de referencia.

La presente invención incluye aplicaciones de reproducción asexual tales como el análisis de la introgresión de Herculex® I en otras líneas de maíz.

Se pueden utilizar los métodos de detección y kits de la presente invención para identificar eventos de acuerdo con la presente invención. Los métodos y kits de la presente invención se pueden utilizar para estrategias de reproducción acelerada y para establecer datos de vinculación. Las técnicas de detección de la presente invención son especialmente útiles en combinación con la reproducción de plantas, para determinar qué plantas de la progenie comprenden un evento dado, una vez cruzada una planta progenitora que comprende un evento de interés con otra línea vegetal, en un esfuerzo por impartir uno o más rasgos adicionales de interés en la progenie. Estos métodos de análisis de PCR Taqman constituyen una ventaja para los programas de reproducción del maíz, como asi también para el control de calidad, especialmente para las semillas de maíz transgénico comercializadas. Ahora también se pueden preparar y utilizar kits de detección de PCR Taqman para estas líneas transgénícas de maíz. Esto también puede mejorar el registro de productos y la administración del producto.

Más aún, la presente invención se puede utilizar para estudiar y caracterizar procedimientos de integración del transgen, las características del sitio de integración genómica, la clasificación de eventos, la estabilidad de los transgenes y sus secuencias flanqueantes y la expresión génica (especialmente en lo que respecta al silencíamiento de genes, a patrones de metilación de transgenes, efectos de la posición y elementos potenciales relacionados con la expresión tales como MARS [regiones de unión a la matriz] y demás).

Esta invención incluye además procedimientos para realizar cruzas utilizando una planta TC1507 como por lo menos uno de las progenitoras. Por ejemplo, la presente invención incluye una planta híbrida Fi que tiene, como una o ambas progenitoras, a cualquiera de las plantas aquí ejemplificadas. Esta invención incluye un método para producir una semilla híbrida Fi cruzando una planta ejemplificada con una planta diferente (por ej. una progenitora endogámica), cosechando la semilla híbrida así obtenida y analizando la muestra de semillas / planta de acuerdo con la presente invención. Se pueden mejorar las características de las plantas así obtenidas mediante un meticuloso estudio de las plantas progenitoras.

Se puede reproducir una planta de maíz resistente a los insectos cruzando sexualmente, en primer lugar, primera una planta progenitora de maíz que consiste en una planta de maíz cultivada a partir de una semilla de cualquiera de las líneas mencionadas en este documento y una segunda planta de maíz progenitora, para producir así una pluralidad de plantas de la primera generación de la progenie, y luego seleccionando una planta de la primera generación que sea resistente a los insectos (o que posea por lo menos uno de los eventos de la presente invención) y autofertilizando la primera planta de la progenie para producir así una pluralidad de plantas de la segunda generación y luego seleccionando de las plantas de la segunda generación una planta que sea resistente a los insectos (o que posea por lo menos uno de los eventos de la presente invención). Estos pasos pueden incluir además la retrocruza de la planta de la primera generación o la planta de la segunda generación con una tercera planta de maíz progenitora. A continuación se puede plantar un cultivo de maíz que comprende las semillas de maíz de la presente invención, o la progenie de las mismas.

Se ha de entender asimismo que también se pueden aparear dos plantas transgénicas diferentes para producir retoños que contengan dos genes exógenos agregados de segregación independiente. La autofertilización de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigotas respecto de ambos genes exógenos agregados. La retrocruza con una planta progenitora y la cruza externa con una planta no transgénica también están contempladas, al igual que la propagación vegetativa. Otros métodos de reproducción asexual utilizados comúnmente para diferentes rasgos y cultivos son conocidos en la técnica. Se ha utilizado la retrocruza para transferir genes para un rasgo simplemente heredado y altamente heredable en un cultivar o línea endogámica homocigota, que es la progenitora recurrente. El origen del rasgo a transferir se denomina progenitor donante. Se espera que el rasgo conveniente se haya transferido a la planta así obtenida de la progenitora donante. Se espera que la planta así obtenida ha de tener los atributos de la progenitora recurrente (por ej., cultivar) y que se haya transferido el rasgo ventajoso de la progenitora donante. Después de la cruza inicial, se seleccionan los individuos que poseen el fenotipo de la progenitora donante y se los cruza repetidamente (retrocruza) con la progenitora recurrente. Se estima que la progenitora obtenida ha de tener los atributos de la progenitora recurrente (por ej., el cultivar) y que se haya transferido el rasgo ventajoso de la progenitora donante.

Se pueden utilizar las moléculas de ADN de la presente invención como marcadores moleculares en el método de reproducción asistida por marcadores (MAB). Las moléculas de ADN de la presente invención se pueden utilizar en métodos (tales como los de marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs y SSRs) que identifican los rasgos de utilidad agronómica genéticamente ligados, como se sabe en la técnica. Se puede rastrear el rasgo de resistencia a los insectos en la progenie de una cruza con una planta de maíz de la presente invención (o la progenie de la misma y cualquier otro cultivar o variedad de maíz) utilizando los métodos de MAB. Las moléculas de ADN son marcadores para este rasgo y se pueden emplear métodos MAB muy conocidos en la técnica para rastrear el o los rasgos de resistencia a los insectos en plantas de maíz, donde por lo menos una línea de maíz de la presente invención, o la progenie de la misma, ha servido como progenitora o antecesora. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para identificar cualquier variedad de maíz con el evento de resistencia a los insectos de la línea de maíz TC1507.

Los métodos de la presente invención incluyen un método para la producción de una planta de maíz resistente a los insectos, donde dicho método comprende la reproducción asexual con una planta de la presente invención. Más específicamente, dichos métodos pueden comprender la cruza de dos plantas de la presente invención, o una planta de la presente invención y cualquier otra planta, y rastrear el evento en cuestión de acuerdo con la presente invención. Los métodos preferidos comprenden además la selección de la progenie de dicha cruza mediante el análisis de dicha progenie para la detección de un evento detectable de acuerdo con la presente invención.

Una planta preferida, o una semilla, propagada y desarrollada de acuerdo con la presente invención comprende, en su genoma, por lo menos una de las secuencias insertadas identificadas en el Cuadro 1 , junto con al menos 20-500 o más nucleótidos contiguos flanqueantes a ambos lados del inserto, como se identifica en el Cuadro 1. A menos que se indique lo contrario, "evento TC1507" o referencia similar, se refiere al ADN de la SEQ ID NO: 3 que incluye el ADN heterologo insertado en el sitio genómico identificado por la totalidad o parte de ambas secuencias genómicas flanqueantes de SEQ ID NOs: 1 y/o SEQ ID NO: 2 inmediatamente adyacentes al ADN insertado que sería lógico esperar que se transfiera a la progenie que recibe el ADN insertado como resultado de una cruza sexual de una línea parental que incluye el evento.

En este documento se presentan definiciones y ejemplos para contribuir a describir la presente invención y para guiar a las personas con capacitación normal en la técnica en la puesta en práctica de la invención. A menos que se indique lo contrario, los términos se han de interpretar de acuerdo con el uso convencional que le asignan las personas con capacitación normal en la técnica pertinente. Se utiliza la nomenclatura de las bases de ADN expuesta en 37 CFR §1.822.

Un "evento" transgénico se produce por la transformación de células vegetales con ADN heterologo, es decir una construcción de ácido nucleico que incluye un transgen de interés, la regeneración de una población de plantas producidas como resultado de la inserción del transgen en el genoma de la planta y la selección de una planta determinada en un sitio específico del genoma. El término "evento" se refiere a la transformante original y a la progenie de la transformante que incluye el ADN heterologo. El término "evento" se refiere asimismo a una progenie producida por una cruza sexual externa entre la transformante y otra variedad que incluye el ADN genómico/transgen. Aun después de repetidas retrocruzas con una progenitora recurrente, el ADN del transgen insertado y el ADN genómico flanqueante (ADN genómico/transgen) de la progenitora transformada está presente en la progenie de la cruza en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" se refiere asimismo al ADN de la transformante original y la progenie de la misma que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se espera se transfiera a una progenie que recibe el ADN insertado que incluye el transgen de interés como resultado de una cruza sexual de una línea parental que incluye el ADN insertado (por ej., la transformante original y la progenie que resulta de la autofertilización) y una línea parental que no contiene el ADN insertado.

Una "secuencia de empalme" abarca el punto en el cual el ADN insertado en el genoma está ligado al ADN del genoma nativo del maíz que flanquea el punto de inserción, donde la identificación o detección de una u otra secuencia de empalme en el material genético de una planta es suficiente para diagnosticar el evento. Se incluyen las secuencias de ADN que cubren las inserciones en los eventos del maíz aquí descritos y tramos similares del ADN flanqueante. En este documento se presentan ejemplos específicos de dichas secuencias de diagnóstico; sin embargo, otras secuencias que se superponen a los empalmes de la inserciones, o los empalmes de las inserciones y la secuencia genómica, también son diagnósticas y se las podría utilizar de acuerdo con la presente invención.

Se pueden diseñar cebadores, amplicones y sondas para usar de acuerdo con la presente invención, basándose, en parte, en las secuencias flanqueantes, de empalme y/o insertadas. Se pueden incluir cebadores y amplicones como componentes de la invención. Se pueden emplear métodos de análisis por PCR utilizando amplicones que abarcan el ADN insertado y sus bordes para detectar o identificar variedades de maíz transgénico comercializadas o líneas derivadas de las líneas de maíz transgénico de registradas.

La secuencia de la secuencia flanqueante 5' correspondiente a HERCULEX I (evento TC1507) se presenta como SEQ ID NO: 1. La secuencia de la secuencia flanqueante 3' está provista en SEQ ID NO: 2. La secuencia del inserto cryI F (junto con las secuencias regulatorias), flanqueadas por las secuencias flanqueantes (de SEQ ID NOs: 1 y 2) se presenta bajo el título SEQ ID NO: 3. El Cuadro 1 presenta las coordenadas de las secuencias de inserto y flanqueantes con respecto a SEQ ID NO: 3.

CUADRO 1 Ubicación de los residuos en SEQ ID NO: 3: Flanqueante 5' Inserto cryI F Flanqueante 3' Evento TC1507 1-2829 2830-9015 9016-1 1361 (ver SEQ ID NO: 1 ) (ver SEQ ID NO: 2) Estos eventos de inserción, y otros componentes de los mismos, han sido descritos con más detalle, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 7,605,310 y 7,449,564 (ver por ej. La figura 1 de la patente '564). Sobre la base de estas secuencias de inserto y de borde, se generaron cebadores para eventos específicos, como puede hacerse. El análisis de PCR demostró que estas líneas de maíz pueden ser identificadas en diferentes genotipos de maíz mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estas series de cebadores específicos para el evento. Por consiguiente, se pueden utilizar estos y otros procedimientos relacionados para identificar de manera inequívoca estas líneas de maíz.

En el presente contexto, una "línea" es un grupo de plantas que exhiben poca o ninguna variación genética entre individuos con respecto a por lo menos un rasgo. Dichas líneas pueden ser generadas por varias generaciones de autopolinización y selección, o mediante la propagación vegetativa a partir de una sola progenitora empleando técnicas de cultivo tisular o celular.

En el presente contexto, los términos "cultivar" y "variedad" son sinónimos y se refieren a una línea que se utiliza para la producción comercial. "Estabilidad" o "estable" significa que, con respecto a un componente dado, el componente se mantiene de generación en generación y, preferentemente por lo menos tres generaciones sustancialmente en el mismo nivel, por ej., preferentemente ±15%, más preferentemente ±10%, muy preferentemente ±5%. La estabilidad puede resultar afectada por la temperatura, ubicación, estrés y el momento de la plantación. La comparación de las generaciones subsiguientes en condiciones de campo ha de producir el componente de manera similar.

La "Utilidad Comercial" se define por una planta con buen vigor y alta fertilidad, de tal manera que el cultivo pueda ser producido por los agricultores utilizando el equipamiento agrícola convencional y que se pueda extraer el aceite con los componentes descritos de la semilla empleando el equipamiento convencional de trituración y extracción. Para ser de utilidad comercial el rendimiento, medido por el peso de las semillas, el contenido de aceite y el total de aceite producido por acre está dentro del 15% del rendimiento promedio de una variedad de cañóla de otro modo comparable sin los rasgos de valor especial cultivada en la misma región.

"De élite agronómica" se refiere a que la línea tiene características agronómicas convenientes tales como rendimiento, madurez, resistencia a las enfermedades y demás, además de la resistencia a los insectos debido al presente evento (o eventos).

Como ha de apreciar una persona experta en la técnica a la luz de esta descripción, las modalidades preferidas de kits de detección, por ejemplo, pueden incluir sondas y/o cebadores dirigidos a "secuencias de empalme" o "secuencias de transición" (donde la secuencia flanqueante genómica del maíz se encuentra con la secuencia insertada) o las comprenden. Por ejemplo, esto incluye una sonda, cebador o amplicón polinucleotídico que comprende una secuencia que incluye los residuos indicados en la Cuadro 1. Algunos cebadores preferidos pueden incluir por lo menos -15 residuos de la secuencia flanqueante adyacente y por lo menos ~15 residuos de la secuencia de inserto adyacente. Se pueden tomar como objetivo los residuos dentro de las 200 bases aproximadamente de las secuencias de empalme. Con esta disposición, se puede utilizar otro cebador en la región flanqueante o inserto para generar un amplicón detectable que indique la presencia de un evento de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, un cebador se une en la región flanqueante y uno se une en el inserto, y se pueden utilizar esos cebadores para generar un amplicón que abarca (e incluye) una secuencia de empalme (residuos 2829-2030 y/o 9015-9016) como se indicara anteriormente. Las SEQ ID NOs: 1 y/o 2 pueden estar alineadas con SEQ ID NO: 3 para ilustrar esos empalmes.

Una persona experta en la técnica también ha de reconocer que se pueden diseñar cebadores y sondas para hibridarse, en condiciones de hibridación estándar y/o condiciones de PCR, a un segmento de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO: 3 y complementos de las mismas, donde el cebador o la sonda no es perfectamente complementaria de la secuencia ejemplificada. Es decir que se puede tolerar cierto grado de mal apareamiento. En el caso de un cebador de aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, por lo general no es necesario que uno o dos nucleótidos aproximadamente se unan a la cadena opuesta si la base mal apareada es interna o está al final del cebador opuesto al amplicón. Más adelante se presentan diversas condiciones de hibridación apropiadas. También se pueden utilizar en las sondas análogos nucleotídicos sintéticos tales como inosina. Se pueden emplear asimismo sondas de péptido ácido nucleico (PNA) tales como sondas de ADN o ARN. Lo importante es que dichas sondas y cebadores son diagnósticas (pueden identificar de manera unívoca y distinguir) la presencia de un evento de la presente invención.

Los componentes del "inserto" o construcción del transgen han sido descritos, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 7,605,310 y 7,449,564 (ver por ej. la figura 1 de la patente '564). Se pueden utilizar secuencias de polinucleótidos o fragmentos de estos componentes como cebadores o sondas de ADN en los métodos de la presente invención.

En algunas modalidades de la invención, se dan a conocer composiciones y métodos para detectar el número de copias de la región de inserción del transgen/genómica en plantas y semillas y demás, de una planta designada HERCULEX que comprende el evento de Cr I F TC1507. Se presentan secuencias de ADN que comprende por lo menos una secuencia de empalme de la región de inserción del transgen/genómica expuestas en la presente en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, segmentos de las mismas y complementos de las secuencias ejemplificada y cualquier segmento de las mismas. La secuencia de empalme de la región de inserción abarca el empalme entre el ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN de la célula de maíz que flanquea el sitio de inserción. Dichas secuencias son diagnósticas del presente evento.

Basándose en estas secuencias de inserto y borde, se generaron cebadores específicos para el evento. El análisis de PCR Taqman de la presente invención demostró que se puede identificar el evento del maíz TC1507 en diferentes líneas y genotipos de maíz mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estas series de cebadores específicos para el evento. Se pueden utilizar estos y otros procedimientos relacionados para identificar de manera unívoca estas líneas de maíz.

En algunas modalidades, las secuencias de ADN que comprenden (o son complementarias, por lo menos en parte) de una porción/segmento contiguo de las regiones de inserción del transgen/genómica constituyen un aspecto de esta invención. Se incluyen las secuencias de ADN que comprenden un tramo suficiente de polinucleótidos de la secuencia de inserto del transgen y un tramo suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica del maíz de una o más plantas de maíz de la presente.

Las modalidades relacionadas se refieren a secuencias de ADN que comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos contiguos de una porción del transgen de una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3, o complementos de la misma y un tramo similar de una secuencia de ADN flanqueante de maíz seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o complementos de las mismas. Dichas secuencias son útiles, por ejemplo, como cebadores de ADN o métodos de amplificación de ADN. Los componentes de la invención incluyen también los amplicones producidos por dichos cebadores de ADN y cebadores homólogos.

Esta invención incluye asimismo métodos para detectar la presencia de ADN en una muestra, de por lo menos una de las plantas de maíz a las que se hace referencia en la presente. Dichos métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que comprende el ADN con un juego de cebadores que, al utilizarlos en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos de la presente invención, con ADN de por lo menos uno de estos eventos del maíz, (b) ejecutar una reacción de amplificación de PCR TAQMAN utilizando un gen de referencia identificado en la presente y (c) analizar los resultados.

En algunas modalidades más, la presente invención incluye métodos para producir una planta de maíz que comprende un evento cryl F de la presente invención, donde dicho método comprende los siguientes pasos: (a) cruzar sexualmente una primera línea parental de maíz (que comprende un cassette de expresión de la presente invención, que confiere el rasgo de resistencia a los insectos a las plantas de dicha línea) para producir así una pluralidad de plantas de la progenie y (b) seleccionar una planta de la progenie basándose en los resultados de por lo menos una técnica de ensayo de la presente invención. Dichos métodos pueden comprender opcionalmente el paso adicional de retrocruzar la planta de la progenie con la segunda línea parental de maíz para producir una planta de maíz pura para la reproducción que comprende dicho rasgo de tolerancia a los insectos. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se presentan métodos relacionados para determinar la cigosidad de la progenie de una cruza.

Se pueden desarrollar kits de detección de ADN utilizando las composiciones aquí descriptas y métodos muy conocidos en la técnica de detección de ADN. Los kits son útiles para la identificación del ADN del presente evento del maíz en una muestra y se pueden aplicar a los métodos para reproducir plantas de maíz que contengan este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homologas o complementarias de los amplicones, por ejemplo los descritos en la presente, o de secuencias de ADN homologas o complementanas del ADN contenido en los elementos genéticos del transgen de los presentes eventos. Estas secuencias de ADN pueden ser utilizadas en reacciones de amplificación de ADN o en sondas en un método de hibridación de ADN. Los kits pueden contener además los reactivos y materiales necesarios para la ejecución del método de detección.

Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico aislada a la cual está adherido un marcador detectable o molécula reportera (tal como un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima). Dicha sonda es complementaria de una hebra del ácido nucleico objetivo, en el caso de la presente invención, o de una hebra del ADN genómico de dichos eventos del maíz, ya sea de una planta de maíz o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invención no sólo incluyen ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y pueden ser utilizadas para detectar la presencia de la secuencia de ADN objetivo.

Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados que se reasocian a una hebra complementaria de ADN objetivo mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN objetivo y pueden ser utilizados en combinación con una polimerasa, por ej., una ADN polimerasa. Los parees de cebadores de la presente invención se refieren a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo, por ej. por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por otros métodos convencionales de amplificación de ácidos nucleicos.

Las sondas y cebadores (y amplicones) tienen generalmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1 10, 1 11 , 112, 113, 114, 1 15, 1 16, 117, 1 18, 1 19, 120, 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ó 500 polinucleótidos o más de longitud. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente a una secuencia objetivo en condiciones de alta rigurosidad. Preferentemente, sondas y cebadores de acuerdo con la presente invención tienen similitud total de secuencias con la secuencia objetivo, aunque se pueden diseñar sondas que difieran de la secuencia objetivo y que retengan la capacidad de hibridarse a secuencias objetivo mediante métodos convencionales.

Los métodos para la preparación y uso de sondas y cebadores han sido descritos, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Se pueden derivar pares de cebadores de PCR de una secuencia conocida, por ejemplo utilizando programas de computación destinados a ese fin.

Se pueden utilizar los cebadores y sondas basados en las secuencias del ADN flanqueante y el inserto descrito en la presente para confirmar (y, si fuera necesario, corregir) las secuencias descriptas mediante métodos convencionales, por ej., reclonando y secuenciando dichas secuencias.

Las sondas y cebadores de ácido nucleico de la presente invención se hibridan en condiciones rigurosas a una secuencia de ADN objetivo. Se puede utilizar cualquier método convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas son aptas para hibridarse específicamente a otras moléculas de ácido nucleico en ciertas circunstancias. En el presente contexto, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse específicamente entre sí si las dos moléculas pueden formar una estructura de ácido nucleico bicatenaria antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si ambas exhiben complementariedad total. En el presente contexto, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad total" cuando cada uno de los nucleótidos de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si se pueden hibridar entre sí con estabilidad suficiente para permitirles permanecer reasociadas entre sí en condiciones convencionales por lo menos de "baja rigurosidad". Del mismo modo, se dice que las moléculas son "complementarias" si se pueden hibridar entre sí con estabilidad suficiente para permitirles permanecer asociadas entre sí en condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Las condiciones convencionales de rigurosidad han sido descriptas por Sambrook et al., 1989. Por lo tanto, los alejamientos de la complementariedad completa son permisibles, siempre que dichos alejamientos no impidan por completo la capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda sólo necesita ser suficientemente complementaria en su secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable en las concentraciones específicas de solvente y sales empleadas.

En el presente contexto, una secuencia sustancialmente homologa es una secuencia de ácido nucleico que se híbrida específicamente al complemento de la secuencia de ácido nucleico con la cual se la está comparando en condiciones de alta rigurosidad. El término "condiciones rigurosas" se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico objetivo (es decir, a una secuencia de ácido nucleico de interés) mediante el procedimiento de hibridación específico descrito por Sambrook ef al., 1989, en 9.52-9.55. Ver además, Sambrook et al., 1989 en 9.47-9.52 y 9.56-9.58. En consecuencia, se pueden emplear las secuencias de nucleótidos de la invención por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos de complementariedad de fragmentos de ADN.

Dependiendo de la aplicación contemplada, se puede utilizar diversos métodos de hibridación para obtener diversos grados de selectividad de la sonda con la secuencia objetivo. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, por lo general se emplean condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos; por ej., se seleccionan condiciones de sal relativamente bajas y/o alta temperatura, como por ejemplo NaCI de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.15 M a temperaturas de aproximadamente 50° C a aproximadamente 70° C. Las condiciones rigurosas podrían implicar, por ejemplo, el lavado del filtro de hibridación por lo menos dos veces con buffer de lavado de alta rigurosidad (0.2X SSC, 0.1 % de SDS, 65° C). Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN por ejemplo, 6.0X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45° C, seguidas por un lavado con 2.0X SSC a 50° C son conocidas por las personas expertas en la técnica, 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sales en el paso de lavado puede ser seleccionada desde una baja rigurosidad de aproximadamente 2.0X SSC a 50° C a una alta rigurosidad de aproximadamente 0.2X SSC a 50° C. Además, se puede aumentar la temperatura en el paso de lavado desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22° C, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65° C. Se puede variar tanto la temperatura como la sal, o la temperatura o la concentración de sal se pueden mantener constantes, cambiando la otra variable. Dichas condiciones selectivas toleran poco, si algún, mal apareamiento entre la sonda y el patrón o hebra objetivo. La detección de secuencias de ADN mediante hibridación es muy conocida por las personas expertas en la técnica y los conceptos vertidos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,965,188 y 5,176,995 son ilustrativos de los métodos de análisis de hibridación.

En una modalidad especialmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención se híbrida específicamente a uno o más de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ejemplificados o sugeridos en la presente, incluyendo complementos y fragmentos de los mismos, en condiciones de alta rigurosidad. En un aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico de la presente invención tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NOs: 4-21 , o complementos y/o fragmentos de la misma.

En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora de la presente invención comparte entre 80% y 100% o 90% y 100% de identidad de secuencia con dichas secuencias de ácido nucleico. En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comparte entre 95% y 100% e identidad de secuencia con esa otra secuencia. Dichas secuencias pueden ser utilizadas en métodos de reproducción asexual, por ejemplo para identificar la progenie de cruzas genéticas. La hibridación de la sonda a la molécula de ADN objetivo puede ser detectada por cualquiera de los métodos conocidos por las personas expertas en la técnica, que pueden incluir, aunque no a título de limitación, marcas de identificación fluorescentes, marcas de identificación radiactivas, marcas de identificación basadas en anticuerpos y marcas de identificación quimioluminiscentes.

Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo {por ej., por PCR) usando un par de cebadores de amplificación específico, las "condiciones rigurosas" son condiciones que permiten que el par de cebadores se hibride sólo a la secuencia de ácido nucleico objetivo a la cual se uniría un cebador que tiene la correspondiente secuencia de tipo salvaje (o su complemento) y preferentemente para producir un producto de amplificación singular, el amplicón.

El término "específico para (una secuencia objetivo)" indica que una sonda o cebador se híbrida en condiciones de hibridación rigurosas sólo a la secuencia objetivo en una muestra que comprende la secuencia objetivo.

En el presente contexto, "ADN amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico objetivo que es parte de un patrón de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de maíz producida como resultado de una cruza sexual contiene ADN del genómico del evento transgénico de la planta de maíz de la presente invención, se puede someter al ADN extraído de una muestra de tejido de la planta de maíz a un método de amplificación de ácido nucleico utilizando un par de cebadores que incluye un cebador derivado de una secuencia flanqueante en el genoma de la planta, adyacente al sitio de inserción del ADN heterologo insertado y un segundo cebador derivado del ADN heterologo insertado para producir un amplicón que es diagnóstico de la presencia del ADN del evento. El amplicón es de una longitud y tiene una secuencia que también es diagnóstica del evento. El amplicón puede variar en longitud desde la longitud combinada de los pares de cebadores más un par de bases nucleotídicas y/o la longitud combinada de los pares de cebadores más un par de bases nucleotídicas y/o la longitud combinada de los pares de cebadores más aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ó 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 o más pares de bases nucleotídicas (más o menos cualquiera de los incrementos antes enumerados). Por otro lado, se puede derivar un par de cebadores de la secuencia flanqueante a ambos lados del ADN insertado a fin de producir un amplicón que incluye la secuencia nucleotídica completa de insertada. Puede haber un miembro de un par de cebadores derivado de la secuencia genómica de una planta situada a una distancia de la secuencia de ADN insertada. Esta distancia puede variar entre una base de nucleótidos hasta aproximadamente veinte mil pares de bases nucleotídicas. El uso del término "amplicón" excluye específicamente los dímeros cebadores que se puede formar en la reacción de amplificación térmica de ADN.

La amplificación de ácido nucleico se puede lograr por cualquiera de diversos métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Hay una variedad de métodos de amplificación conocidos en la técnica descritos, entre otros, en la patente de Estados Unidos No. 4,683,195 y la patente de Estados Unidos No. 4,683,202. Se han desarrollado métodos de amplificación por PCR para la amplificación de hasta 22 kb de ADN genómico. Estos métodos, como así también otros métodos conocidos en la técnica de amplificación de ADN se pueden utilizar para poner en práctica la presente invención. La secuencia del inserto de ADN heterólogo del transgen o la secuencia genómica flanqueante de un evento del maíz de la presente puede ser verificada (y corregida, si fuera necesario) mediante la amplificación de esas secuencias del evento utilizando cebadores derivados de las secuencias provistas en la presente seguida por secuenciación estándar de ADN del amplicón de PCR o del ADN clonado.

Se puede detectar el amplicón producido por estos métodos mediante una pluralidad de técnicas. La electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio es un método común muy conocido para detectar amplicones de ADN. Otro método de ese tipo es el Análisis de Bits Genéticos donde se diseña un oligonucleótido de ADN que se superpone tanto a la secuencia de ADN genómico flanqueante como al la secuencia de ADN insertado. Se inmoviliza el oligonucleótido en los pocilios de una placa de micropocillos. Después de la PCR de la región de interés (usando un cebador de la secuencia insertada y uno de la secuencia genómica flanqueante adyacente), se puede hibridar un producto monocatenario de la PCR al oligonucleótido inmovilizado y esto sirve como patrón para una reacción de prolongación de una sola base utilizando una ADN polimerasa y ddNTPs marcados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELLISA. Una señal indica la presencia de la secuencia insertada/flanqueante debido a la amplificación, hibridación y prolongación de base única satisfactorias.

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisorias y publicaciones mencionadas como referencia o citadas en la presente se incorporan a la presente como referencia en su totalidad en la medida en que no se contradigan con los conceptos explícitos vertidos en esta memoria descriptiva.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Aislamiento de ADN genómico total v cuantificación y amplificación con cebadores de PCR Se llevó a cabo el aislamiento de ADN genómico de homocigotas, hemicigotas de CryI F y muestras de tipo salvaje de las muestras individuales troquelando ocho discos foliares por muestra y moliendo los discos hasta obtener un polvo fino utilizando un Genogrinder 2000. Se extrajo el ADN empleando kits para plantas ChargeSwitch® gDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) o los kits Qiagen DNeasy de 96 pocilios (Valencia, CA). Con anterioridad a la PCR, se cuantificaron muestras de ADN con el kit de Cuantificación Quant-iT™ PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando las instrucciones del fabricante.

Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos y sondas TaqMan con doble marca con FAM y desactivador Black Hole Quencher 1 (BHQ1) mediante MWG Biotech (High Point, NC) (Cuadral B).

CUADRO 1 B Secuencias de los Cebadores y Sondas TaqMan con Doble Marca SEQ longitud del No. de nombre nombre ID producto gen acceso oligo original secuencia NO: de PCR TC1507- F MaiY-F1 5'-TAGTCTTCGGCCAGAATGG-3' 4 . hmg-F 5TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA3' 16 79 hmga AJ131373 hmg-R 5'GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT3' 17 5'-Cy5-CAATCCACACAAACGCACGCGTA- hmg-P BHQ2-3' 18 ze¡n-F 5TGCAGCAACTGTTGGCCTTA3' 19 72 zeina X07535 zein-R 5TCATGTTAGGCGTCATCATCTGT3' 20 Se sintetizaron sondas TaqMan con doble marca con Cy5 y BHQ2 mediante IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Se disolvieron todos los cebadores en 1x Tris-EDTA a 200 µ? y las sondas a 100 µ?. Se diluyeron las reservas de trabajo de los cebadores y las sondas TaqMan con doble marca 10 veces con agua de grado molecular.

Se configuraron las reacciones de PCR de acuerdo con los Cuadros 2A, 2B y 2C para las reacciones mono-plex, utilizando concentraciones de MgC de 2.5 mM a 5.5 mM.

CUADRO 2A Mezcla de PCR para cada reacción con un volumen final de 25 ul (MqCb 2.5 mM) Componente Volumen (µ?) Agua 16.85 buffer 10XPCR (con MgCI2 15m) 2.5 MgCI225 mM 1 dNTP 10 mM (2.5mM cada uno) 0.75 Cebador directo - 20 µ? 0.25 Cebador inverso - 20 µ? 0.25 Sonda con doble marca - 10 µ? 0.2 HotStarTaq (511/µ?) 0.2 Patrón de ADN genómico 3 (I Ong/µ?) Volumen total de la reacción 25.00 CUADRO 2B Mezcla de PCR para cada reacción con un volumen final de 25 µ? (MgCU 4 mM) Componente Volumen (µ?) Agua 16.85 buffer 10XPCR (con MgCI2 15m) 2.5 gCI225 mM 1 dNTP 10 mM (2.5mM cada uno) 0.75 Cebador directo - 20 µ? 0.25 Cebador inverso - 20 µ? 0.25 Sonda con doble marca - 10 µ? 0.2 HotStarTaq (51?/µ?) 0.2 Patrón de ADN genómico 3 dOng/µ?) Volumen total de la reacción 25.00 CUADRO 2C Mezcla de PCR para cada reacción con un volumen final de 25 ul (MgC 5.5 mM) Componente Volumen (µ?) Agua 13.85 buffer 10XPCR (con MgCI2 15m) 2.5 MgCI225 mM 4 dNTP 10 mM (2.5mM cada uno) 0.75 Cebador directo - 20 µ? 0.25 Cebador inverso - 20 µ? 0.25 Sonda con doble marca - 10 µ? 0.2 HotStarTaq (5?/µ?) 0.2 Patrón de ADN genómico 3 d Ong/µ?) Volumen total de la reacción 25.00 Las reacciones de PCR para las reacciones múltiples fueron configuradas de acuerdo con el cuadro 3. Se utilizó la ADN polimerasa Taq HotStar (HotStar Taq, 10x Buffer de PCR y MgCI2 25 mM) de Qiagen (Valencia, CA, # de Catálogo 203203 o 203205) y Mezcla Nucleotídica dNTP 10 mM de Applied Biosystems (Foster City, CA, # de Catálogo N8080260). Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en una disposición óptica iCiclor (BioRad, Hercules, CA) comenzando con 15 minutos de desnaturalización a 95°C según la recomendación, seguida por 50 ciclos de 95 °C por espacio de 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto. Se registraron las señales de fluorescencia al final de cada ciclo.

Los ensayos de PCR TaqMan de punto final fueron establecidos de acuerdo con el Cuadro 3. Se utilizó la Disposición de PCR ABI GeneAmp® 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) para la amplificación. Se midieron los productos de PCR ya sea mediante E-Gel al 4% (Invitrogen, Carlsbad, CA) o mediante un espectrofluorómetro (Tecan GENios, Mánnedorf, Suiza) después de un número óptimo de ciclos, que se determinó que era de 28 ciclos (Cuadro 4).

CUADRO 3 Mezcla de PCR para cada reacción biplex con un volumen final de 25 µ?.

Componente Volumen (µ?) Agua 13.15 buffer 10XPCR (con MgCI2 15m) 2.5 MgCI225 mM 4 dNTP 10 mM (2.5mM cada uno) 0.75 Cebador directo TC1507 - 20 µ? 0.25 Cebador inverso TC1507 - 20 µ? 0.25 Sonda TC1507 con doble marca - 10 µ? 0.2 Cebador directo endógeno - 20 µ? 0.25 Cebador inverso endógeno - 20 µ? 0.25 Sonda Endógena con doble marca - 10 µ? 0.2 HotStarTaq (SU/µ?) 0.2 Patrón de ADN genómico 3 Volumen total de la reacción 25.00 CUADRO 4 Configuración del Instrumento con las longitudes de onda recomendadas para la lectura de los productos de PCR.

Tintura Excitación (nm) Emisión (nm) FAM 485 535 Cy5 612 670 El umbral de PCR en tiempo real fue calculado automáticamente por el software iCiclor (versión 3.0a), con un valor de fluorescencia ligeramente superior al fondo. Se determinó el ciclo umbral (valor Ct) por el número de ciclos necesarios para generar fluorescencia por encima del umbral establecido. Se estimaron las eficiencias de PCR sobre la base del ADN genómico ingresado y los valores Ct.

Se calcularon las relaciones de señal sobre fondo de FAM contra Cy5. Se representaron los valores absolutos de las relaciones correspondientes a cada población en Excel. Las aciertos de genotipos se basaron en los controles (homocigotas, hemicigotas y de tipo salvaje), como así también en las distribuciones agrupadas de las poblaciones segregadas.

EJEMPLO 2 Eficiencia de PCR correspondientes a los genes endógenos de maíz Un aspecto del desarrollo de un ensayo de cigosidad TaqMan de punto final fue la selección del gen endógeno más adecuado como gen de referencia. Elegimos la invertasa, un gen de referencia adecuado, que es específico de la especie y tiene un bajo número de copias en el genoma. En un principio se investigaron cuatro genes endógenos del maíz, alcohol deshidrogenasa 1 (adM ), proteína a del grupo de alta movilidad (hmga), invertasa (ivr), y zeína (zein), de los miles de posibilidades, como posibles genes de referencia CryI F del maíz en el evento TC1507.

El procedimiento de selección de un gen de referencia adecuado conllevó agrupar, en primer lugar, 30 ng de homocigotas, hemicigotas de CryI F extraídos y controles de ADN genómico del maíz de tipo salvaje (extraídos de acuerdo con el procedimiento de aislamiento descrito en este Ejemplo) para estimar la eficiencia de PCR de todos los cebadores. La PCR correspondiente a TC 507 y los cinco genes de referencia seleccionados inicialmente (ivr, ivr104, adh, hmg, zein) fue configurada de acuerdo con el Cuadro 2C. A continuación se visualizaron los productos de PCR al cabo de 32 conE-gel al 4%. Todos los cebadores amplificaron los fragmentos de tamaño estimado y cuatro genes de referencia tuvieron bandas con similares intensidades. El ensayo de la opción de gen de referencia adh produjo menos producto que los otros ensayos con genes de referencia seleccionados inicialmente. Los oligos específicos del evento TC1507 sólo produjeron amplicones en los controles homocigotos y hemicigotos, con una banda más luminosa en el caso de las muestras homocigotas.

En el caso del ensayo TaqMan de punto final, se amplificaron tanto las reacciones del transgen como del gen de referencia en una reacción única (múltiplex). En un intento por obtener eficiencias de PCR óptimas para ambos genes, se analizaron todos los cebadores por triplicado con concentraciones variadas de MgC en 30 ng de ADN genómica de las muestras homocigotas utilizando PCR en tiempo real (ver los Cuadros 2A, 2B y 2C).

El Cuadro 5 presenta los valores Ct de la PCR en tiempo real correspondiente a ivr, adh, ivr104, hmg, zein y TC1507 con 30 ng de ADN genómico de homocigotas CryI F en diferentes concentraciones de MgC^.

CUADRO 5 MgCI2 ivr adh ivr104 hmq Zein TC1507 2.5mM 25.6 26.2 25.7 23.95 25.4 21.75 4mM 25.85 28.45 24.95 23.3 20.9 21.15 5.5mM 25.15 26.15 24.7 23.2 20.65 20.65 Los valores medios del umbral de los ciclos (Ct) correspondientes al gen de referencia de zeína seleccionado inicialmente y TC1507 fueron similares (aproximadamente 21 ) con una elevada concentración de MgC (4 mM y 5.5 mM), en tanto que los valores medios correspondientes a los genes de referencia ivr y hmg seleccionados inicialmente tuvieron valores Ct más elevados (de ~ 23 a ~25). El gen de referencia adh seleccionado inicialmente tuvo valores Ct superiores a 26 y se lo eliminó como opción. La concentración de MgCI2 de 5.5mM arrojó el valor Ct más bajo para la reacción de amplificación de todos los genes analizados y, por consiguiente, se la utilizó en los experimentos subsiguientes.

Se multiplexaron los cebadores para los genes de referencia inicialmente seleccionados ivr, ivr104, hmg y zein con TC1507 usando PCR en tiempo real de acuerdo con el Cuadro 3, cono una dilución en serie 1 :2 del ADN de las homocigotas agrupadas (ejecutada por triplicado).

Una vez más se utilizaron los valores Ct para comparar las eficiencias de la PCR. La figura 2 ilustra combinaciones biplex de TC1507 don los diferentes genes de referencia investigados. Los valores Ct de TC1507 demostraron aproximadamente un ciclo de diferencia entre cada dilución. La eficiencia de PCR en el caso de TC1507 fue de 100%. Los genes de referencia exhibieron tan buena eficiencia como las reacciones con en la mayoría de las diluciones.

EJEMPLO 3 Análisis de ensayo TaqMan de punto final para la determinación de genotipos de cigosidad Se utilizó una población de pila simple de CryI F (Q:07K:PF04DS_ZYGO), con segregación de TC1507, para evaluar la formación de múltiplex de un gen de referencia (ivr, ivrl 04, hmg o zein) con TC1507 utilizando PCR TaqMan de punto final (Cuadro 3). Con anterioridad a la PCR TaqMan de punto final, se normalizó el ADN a 10 ng/µ?. Se interrumpieron las reacciones de PCR TaqMan a los 28 ciclos y luego se las midió con un espectrofluorómetro. Se calcularon las señales de fluorescencia de FAM (TC1507) sobre el fondo (H20), como señal sobre fondo 1 (SOB1), y Cy5 (gen de referencia) sobre fondo 2 (SOB2). Se representaron las relaciones de SOB1/SOB2 en forma de tratado de difusión en Excel. En una población con segregación, se deben obtener tres grupos de puntos de datos dejando que los puntos de corte se determinen visualmente. Se descubrió que sólo Ivr104 multiplexado con TC1507 en las condiciones de reacción aquí descriptas podría tener aciertos genotípicos inequívocos. Las otras reacciones con los genes de referencia seleccionados inicialmente (ivr, hmg y zein) no llegaron a producir una separación suficiente entre homocigotas y hemicigotas para determinar aciertos genotípicos inequívocos.

EJEMPLO 4 Uso del protocolo con poblaciones diferentes Se sabe que el análisis de cigosidad invader y basado en PCR (5) puede ser afectado por los antecedentes genéticos de las plantas. Se analizó el ensayo de cigosidad TaqMan de punto final para el evento de Herculex I TC1507 para determinar el efecto que tienen en el mismo los antecedentes genéticos de las plantas con tres poblaciones, de diferentes trasfondos genéticos. Cada fondo consistió en 184 muestras (don placas de ADN de 96 pocilios). Las tres poblaciones fueron: pilas dobles de Cry34/35_PoCry1 F y PoCry1 F_NK603 y pila simple de PoCryI F. Como se ilustra en la figura 4A y la figura 4B, tanto Cry34/35_PoCry1 F como PoCryI F produjeron los tres cúmulos típicos con homocigotas en la parte superior, hemicigotas en la parte media y el tipo salvaje (WT) en la base, en tanto que PoCry1 F_NK603 (Figura 4C) sólo tuvo dos cúmulos (homocigotas y hemicigotas) dado que las plantas WT, como se esperaba, no sobrevivieron al rocío con herbicidas. Comparando los resultados con los ensayos Invader, 98.8% de las puntuaciones son iguales entre ambos análisis. En siete plantas con discrepancia de puntuación, 6 homocigotas del ensayo Invader resultaron ser hemicigotas al analizarlas con TaqMan de punto final. Una hemicigota se tornó homocigota.

Un ensayo de cigosidad firme requiere que dos alelos de un gen de interés se distingan claramente en una población a segregar. Como se describe en este estudio, diferentes genes de referencia también pueden contribuir a diferencias significativas de los resultados. Además, los hallazgos de genotipos se deben basar en los cúmulos de datos de cada población.

Se determinó que el gen endógeno del maíz Invertasa era un gen de referencia adecuado para el evento TC1507 del maíz. Por tal motivo, se desarrolló un análisis de cigosidad específico para el evento TC1507 por PCR TaqMan de punto final biplex de alto rendimiento, con capacidad para producir genotipos robustos de acuerdo con el Ejemplo 5.

EJEMPLO 5 Uso de Invertasa en la PCR TaqMan de punto final biplex de alto rendimiento para Determinar la Cigosidad del Evento TC1507 de Herculex® I en el Maíz Se establecen, por lo general, condiciones de PCR y ciclado térmico que amplifiquen tanto las secuencias del transgen como del gen de referencia en un patrón conocido de ADN genómico con unidades de fluorescencia relativa aceptables (RFU). Si el gen endógeno de referencia no se amplifica o si las secuencias del transgen no se amplifican en las lecturas de fluorescencia 0.5-1 unidad más que el control transgénico, se puede realizar la optimización variando la concentración de los cebadores y/u otros parámetros.

ADN Patrón Se muestrearon ocho discos foliares por muestra y se preparó ADN patrón de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kit de Extracción de ADN Genómico (kit DNeasy de 96 pocilios, Qiagen, Valencia, CA, # de Catálogo 69181 ) o equivalente). (Se puede encontrar una descripción más detallada de algunos materiales adicionales y sus fuentes en el Ejemplo 1.) En general, 30 ng de ADN genómico total por cada 25 µ? de reacción dio los mejores resultados.

Sustancias de Ensayo y Control Las muestras de ADN de maíz control negativo fueron de ADN foliar de maíz no transgénico o transgéníco sin contenido del Evento TC1507 Herculex® I.

Las muestras de ADN de maíz Herculex® I Evento TC1507 eran muestras de ADN de hojas de maíz transgénico que contenía el Evento TC1507 de Herculex® I que era hemicigoto u homocigoto. Se puede preparar una muestra hemicigota si no se dispone de una, combinando proporciones iguales de ADN control negativo con ADN de maíz Herculex® I homocigoto.

Los controles positivos y negativos están ilustrados en el Cuadro 6.

CUADRO 6 Procedimiento para la Extracción, Purificación y Cuantificación de ADN Se llevan a cabo los siguientes pasos en orden consecutivo.

Se troquelan 8 discos foliares por muestra y se los transfiere a tubos de colección Qiagen. Se limpia el troquel después de cada muestreo con alcohol al 70% seguido por un rápido enjuague con agua y luego se seca con un paño.

Se prepara el buffer de extracción de ADN de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Se determina la concentración de ADN empleando el Kit de Cuantificación Quant-iT™ PicoGreen® y un espectrofotómetro o equivalente.

Condiciones de PCR Se llevaron a cabo los siguientes pasos en orden sucesivo.

Preparar la siguiente mezcla de reacción como Mezcla Maestra que contiene todos los componentes excepto los patrones de ADN. Al preparar la mezcla, hay que asegurarse de que sea suficiente para 10% más reacciones de las necesarias en realidad.

Los siguientes fueron los componentes para la reacción en biplex con contenido del Evento TC1507 de Herculex® I y los oligonucleótidos del gen endógeno de invertasa (se normalizaron las concentraciones de todas las muestras de ADN): CUADRO A Se prepararon cebadores y sondas y se los utilizó de la siguiente CUADRO 7 Lista de secuencias de cebadores y sondas CUADRO 8 Preparación de soluciones madre de cebadores (200 uM).

Se tomaron alícuotas de la reserva de cebadores y se las diluyó 1 : 10 con H2O hasta obtener una concentración final de trabajo de 20 µ?.

CUADRO 9 Preparación de soluciones madre (reserva) de sondas (100 uM).

Se tomaron alícuotas de la reserva de sondas y se las diluyó 1 :10 con H2O hasta obtener una concentración final de 10 µ?. Las sondas son fotosensibles y deben ser almacenadas en la oscuridad en lo posible. Se deben preparar múltiples alícuotas de cada sonda para minimizar el número de ciclos de congelación y descongelación.

Se prepararon ensayos de PCR con los controles apropiados. Cuando se utiliza una placa de 96 pocilios, se recomienda utilizar los siguientes pocilios para los controles: H11 - H12 = controles negativos (reactivos pero sin ADN), A1 = control positivo homocigota con contenido de ADN genómico del maíz Herculex® I TC1507; A2 = control positivo hemicigota con contenido de ADN genómico del maíz Herculex® I TC1507; A3= control negativo con contenido de ADN genómico aunque sin el Evento TC 507 Herculex®, y A4 - H10 = muestras desconocidas.

Se amplificó ADN en una Disposición de PCR GenAmp 9700 en las siguientes condiciones: CUADRO B Se analizaron las muestras de la siguiente manera.

Configuración del Instrumento: las longitudes de onda recomendadas para la lectura de los resultados de la PCR son las siguientes.

CUADRO C Las muestras sin contenido del ADN genómico del Evento TC1507 Herculex® I sólo dan lugar lecturas de RFU correspondientes a la sonda de FAM por lo menos 0.5-1 unidad más elevadas que la del control de fondo negativo. Si las muestras no dan productos de PCR para los alelos del transgen o del gen endógeno, el ADN puede no ser de la calidad o cantidad adecuada. En ese caso, se debe realizar la preparación de un nuevo ADN o una nueva reacción. Los resultados son aceptables cuando: * los controles hemicigotos y homocigotos conocidos exhiben lecturas de fluorescencia relativamente elevadas en el caso del Evento TC1507 Herculex® I y el gen de referencia de invertasa. Una lectura de 0.5-1.0 unidad debe separar las relaciones SOB1/SOB2 entre los dos controles. * el control negativo debe exhibir lecturas de fluorescencia muy bajas tanto en el caso de Herculex® I Evento TC1507 como en los genes de referencia. * el ADN control no transgénico debe exhibir la lectura de fluorescencia correspondiente al gen de referencia solamente.

Una vez completada la PCR TaqMan y la lectura de fluorescencia, se generó un gráfico de distribución (Cuadro 10, Figura 1 ). Los controles 'de tipo salvaje' (Wt), 'hemicigotos' y 'homocigotos' de similar trasfondo genotípico pueden servir como controles negativos y positivos. En una población para la segregación, se deben obtener tres cúmulos de datos permitiendo la determinación visual de los puntos de corte. Estos puntos de corte son arbitrarios y la separación entre los cúmulos es habitualmente de aproximadamente 0.5-1 unidad. Sin embargo, los puntos de datos podrían ser difusos debido a la variabilidad del ensayo. En el caso del ejemplo ilustrado a continuación, se distinguen claramente tres cúmulos de datos. Los puntos de datos correspondientes al tipo salvaje son de menos de 0.5, los de las muestras "hemicigotas" están en el rango de 0.5-1.1 y las correspondientes a las 'homocigotas' son superiores a 1.1.

Cuadro 10. Ejemplo de Cuadro de Datos. Reporterol = lectura de FAM, Reportero2 = lectura de Cy5, SOB1 = Señal sobre el fondo de FAM (relación de la señal de la muestra sobre el promedio de la señal de fondo a 535 nm), SOB2 = Señal sobre fondo de Cy5 (relación de la señal de la muestra sobre el promedio de la señal de fondo a 670 nm), Relación = S0B1/S0B2 (valor absoluto), Hallazgo = Interpretación de las muestras de tipo salvaje (relación < 0.5), hemicigotas (relación > 0.5 pero < 1.1 ), y homocigotas (relación > 1.1 ) correspondientes a Herculex®! Evento TC1507.

CUADRO 10 Al completarse la PCR y las lecturas de fluorescencia, se generó un gráfico de distribución de la manera antes descripta. Ver la Figura 1.

Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la cigosidad de un evento TC1507 en un tejido de Zea mays, donde dicho evento TC1507 comprende el constructo de un transgen que comprende un gen cryI F, dicho método comprende utilizar un ensayo de PCR Taq de punto final basado en fluorescencia para detectar dicho evento TC1507 y un gen de referencia endógeno, dicho método comprende: obtener una muestra de ADN genómico de dicho tejido de Zea mays, poner en contacto a dicha muestra con a. cebador directo para el evento y un cebador inverso para el evento, donde por lo menos uno de dichos cebadores para el evento se une específicamente a dicho constructo de transgen y donde dichos cebadores producen un amplicón del evento diagnóstico de dicho evento, cuando éste está presente en dicha muestra; b. un cebador directo de referencia y un cebador inverso de referencia que producen un amplicón de referencia de dicho gen endógeno de referencia; c. una sonda fluorescente para el evento que se híbrida con dicho amplicón del evento; d. una sonda fluorescente para el evento que se híbrida con dicho amplicón de referencia, cuantificar dicha sonda fluorescente del evento que se ha hibridado a dicho amplicón del evento, cuantificar dicha sonda fluorescente de referencia que se ha hibridado a dicho amplicón de referencia, comparar las cantidades de la sonda fluorescente hibridada del evento con la sonda fluorescente hibridada de referencia y determinar la cigosidad de TC1507 comparando las relaciones de florescencia de la sonda fluorescente hibridada del evento y la sonda fluorescente hibridada de referencia.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque un cebador del evento se híbrida a una secuencia flanqueante de TC1507 y un cebador del evento se híbrida a dicho constructo transgénico.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha secuencia flanqueante de TC1507 es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho constructo transgénico consiste en los residuos 2830-9015 de SEQ ID NO: 3.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho gen de referencia es el gen endógeno de invertasa de Zea mays.

6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha secuencia flanqueante abarca los residuos 2629-2829 de SEQ ID NO: 3.

7. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha secuencia flanqueante abarca los residuos 9016-9216 de SEQ ID NO: 3.

8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho método se utiliza para la reproducción de la introgresión del evento TC1507 en otra línea de maíz.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha otra línea de maíz es una línea Zea mays sin TC1507.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho amplicón del evento tiene 58 pares de bases.

1 1. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho gen de referencia comprende o se híbrida a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos cebadores de referencia comprenden SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y dicha sonda de referencia comprende SEQ ID NO: 9.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichas sondas están marcadas con una tintura fluorescente y un desactivador.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha sonda del evento comprende FAM como tintura fluorescente en el extremo 5' de dicha sonda del evento y un Black Hole Quencher 1 (BHQ1) como desactivador en el extremo 3' de dicha sonda del evento.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho gen de referencia es un gen endógeno conservado del maíz con capacidad para la amplificación por PCR de una sola o un bajo número de copias.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha sonda de referencia está marcada con Cy5 en el extremo 5' de dicha sonda de referencia y un Black Hole Quencher 2 (BHQ2) en el extremo 3' de dicha sonda de referencia.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caractenzado además porque dicho amplicón de referencia es un fragmento de 104 pares de bases amplificado por dichos cebadores.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha sonda de referencia comprende SEQ ID NO: 9.

19. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho cebador directo de referencia comprende SEQ ID NO: 7 y dicho cebador inverso de referencia comprende SEQ ID NO: 8.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los resultados del cual son leídos directamente en un lector de placas.

21. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha muestra es obtenida de una planta de maíz en un campo.

22. Un kit para poner en práctica el método de la reivindicación 1 , dicho kit que comprende: a. un cebador directo del evento y un cebador inverso del evento, donde por lo menos uno de dichos cebadores del evento se une específicamente a dicho constructo del transgen cryI F, y donde dichos cebadores producen un amplicón del evento que es diagnóstico de dicho evento, cuando éste está presente en dicha muestra; b. un cebador directo de referencia y un cebador inverso de referencia que producen un amplicón de referencia a partir de dicho gen endógeno de referencia; c. una sonda del evento que se híbrida a dicho amplicón del evento; y d. una sonda de referencia que se híbrida a dicho amplicón de referencia.