KR20120107998A

KR20120107998A - Ｔｃ１５０７ 이벤트를 포함하는 옥수수의 접합성 측정을 위한 종료점 태크맨법

Info

Publication number: KR20120107998A
Application number: KR1020127018679A
Authority: KR
Inventors: 웨이 첸; 웨슬리 마키원; 스티븐 노박; 만주 구프타; 토마스 더블유 그린; 시바 쿰파틀라
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-10-04
Also published as: RU2012130431A; JP2013514780A; EP2513326A4; AU2010330806A1; CN102770553A; WO2011075648A1; EP2513326A1; MX2012007136A; CL2012001644A1; ZA201204913B; BR112012014929A2; US20110151441A1; CA2783254A1; CO6511270A2; AR079520A1

Abstract

옥수수 Cry1F 이벤트 TC1507의 접합성 분석 방법이 제공된다. 상기 방법은 TC1507 이벤트-특이적이며 옥수수 내생 참조 유전자-특이적인 프라이머들, 그리고 TC1507의 분자 번식을 돕기 위한 강력한 유전형 선언을 창출할 수 있는 종료점 복식 태크맨 PCR 분석에서 사용하기 위한 태크맨 프로브 조합을 제공한다.

Description

ＴＣ１５０７ 이벤트를 포함하는 옥수수의 접합성 측정을 위한 종료점 태크맨법 {ENDPOINT TAQMAN METHODS FOR DETERMINING ZYGOSITY OF CORN COMPRISING TC1507 EVENTS}

헤르큘렉스(Herculex)® I는 곤충 손상(insect damage) (특히 유럽 옥수수 명나방(European corn borer)에 의한 것)에 대하여 내성인 Cry1F 이벤트(event) TC1507을 포함하는 시중의 옥수수 제품이다. 상기 이벤트 자체에 대해서는 예를 들면 U.S. 특허 제7,605,310호 및 7,449,564호에 개시되어 있다.

다양한 방법들이 옥수수의 샘플에서 이와 같은 이벤트의 존재를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 일 예는 문헌 [Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000)]에 기술되어 있는 바와 같은 피로시퀀싱(Pyrosequencing) 기술이다. 상기 방법에서는, 인접되어 있는 게놈 DNA와 삽입 DNA 연결부에 중복되는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 해당 영역으로부터의 단일-가닥 PCR 생성물 (삽입된 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹(flanking) 게놈 서열에서 하나)에 혼성화된 후, DNA 폴리머라제, ATP, 술푸릴라제, 루시퍼라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재하에 배양된다. DNTP가 개별적으로 첨가되고, 통합은 광 신호를 야기하며, 그것이 측정된다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다염기 연장으로 인한 이전유전자(transgene) 삽입/플랭킹 서열의 존재를 표시해준다 (이와 같은 기술은 보통 그것이 알려져 있는 경우의 특정 유전자의 검출이 아니라, 최초 서열분석에 사용됨).

형광 편광(Fluorescence Polarization)은 앰플리콘(amplicon)을 검출하는 데에 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 상기 방법에 따르면, 게놈상 플랭킹 및 삽입 DNA 연결부에 중복되도록 뉴클레오티드가 설계된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 해당 영역으로부터의 단일-가닥 PCR 생성물 (삽입된 DNA에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 DNA 서열에서 하나)에 혼성화된 후, DNA 폴리머라제 및 형광-표지된 ddNTP의 존재하에 배양된다. 단일 염기 연장은 상기 ddNTP의 통합을 야기한다. 통합은 형광측정기를 사용하여 편광의 변화로서 측정될 수 있다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장으로 인한 이전유전자 삽입/플랭킹 서열의 존재를 표시해준다.

태크맨(TAQMAN) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재)은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법이다. 간단하게 말하면, 이벤트-특이적 검출을 위해 전이유전자 내의 하나의 올리고(oligo) 및 플랭킹 게놈 서열의 하나를 가지는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. 상기 FRET 프로브 및 PCR 프라이머들 (삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 하나)은 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에 순환된다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브 상 켄칭(quenching) 잔기로부터의 형광 잔기의 절단 및 방출 이탈을 야기한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹/이전유전자 삽입 서열의 존재를 표시해준다.

분자 비콘(Molecular Beacon)이 서열 검출에서의 용도에 대하여 기술된 바 있다. 간단하게 말하면, 플랭킹 게놈 및 삽입 DNA 연결부에 중복되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. 상기 FRET 프로브의 독특한 구조는 그것이 형광 및 켄칭 잔기를 매우 가깝게 유지하는 2차 구조를 포함하도록 해준다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머들 (삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 하나)은 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에 순환된다. 성공적인 PCR 증폭 후, 표적 서열에의 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거, 및 형광 및 켄칭 잔기의 공간적 분리를 야기한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹 게놈/전이유전자 삽입 서열의 존재를 표시해준다.

또 다른 과제는 특히 주어진 시험을 위한 적합한 참조 유전자(reference gene)를 발견하는 것이다. 예를 들면, 체코우스키(Czechowski) 등이 요약에서 언급한 바와 같이, "아피메트릭스(Affymetrix) ATH1 전체-게놈 유전자칩(GeneChip) 연구에서의 예외적으로 큰 데이터 세트가 모델 식물 종인 아라비도프시스(Arabidopsis) (아라비도프시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana ))에서 매우 안정한 발현 수준을 가지는 새로운 세대의 참조 유전자를 식별하는 수단을 제공하였다. 발육 전체에 걸친 발현 안정성 면에서, 그리고 일정 범위의 환경 조건하에서 통상적인 참조 유전자들을 능가하는 수백종의 아라비도프시스 유전자들이 발견되었다" (문헌 [Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17.]).

문헌 [Brodmann et al. (2002)]은 유럽 연합에서 승인된 4종의 상이한 옥수수 변종에 대한 식품 중 유전자이전 옥수수 함량의 실시간 정량 PCR 검출에 관한 것이다 (문헌 [Brodmann, P.D., P.D., Ilg E.C., Berthoud H., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85 (3)]).

문헌 [Hernandez et al. (2004)]은 실시간 PCR에 사용 가능한 4종의 유전자에 대하여 언급하고 있다 (문헌 [Hernandez, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reation systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agric . Food Chem . 2004, 52, 4632-4637]).

문헌 [Costa et al. (2007)]은 상기 4종의 유전자를 고찰하여 (실시간 PCR 관련 내용 포함), 알콜 데히드로제나제 및 제인(zein) 유전자가 유전자이전 공급 혼합물 문제에서 샘플 "이벤트" (렉틴 유전자)를 검출하는 데에 가장 우수한 참조 유전자라는 결론을 내렸다 (문헌 [Costa, L.D., and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric . Food Chem. 2007, 55, 1264-1273]).

문헌 [Huang et al. (2004)]은 옥수수에서의 MON810 및 NK603 이전유전자 검출을 위한 참조 분자로서 플라스미드 pMulM2를 사용하였다 (문헌 [Huang and Pan, "Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods," J. Agric. Food Chem ., 2004, 52 (11), pp 3264-3268]).

문헌 [Gasparic et al. (2008)]은 옥수수 이벤트 (예컨대 MON810)를 정량적으로 분석함에 있어서, 순환 프로브(cycling probe) 기술, 태크맨, 및 다양한 실시간 PCR 화학과 비교하여 LNA 기술을 제안하였다 (문헌 [Gasparic, Cankar, Zel, and Gruden, "Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms," BMC Biotechnol. 2008; 8: 26]).

US 20070148646호는 통합된 뉴클레오티드의 양에 의해 검출 및 정량될 수 있는 개별 뉴클레오티드의 조절된 분배를 필요로 하는 정량용 프라이머 연장법에 관한 것이다. 이것은 내부 참조 유전자를 사용하는 태크맨 PCR법과는 상이하다.

TC1507의 동종접합성 및 반접합성 유전형 사이를 구별하기 위하여, 인베이더(Invader) 분석이 해당 이벤트에 성공적으로 사용된 바 있다 (문헌 [Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008, 21, 173-181]).

문헌 [Huabang (2009)]은 유전자이전 옥수수의 PCR-기반 접합성 시험에 관한 것이다. 그러나, 참조 유전자는 사용되지 않은 것으로 보인다 (문헌 [Huabang, "An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize," Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623]).

본 발명은 부분적으로 옥수수에서의 이벤트 TC1507의 접합성(zygosity)을 측정하기 위한 분자 분석에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 부분적으로 옥수수 내생 참조 유전자를 이용한, 옥수수에서의 헤르큘렉스(Herculex)® I 이벤트 TC1507에 대한 종료점 태크맨(endpoint TaqMan) PCR 분석에 관한 것이다. 일부 실시양태는 고도의 처리량으로 접합성 분석을 할 수 있는 분석에 관한 것이다. 본 발명은 또한 부분적으로 접합성 측정에 사용하기에 바람직한 참조 유전자의 발견에 관한 것이다.

도 1은 샘플 번호와 SOB1/SOB2 절대 비 사이 분포 그래프의 예를 나타낸다.
도 2는 TC1507의 조사된 상이한 참조 유전자들과의 복식 조합의 실시간 PCR 증폭 플롯이다. 각각 Cry1F 동종접합체 게놈 DNA의 2배 연속 희석액을 사용한, ivr (2a), hmg (2b), ivr104 (2c), 및 zein (2d)와의 TC1507의 복수체에 대한 실시간 PCR 증폭 플롯을 나타낸다. 그의 해당 플롯의 내부에는 각 희석액을 사용한 Ct값을 나타낸다.
도 3은 상이한 참조 유전자들을 사용한 종료점 태크맨에 의한 Cry1F 접합성 측정의 분포 그래프이다. 참조 유전자로서 ivr104 (a), ivr (b), hmg (c), 및 zein (d)을 사용한 분석에 있어서, 패널(panel)은 하기와 같다. PCR 및 형광 해독 완료시, 분포 그래프를 작성하였다: SOB1 = 바탕에 비교한 FAM의 신호 (535 nm에서의 바탕 신호 평균에 비교한 샘플 신호), SOB2 = 바탕에 비교한 Cy5의 신호 (670 nm에서의 바탕 신호 평균에 비교한 샘플 신호). ivr104 (a)에 있어서, SOB1/SOB2 < 0.5은 야생형으로, 0.5 < SOB1/SOB2 < 2는 반접합성으로, 그리고 SOB1/SOB2 > 2는 동종접합성으로 유전형 선언이 이루어질 수 있다.
도 4는 3개 군집 (각 군집에 대하여 2개 96웰 플레이트의 게놈 DNA)에서의 참조 유전자로서 ivr104를 사용한 종료점 태크맨 분석에 의한 Cry1F 접합성 측정의 실증을 나타낸다. PCR 및 형광 해독 완료시, 분포 그래프를 작성하였다: SOB1 = 바탕에 비교한 FAM의 신호 (535 nm에서의 바탕 신호 평균에 비교한 샘플 신호의 비), SOB2 = 바탕에 비교한 Cy5의 신호 (670 nm에서의 바탕 신호 평균에 비교한 샘플 신호의 비). 유전형 선언은 동종접합체, 반접합체 및 야생형의 구별되는 집단에 의해 적절하게 이루어졌다. 도 4a는 Cry34 /35 PoCry1F 적층 군집에서의 종료점 태크맨 분석을 사용한 Cry1F 접합성 측정의 분포 그래프이다. 도 4b는 PoCry1F 단일 적층 군집에서의 종료점 태크맨 분석을 사용한 Cry1F 접합성 측정의 분포 그래프이다. 도 4c (PoCry1F _ NK603)는 2개의 집단만을 가지는데 (동종접합체 및 반접합체), 예상대로 WT 식물이 제초제 분무에 생존하지 못하였기 때문이다.
[서열의 간단한 설명]
SEQ ID NO:1은 옥수수 이벤트 TC1507 5' 플랭킹 서열의 서열이다.
SEQ ID NO:2는 옥수수 이벤트 TC1507 3' 플랭킹 서열의 서열이다.
SEQ ID NO:3은 5' 플랭킹 서열, cry1F 삽입물, 및 3' 플랭킹 서열을 포함하는 옥수수 이벤트 TC1507에 있어서의 연속 서열이다.
SEQ ID NO:4-21은 본 발명에 따라 사용하기 위하여 예시된 프라이머 및 프로브들이다.

본 발명은 부분적으로 옥수수 Cry1F 이벤트인 TC1507의 고처리량 접합성 분석을 위하여 참조 (사본 수) 대조로서 내생 유전자를 이용하는 형광-기반 종료점 태크맨 PCR 분석에 관한 것이다. 본 발명은 또한 부분적으로 바람직한 참조 유전자인 인버타제( invertase )의 발견에 관한 것이다. 수종의 참조 유전자가 가능한 선택사항으로서 확인되었다.

본 발명은 또한 부분적으로 TC1507 이벤트 특이적 접합성 분석을 위한 복식 종료점(biplex endpoint) 태크맨 PCR의 개발에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 부분적으로 TC1507 번식 시험 키트(breeding test kit)의 개발에 관한 것이다.

종료점 태크맨 분석은 "플러스"는 분석되는 유전자에 대하여 샘플이 양성임을 표시하고, "마이너스"는 분석되는 유전자에 대하여 샘플이 음성임을 표시하는 플러스/마이너스 전략을 기반으로 한다. 이러한 분석은 통상적으로 각각 TC1507 전이유전자 서열 및 야생형 유전자 서열을 식별하기 위한 2세트의 올리고뉴클레오티드는 물론, 이전유전자 및 야생형 서열의 함량을 측정하기 위한 이중-표지 프로브를 이용한다.

인베이더 분석이 이러한 이벤트를 특성화함에 있어 강력한 기술이기는 하였지만, 그것은 DNA 품질에 매우 민감하다. 또한, 상기 분석은 많은 양의 DNA를 필요로 한다. 인베이더는 또한 적정하게 조작되지 않을 경우 인베이더 분석을 실패하게 할 수 있는 추가적인 변성 단계를 필요로 한다. 또한, 더 긴 분석 시간을 가지는 인베이더 분석은 상업적인 설정시 많은 수의 분석용 TC1507 샘플을 효율적으로 조작하는 그의 유연성에 있어서 제한된다. 본 발명의 한 가지 주된 장점은 시간 절약 및 변성 단계의 제거이다.

TC1507 이벤트를 검출하기 위한 본 종료점 태크맨 분석은 특히 많은 수의 샘플을 분석함에 있어서 인베이더에 비해 놀라운 장점을 제공한다. 그러나, TC1507에 대한 그의 적용이 복잡하였다. 일례로, TC1507의 경계 영역은 진정한 게놈 서열이 아니다. 예를 들어, 그것은 반복되는 플랭킹 서열을 포함한다. 그것은 이전유전자 단편 및 레트로트랜스포손(retrotransposon)을 포함하는 독특한 서열인데, 이는 본 문맥에서의 종료점 태크맨 분석 플러스/마이너스 전략의 실행에 매우 심각한 장애로 여겨져 왔다.

또한 예를 들면, 다수의 프라이머 및 프로브 조합들이 시도되었다. 그러나, 이러한 조합들 중 어느 것도 야생형 대립유전자와 이전유전자 사이를 구별할 수 있는 강력한 신호를 야기하지 않았다.

일 실시양태에서는, TC1507 이벤트-특이적 PCR 반응으로 옥수수 게놈 DNA에의 TC1507 구성체 카세트의 삽입으로부터 유래하는 이벤트 고유의 58-bp 단편을 증폭한다. TC1507 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 2종의 이벤트-특이적 PCR 프라이머들 사이의 표적에 결합되며, 형광 염료 및 켄처(quencher)에 의해 표지되어 있다. 가능한 형광 표지에는 TC1507 프로브 5' 말단의 리포터(reporter) 염료로서의 FAM 및 TC1507 프로브 3' 말단의 켄처로서의 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher) 1 (BHQ1)이 포함된다.

독자적인 판단과 함께 일련의 경험적 인자들을 사용하여, 단일 또는 적은 사본 수의 PCR 증폭을 할 수 있으며 많은 재배종에서 보존되는 것으로 입증된 옥수수 내생 유전자들을 경험적으로 확인하였다. 매우 많은 참조 유전자들이 가능하였다. 최초 평가시 선택한 것들을 TC1507 접합성 분석을 위한 가능한 참조 유전자로서 평가하였다. 하기 5세트의 올리고들 (표 1)이 선택되었다: ivr, ivr104 (인버타제 유래의 79 및 104 bp 단편), adh (adh1 유래의 136 bp 단편), hmg (hmga 유래의 79 bp 단편), 및 zein (제인 유래의 72 bp 단편). 일 실시양태에서는, 유전자 특이적 프라이머, 및 프로브 5' 말단에서 Cy5로, 그리고 프로브 3' 말단에서 블랙 홀 켄처 2 (BHQ2)로 표지된 유전자-특이적 프로브를, TC1507 접합성 분석을 위한 가능한 참조 유전자로 평가된 옥수수 내생 유전자에 있어서의 속성 정량에서의 사용에 대하여 평가하였다.

Cry1F 유전자 및 옥수수 내생 유전자용의 유전자-특이적 프라이머 및 프로브들을 PCR 효율에 대하여 시험하였다. Cry1F 이벤트 특이적 프라이머 및 프로브와 비교적 유사한 PCR 효율을 가진 것으로 확인된 옥수수 내생 유전자의 프라이머 및 프로브 조합들은 추가적으로 다중화(multiplexing) 능력 및 종료점 태크맨 접합성 분석에 이용하였다.

모든 올리고들을 PCR 효율에 대하여 시험하였다. 비교적 이벤트 특이적 올리고에 가까운 PCR 효율을 가지는 올리고들은 추가적으로 다중화 및 종료점 태크맨 접합성 분석에 이용하였다.

일부 실시양태에서, 이와 같은 접합성 분석은 TC1507 이벤트 및 옥수수 내생 참조 유전자 (일부 바람직한 실시양태에서는 인버타제)에 특이적인 올리고뉴클레오티드들의 복수체를 동일한 증폭 분석에 이용한다. 접합성은 참조 DNA에 비교하였을 때의 이벤트 TC1507에 대하여 특이적인 형광의 상대적 강도로 측정된다.

일부 실시양태에서, TC1507 이벤트-특이적 분석은 옥수수 게놈 DNA에의 TC1507 구성체 카세트의 삽입으로부터 유래하는 이벤트 고유의 58-bp 단편을 증폭한다. 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 2종의 이벤트-특이적 TC1507 PCR 프라이머들 사이의 표적에 결합되며, 하기 2종의 형광 염료에 의해 표지되어 있다: 리포터 염료로서의 해당 5' 말단의 FAM 및 켄처 염료로서의 해당 3' 말단의 BHQ. PCR 생성물은 적정한 수의 순환 후, 반응이 초기 지수 단계에 있을 때에 측정된다.

일부 실시양태에서, 옥수수-특이적 참조 시스템은 인버타제 유전자의 104 bp 단편을 증폭한다. 인버타제 특이적 올리고, 및 3' 말단의 Cy5 및 5' 말단의 BHQ로 표지된 인버타제 유전자-특이적 프로브의 쌍이 속성 정량에 사용된다.

일부 실시양태에서는, TC1507 접합성 분석을 위한 형광-기반 종료-점 태크맨 분석이 옥수수 중 헤르큘렉스^® I 이벤트 TC1507 및 참조 유전자의 식별을 위한 플레이트 해독기(plate reader)에서 결과가 바로 해독되도록 해준다.

본 발명에는 다른 옥수수 주에의 헤르큘렉스^® I의 유전자이입(introgression)을 시험하는 것과 같은 번식 적용분야가 포함된다.

본 발명의 검출 방법 및 키트는 본 발명에 따라 이벤트를 식별하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트는 가속화된 번식 전략에, 그리고 연관 데이터를 확립하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 검출 기술은, 식물 번식과 관련하여, 자손에 1종 이상의 추가적인 관심 특질을 부여하고자 하는 노력의 일환으로, 관심 이벤트를 포함하는 모체 식물이 또 다른 식물 주와 교배된 후에, 어떤 자손 식물이 해당 이벤트를 포함하고 있는 지를 측정하는 데에 특히 유용하다. 이러한 태크맨 PCR 분석법은 특히 상업화된 유전자이전 옥수수 종자에 있어서, 옥수수 번식 프로그램은 물론 품질 제어에도 유익하다. 이제는, 이러한 유전자이전 옥수수 주를 위한 태크맨 PCR 검출 키트도 제작되어 사용될 수 있다. 이는 제품 등록 및 제품 식품화(stewardship)에도 유익할 수 있다.

또 다르게는, 본 발명은 이전유전자 통합 과정, 게놈 통합 부위 특성, 이벤트 분류, 이전유전자 및 그의 플랭킹 서열의 안정성, 그리고 유전자 발현 (특히 유전자 잠복화, 이전유전자 메틸화 패턴, 위치 효과, 및 잠재적인 발현-관련 요소 예컨대 MARS [매트릭스 부착 영역] 등과 관련된 것)을 연구하고 특성화하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명에는 또한 1측 이상 모체로서의 TC1507 식물을 사용한 잡종의 제조 방법이 포함된다. 예를 들면, 본 발명에는 본원에서 예시되는 식물들 중 어느 것을 1측 또는 양측 모체로 가지는 F₁ 혼성 식물이 포함된다. 본 발명에는 예시된 식물을 상이한 (예컨대 순계 모체(in-bred parent)) 식물과 교배시키는 것, 생성되는 혼성 종자를 수확하는 것, 및 상기 종자/식물 샘플을 본 발명에 따라 시험하는 것에 의한 F1 혼성 종자의 제조 방법이 포함된다. 생성되는 식물의 특성은 모체 식물의 신중한 선택에 의해 향상될 수 있다.

곤충-내성 옥수수 식물은 먼저 본원에서 언급되는 주들 중 어느 하나의 종자로부터 생육된 옥수수 식물로 구성되는 제1 모체 옥수수 식물과 제2의 모체 옥수수 식물을 유성 교배시킴으로써, 다수의 1대 자손 식물을 생성시키는 것; 그리고 다음에 곤충에 대하여 내성인 (또는 1종 이상의 본 발명 이벤트를 보유하는) 1대 자손 식물을 선택하는 것; 및 상기 1대 자손 식물을 자가생식시킴으로써, 다수의 2대 자손 식물을 생성시키는 것; 및 다음에, 상기 2대 자손 식물에서 곤충에 대하여 내성인 (또는 1종 이상의 본 발명 이벤트를 보유하는) 식물을 선택하는 것에 의해 품종개량될 수 있다. 이러한 단계들에는 또한 상기 1대 자손 식물 또는 2대 자손 식물의 상기 제2 모체 옥수수 식물 또는 제3 모체 옥수수 식물에 대한 역-교배가 포함될 수 있다. 본 발명의 옥수수 종자를 포함하는 옥수수 작물, 또는 그의 자손은 이후 식재될 수 있다.

2종의 상이한 유전자이전 식물이 교배되어, 2종의 독립적으로 따로 첨가된 외래 유전자들을 포함하는 자손을 생성시킬 수도 있다는 것 역시 이해되어야 한다. 적절한 자손의 자가생식(selfing)은 첨가된 양 외래 유전자에 대하여 동종접합성인 식물을 생성시킬 수 있다. 무성 번식에서와 같이, 모체 식물에 대한 역-교배 및 비-유전자이전 식물에 대한 이종-교배 역시 시도된다. 상이한 특질 및 작물에 통상적으로 사용되는 기타 번식 방법들에 대해서는 업계에 알려져 있다. 역교배 번식은 단순하게 유전되는 고유전성 특질의 유전자를 반복친(recurrent parent)인 원하는 동종접합성 재배종 또는 순계 주에 이전하는 데에 사용되어 왔다. 이전될 특질의 공급원은 공여 모체(donor parent)로 지칭된다. 생성되는 식물은 반복친 (예컨대 재배종)의 속성 및 공여 모체로부터 이전된 원하는 특질을 가질 것으로 기대된다. 최초 교배 후, 공여 모체의 표현형을 보유하는 개체들이 선택되어, 반복적으로 반복친에 교배(역교배)된다. 생성되는 모체는 반복친 (예컨대 재배종)의 속성 및 공여 모체로부터 이전된 원하는 특질을 가질 것으로 기대된다.

본 발명의 DNA 분자는 마커 이용 번식(marker assisted breeding) (MAB) 방법에서 분자 마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 분자는 업계에 알려져 있는 바와 같은 유전적으로 연관되어 있으며 농학적으로 유용한 특질을 식별하는 방법 (예컨대 AFLP 마커, RFLP 마커, RAPD 마커, SNP, 및 SSR)에 사용될 수 있다. MAB법을 사용하면, 본 발명의 옥수수 식물 (또는 그의 자손, 및 임의의 다른 옥수수 재배종 또는 변종)과의 교배 자손에서, 곤충-내성 특질이 추적될 수 있다. DNA 분자는 이와 같은 특질에 대한 마커로써, 본 발명의 1종 이상 옥수수 주 또는 그의 자손이 모체 또는 선조인 옥수수 식물에서는, 업계에 잘 알려져 있는 MAB법이 곤충-내성 특질(들)을 추적하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 옥수수 주 TC1507 유래의 곤충-내성 이벤트를 가지는 모든 옥수수 변종을 식별하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에는 본 발명의 식물을 사용하여 번식시키는 것을 포함하는 곤충-내성 옥수수 식물의 제조 방법이 포함된다. 더 구체적으로, 상기 방법은 2종의 본 발명 식물, 또는 1종의 본 발명 식물과 임의의 다른 식물을 교배시키는 것, 및 본 발명에 따라 해당 이벤트를 추적하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방법은 또한 본 발명에 따라 검출가능한 이벤트에 대하여 해당 자손을 분석하는 것에 의해 상기 교배의 자손을 선택하는 것을 포함한다.

표 1에 확인되어 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 번식 및 발육된 바람직한 식물 또는 종자는 삽입물 양 측의 적어도 20-500개 이상의 연속되는 플랭킹 뉴클레오티드와 함께, 표 1에 확인되어 있는 바와 같은 1종 이상의 삽입 서열을 그의 게놈에 포함한다. 다르게 표시되지 않는 한, "이벤트 TC1507" 또는 유사 언급은 이벤트를 포함하는 모체 주의 유성 교배의 결과로서 삽입 DNA를 수용하는 자손에 이전될 것으로 기대될 수 있으며, 삽입 DNA에 바로 인접하는 SEQ ID NO:1 및/또는 SEQ ID NO:2 플랭킹 게놈 서열 양자의 전부 또는 일부에 의해 식별되는 게놈상 위치에 삽입된 이종유래 DNA를 포함하는, SEQ ID NO:3의 DNA를 지칭한다.

본원에서는, 본 발명의 기술을 돕고, 업계 일반 숙련자에 의한 본 발명의 실행을 안내하기 위하여, 정의 및 실시예가 제공된다. 다르게 주지되지 않는 한, 용어들은 관련 업계의 일반 숙련자에 의한 통상적인 어법에 따라 이해되어야 한다. 37 CFR §1.822에 제시되어 있는 바와 같은 DNA 염기의 명명법이 사용된다.

유전자이전 "이벤트"는 이종유래 DNA, 즉 관심 이전유전자를 포함하는 핵산 구성체를 사용한 식물 세포의 형질전환, 식물 게놈에의 이전유전자의 삽입으로부터 야기되는 식물 군집의 재생, 및 특정 게놈상 위치에의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물의 선택에 의해 생성된다. "이벤트"라는 용어는 이종유래 DNA를 포함하는 원래의 형질전환체, 및 상기 형질전환체의 자손을 지칭한다. "이벤트"라는 용어는 또한 형질전환체와 게놈/이전유전자 DNA를 포함하는 또 다른 변종 사이의 유성 이종교배에 의해 생성되는 자손을 지칭한다. 반복친에 대한 반복적인 역교배 후에도, 형질전환된 모체로부터의 삽입된 이전유전자 DNA 및 플랭킹 게놈 DNA (게놈/이전유전자 DNA)는 교배 자손의 동일한 염색체상 위치에 존재한다. "이벤트"라는 용어는 또한 삽입 DNA를 포함하는 일측 모체 주 (예컨대 원래의 형질전환체 및 자가생식으로부터 야기되는 자손)와 삽입 DNA를 포함하지 않는 모체 주의 유성 교배의 결과로서 관심 이전유전자를 포함하는 삽입 DNA를 수용하는 자손에 이전될 것으로 기대될 수 있는, 삽입 DNA 및 삽입 DNA에 바로 인접하는 플랭킹 게놈 서열을 포함하는 원래의 형질전환체 및 그의 자손으로부터의 DNA를 지칭한다.

"연결부 서열"은 게놈에 삽입된 DNA가 삽입점에 플랭킹되는 원래의 옥수수 게놈으로부터의 DNA에 연결되는 지점을 포괄하므로, 식물 유전 물질의 일측 또는 타측 연결부 서열의 식별 또는 검출은 이벤트에 대한 진단이 되기에 충분하다. 본원-기술 옥수수 이벤트의 삽입물 및 유사한 길이의 플랭킹 DNA를 포괄하는 DNA 서열이 포함된다. 그와 같은 진단용 서열의 구체적인 예가 본원에서 제공되는 것이지만; 삽입물의 연결부, 또는 삽입물과 게놈 서열의 연결부에 중복되는 다른 서열 역시 진단용으로써, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위하여, 부분적으로 플랭킹, 연결부, 및/또는 삽입 서열을 기준으로 프라이머, 앰플리콘, 및 프로브들이 설계될 수 있다. 관련 프라이머 및 앰플리콘들은 본 발명의 구성요소로서 포함될 수 있다. 삽입 DNA 및 그의 경계를 지나 연장되는 앰플리콘을 사용하는 PCR 분석법은 본 사유 유전자이전 옥수수 주로부터 유래되는 상업용 유전자이전 옥수수 변종 또는 주를 검출 또는 식별하는 데에 사용될 수 있다.

헤르큘렉스 I (TC1507 이벤트)에서의 5' 플랭킹 서열의 서열은 SEQ ID NO:1로 제공되어 있다. 3' 플랭킹 서열의 서열은 SEQ ID NO:2로 제공되어 있다. 플랭킹 서열 (SEQ ID NO:1 및 2의 것)에 의해 플랭킹되는 cry1F 삽입물의 서열 (조절 서열 포함)은 SEQ ID NO:3으로 제공되어 있다. 표 1은 SEQ ID NO:3을 기준으로 한 삽입물 및 플랭킹 서열의 좌표를 제공한다.

<표 1>

이러한 삽입 이벤트, 및 그의 다른 구성요소에 대해서는 예를 들면 U.S. 특허 제7,605,310호 및 7,449,564호에 추가적으로 예시되어 있다 (예컨대 '564호 특허의 도 1 참조). 이러한 삽입물 및 경계 서열을 바탕으로, 이벤트-특이적 프라이머들이 생성되었으며, 그렇게 될 수 있다. PCR 분석은 해당 옥수수 주들이 상이한 옥수수 유전형에서 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트들을 사용하여 생성되는 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 식별될 수 있다는 것을 입증하였다. 따라서, 이러한 관련 절차 및 기타 관련 절차들은 해당 옥수수 주들을 특이적으로 식별하는 데에 사용될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "주(line)"는 1종 이상 특질에 있어서 개체들 사이에 유전적 변이를 적게 나타내거나 나타내지 않는 식물 군이다. 그와 같은 주는 수세대의 자가-수분 및 선택에 의해, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 사용한 단일 모체로부터의 무성 번식에 의해 생성될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "재배종" 및 "변종"이라는 용어는 동의어로써, 상업적인 생산에 사용되는 주를 지칭한다. "안정성" 또는 "안정한"은 주어진 구성요소와 관련하여, 구성요소가 세대에 걸쳐, 바람직하게는 3세대 이상 실질적으로 동일한 수준, 예컨대 바람직하게는 ±15 %, 더욱 바람직하게는 ±10 %, 가장 바람직하게는 ±5 %에서 유지된다는 것을 의미한다. 안정성은 온도, 위치, 스트레스 및 생육 시간에 의해 영향을 받을 수 있다. 포장 조건하에서의 이후 세대의 비교시 유사한 방식으로 구성요소를 생성시켜야 한다.

"상업상 이용가능성"은 우수한 식물 생장력 및 고도의 번식력을 가짐으로써, 농부에 의해 통상적인 경작 장비를 사용하여 작물이 생산될 수 있으며, 통상적인 분쇄 및 추출 장비를 사용하여 기술되는 구성요소를 포함하는 오일이 종자로부터 추출될 수 있는 것으로 정의된다. 상업적으로 유용할 수 있는 수율은 에이커 당 생산되는 종자 중량, 오일 함량 및 총 오일 기준으로 측정하였을 때, 고급 가치의 특질 없이 동일 지역에서 생육되는 다른 것은 유사한 시중 카놀라 변종 평균 수율의 15 % 이내이다.

"농학적으로 선발된(Agronomically elite)"은 주가 본 발명 이벤트(들)로 인한 곤충 내성 이외에도, 수율, 성숙도, 내병성 등과 같은 바람직한 농학적 특징들을 가진다는 것을 의미한다.

업계 숙련자라면 본 개시내용에 비추어 알 수 있는 바와 같이, 검출 키트의 바람직한 실시양태는 예를 들면 "연결부 서열" 또는 "전이 서열(transition sequence)" (옥수수 게놈 플랭킹 서열이 삽입 서열과 만나는 곳)과 관련되거나 및/또는 그것을 포함하는 프로브 및/또는 프라이머들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 여기에는 표 1에 나타낸 바와 같은 잔기들을 포함하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브, 프라이머, 또는 앰플리콘이 포함된다. 일부 바람직한 프라이머는 인접하는 플랭킹 서열의 ~15개 이상 잔기 및 인접하는 삽입 서열의 ~15개 이상 잔기를 포함할 수 있다. 연결부 서열의 200 염기 정도 이내의 잔기가 표적화될 수 있다. 이와 같은 배열을 사용하여, 플랭킹 또는 삽입 영역 중 어느 것의 또 다른 프라이머가 본 발명 이벤트의 존재를 표시해주는 검출가능한 앰플리콘을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 1종의 프라이머는 플랭킹 영역에 결합되며, 1종은 삽입물에 결합되는데, 이들 프라이머는 상기 표시된 바와 같은 연결부 서열(잔기 2829-2030 및/또는 9015-9016)을 포괄하는 (그리고 포함하는) 앰플리콘을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. SEQ ID NO:1 및/또는 2가 SEQ ID NO:3와 함께 정렬되는 것으로 그와 같은 연결부가 예시될 수 있다.

업계 숙련자라면, 일련의 표준 혼성화 및/또는 PCR 조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, 및 이들의 상보체의 단편에 혼성화되도록 프라이머 및 프로브가 설계될 수 있으며, 여기서, 상기 프라이머 또는 프로브가 예시된 서열에 대하여 완전히 상보적인 것은 아니라는 것도 알고 있을 것이다. 즉, 어느 정도의 불일치는 허용될 수 있다. 대략 20개 뉴클레오티드의 프라이머에 있어서, 불일치 염기가 앰플리콘과 대향하는 프라이머의 내부 또는 말단에 있는 경우, 예를 들면 통상적으로 1개 또는 2개 정도의 뉴클레오티드는 대향 가닥과 결합할 필요가 없다. 다양하고 적절한 혼성화 조건들이 하기에 제공된다. 이노신과 같은 합성 뉴클레오티드 유사체가 프로브에 사용될 수도 있다. 펩티드 핵산 (PNA) 프로브는 물론, DNA 및 RNA 프로브가 사용될 수도 있다. 중요한 것은 그와 같은 프로브 및 프라이머가 본 발명 이벤트의 존재에 대하여 진단성인지 (특이적으로 식별 및 구별할 수 있는지)이다.

이전유전자 "삽입물" 또는 구성체의 구성요소에 대해서는 예를 들면 U.S. 특허 제7,605,310호 및 7,449,564호에 개시되어 있다 (예컨대 '564호 특허의 도 1 참조). 이러한 구성요소의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 단편은 본 발명의 방법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서는, Cry1F 이벤트 TC1507을 포함하는 헤르큘렉스로 지칭되는 옥수수 식물 유래의 식물 및 종자 등에서 이전유전자/게놈 삽입 영역의 사본 수를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본원의 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, 이들의 단편, 그리고 예시된 서열의 상보체 및 그의 임의 단편에서 제공되는 1종 이상의 이전유전자/게놈 삽입 영역 연결부 서열을 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 상기 삽입 영역 연결부 서열은 게놈에 삽입된 이종유래 DNA와 삽입 부위에 플랭킹되는 옥수수 세포 유래 DNA 사이의 연결부를 포괄한다. 그와 같은 서열은 본 발명 이벤트에 대하여 진단성이다.

이러한 삽입 및 경계 서열을 바탕으로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성되었다. 본 발명의 태크맨 PCR 분석은 옥수수 이벤트 TC1507이 상이한 옥수수 주 및 유전형에서 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트들을 사용하여 생성되는 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 식별될 수 있다는 것을 입증하였다. 이들 및 기타 관련 절차는 이러한 옥수수 주를 특이적으로 식별하는 데에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서는, 이전유전자/게놈 삽입 영역의 인접 부분/단편을 포함하는 (또는 적어도 부분적으로 거기에 상보적인) DNA서열이 본 발명의 양태이다. 충분한 길이의 이전유전자 삽입 서열 뉴클레오티드 및 충분한 길이의 1종 이상 본 발명 옥수수 식물 유래 옥수수 게놈 서열 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열이 포함된다.

SEQ ID NO:3 DNA 서열 이전유전자 부분 또는 그의 상보체의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 및 SEQ IN NO:1 및 SEQ ID NO:2, 또는 그의 상보체로 구성되는 군에서 선택되는 유사 길이의 플랭킹 옥수수 DNA 서열이 관련 실시양태에 속한다. 그와 같은 서열들은 예를 들면 DNA 증폭법에서의 DNA 프라이머로서 유용하다. 본 발명의 구성요소에는 또한 그와 같은 DNA 프라이머 및 동종 프라이머에 의해 생성되는 앰플리콘이 포함된다.

본 발명에는 또한 본원에서 언급되는 1종 이상 옥수수 식물 유래 샘플에서의 DNA 존재의 검출 방법이 포함된다. 그와 같은 방법은 하기를 포함할 수 있다: (a) DNA를 포함하는 샘플을, 본 발명의 핵산 증폭 반응에 사용될 때 1종 이상 해당 옥수수 이벤트 유래의 DNA와 결합하는 프라이머 세트와 접촉시키는 것; (b) 본원에서 식별된 참조 유전자를 사용하여 태크맨 PCR 증폭 반응을 수행하는 것; 및 (c) 결과를 분석하는 것.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에는 하기의 단계를 포함하는, 본 발명의 cry1F 이벤트를 포함하는 옥수수 식물의 제조 방법이 포함된다: (a) 제1 모체 옥수수 주 (상기 주의 식물에 상기 곤충 내성 특질을 부여하는 본 발명의 발현 카세트를 포함함)와 제2 모체 옥수수 주 (상기 곤충 내성 특질이 결핍된 것)를 유성 교배시킴으로써, 다수의 자손 식물을 생성시키는 단계; 및 (b) 1종 이상 본 발명 분석 기술의 결과를 바탕으로 자손 식물을 선택하는 단계. 그와 같은 방법은 임의로 자손 식물을 제2 모체 옥수수 주에 역-교배시킴으로써, 상기 곤충 내성 특질을 포함하는 순계-교배(true-breeding) 옥수수 식물을 생성시키는 추가 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 교배 자손의 접합성을 측정하는 관련 방법이 제공된다.

본원에서 개시되는 조성물 및 DNA 검출 업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 DNA 검출 키트가 개발될 수 있다. 상기 키트는 샘플에서의 본 발명 옥수수 이벤트 DNA의 식별에 유용하며, 이와 같은 DNA를 포함하는 옥수수 식물의 번식 방법에 적용될 수 있다. 상기 키트는 예컨대 본원에서 개시되는 앰플리콘, 또는 본 발명 이벤트의 이전유전자 유전 요소에 포함되어 있는 DNA와 동종이거나 그에 상보적인 DNA 서열과 동종이거나 그에 상보적인 DNA 서열을 포함한다. 이러한 DNA 서열들은 DNA 증폭 반응에 사용될 수 있거나, 또는 DNA 혼성화법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 키트는 검출법의 수행에 필요한 시약 및 재료들을 포함할 수도 있다.

"프로브"는 통상적인 검출가능 표지 또는 리포터 분자 (예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제, 또는 효소)가 부착되는 단리된 핵산 분자이다. 그와 같은 브로브는 표적 핵산의 가닥에, 본 발명의 경우에는 옥수수 식물 유래인지 또는 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플 유래인지에 관계없이 상기 옥수수 이벤트 중 1종 유래의 게놈 DNA 가닥에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브에는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합되며 그 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는 데에 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질도 포함된다.

"프라이머"는 핵산 혼성화에 의해 상보적 표적 DNA 가닥에 어닐링되어 프라이머와 표적 DNA 가닥 사이의 혼성체를 형성하며, 폴리머라제, 예컨대 DNA 폴리머라제와 함께 사용될 수 있는 단리된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 통상적인 핵산 증폭법에 의한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 그의 사용에 관한 말이다.

프로브 및 프라이머 (및 앰플리콘)은 일반적으로 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500개 폴리뉴클레오티드 또는 그 이상이다. 그와 같은 프로브 및 프라이머는 고엄밀도(high stringency) 혼성화 조건하에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 완전한 서열 유사성을 가지지만, 통상적인 방법에 의해 표적 서열과 다르면서 표적 서열에 혼성화되는 능력은 유지하는 프로브가 설계될 수도 있다.

프로브 및 프라이머의 제조 및 사용 방법에 대해서는 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술되어 있다. PCR-프라이머 쌍은 예를 들면 해당 목적용으로 의도된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 알려져 있는 서열로부터 유도될 수 있다.

본원에서 개시되는 플랭킹 DNA 및 삽입 서열을 바탕으로 하는 프라이머 및 프로브는 통상적인 방법, 예컨대 해당 서열을 재-클로닝 및 서열분석하는 것에 의해 개시된 서열을 확인 (및 필요에 따라서는 보정)하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄밀 조건하에서 표적 DNA 서열에 혼성화된다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플에서의 유전자이전 이벤트 유래 DNA의 존재를 식별하는 데에 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 소정의 상황하에서 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 2종의 분자가 역평행한 이중-가닥 핵산 구조를 형성할 수 있는 경우, 2종의 핵산 분자는 서로 특이적으로 혼성화될 수 있는 것으로 언급된다. 그들이 완전한 상보성을 나타내는 경우, 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자의 "상보체"인 것으로 언급된다. 본원에서 사용될 때, 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 것의 뉴클레오티드에 상보적인 경우, 분자는 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 적어도 통상적인 "저-엄밀도" 조건하에서 그들이 서로 어닐링되어 유지되도록 하기에 충분한 안정성으로 그들이 서로 혼성화될 수 있는 경우, 2종의 분자는 "최소한으로 상보적인" 것으로 언급된다. 마찬가지로, 통상적인 "고-엄밀도" 조건하에서 그들이 서로 어닐링되어 유지되도록 하기에 충분한 안정성으로 그들이 서로 혼성화될 수 있는 경우, 분자는 "상보적인" 것으로 언급된다. 통상적인 엄밀도 조건에 대해서는 문헌 [Sambrook et al ., 1989]에 기술되어 있다. 따라서, 해당 변경이 이중 가닥 구조를 형성하는 분자의 능력을 완전히 배제하지 않는 한, 완전한 상보성으로부터의 변경이 허용가능하다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로 기능하기 위해서는, 사용되는 특정 용매 및 염 농도하에서 안정한 이중-가닥 구조를 형성할 수 있도록, 오로지 서열이 충분히 상보성이어야 한다.

본원에서 사용될 때, 실질적으로 동종인 서열은 그것이 고엄밀도 조건하에서 비교되고 있는 핵산 서열의 상보체에 특이적으로 혼성화하게 되는 핵산 서열이다. "엄밀한 조건"이라는 용어는 문헌 [Sambrook et al ., 1989, at 9.52-9.55]에 논의되어 있는 구체적인 혼성화 절차에, 표적 핵산(즉, 특정 관심 핵산 서열)에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의되어 있다. 문헌 [Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52 and 9.56-9.58]도 참조하라. 따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 DNA 단편의 상보적 연장체(stretch)와 선택적으로 중복체(duplex) 분자를 형성하는 그의 능력으로 인하여 사용될 수 있다.

계획된 적용분야에 따라, 다양한 혼성화 조건을 사용함으로써, 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 선택성 정도를 달성할 수 있다. 고도의 선택성을 필요로 하는 적용분야를 위해서는, 혼성체를 형성하는 데에 통상적으로 비교적 엄밀한 조건을 사용하게 되는데, 예를 들면, 약 50 ℃ 내지 약 70 ℃ 온도에서의 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl에 의해 제공되는 것과 같이, 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건을 선택하게 된다. 엄밀한 조건은 예를 들면 혼성화 필터를 고-엄밀도 세척 버퍼 (0.2X SSC, 0.1 % SDS, 65 ℃)를 사용하여 2회 이상 세척하는 것을 포함할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄밀도 조건, 예를 들면 약 45 ℃에서의 6.0X 염화 나트륨/나트륨 시트레이트 (SSC)에 이어지는 50 ℃에서의 2.0X SSC 세척에 대해서는 업계 숙련자에게 알려져 있다 (6.3.1-6.3.6). 예를 들면, 세척 단계에서의 염 농도는 50 ℃에서 약 2.0X SSC인 저엄밀도 내지 50 ℃에서의 약 0.2X SSC인 고엄밀도에서 선택될 수 있다. 또한 세척 단계에서의 온도는 약 22 ℃인 실온에서의 저엄밀도 조건으로부터 약 65 ℃의 고엄밀도 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염 모두가 달라질 수 있거나, 또는 온도 또는 염 농도 중 어느 하나가 일정하게 유지되면서, 다른 변수가 변화될 수 있다. 그와 같은 선택성 조건들은 프로브와 주형(template) 또는 표적 가닥 사이의 불일치를, 허용한다 하더라도, 적게 허용한다. 혼성화를 통한 DNA 서열의 검출에 대해서는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는데, U.S. 특허 제4,965,188호 및 5,176,995호의 교시가 대표적인 혼성화 분석 방법이다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 고엄밀도 조건하에서 상보체 및 그의 단편을 포함하여 본원에서 예시 또는 제시되는 1종 이상의 프라이머 (또는 앰플리콘 또는 기타 서열)에 특이적으로 혼성화하게 된다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NO:4-21에 제시되어 있는 핵산 서열, 또는 그의 상보체 및/또는 단편을 가진다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 상기 핵산 서열과 80 % 내지 100 % 또는 90 % 내지 100 % 사이의 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 그와 같은 서열과 95 % 내지 100 % 사이의 서열 동일성을 공유한다. 그와 같은 서열은 식물 번식 방법, 예를 들면 유전적 잡종의 자손을 식별하는 데에 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화는 업계 숙련자에게 알려져 있는 모든 수의 방법에 의해 검출될 수 있는데, 여기에는 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기재 태그, 및 화학발광 태그가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 증폭 프라이머 쌍을 사용한 표적 핵산 서열의 증폭 (예컨대 PCR에 의한 것)과 관련하여, "엄밀 조건"은 상응하는 야생형 서열 (또는 그의 상보체)을 가지는 프라이머가 결합하여, 바람직하게는 특이적 증폭 생성물인 앰플리콘을 생성시키게 되는 표적 핵산 서열에만 프라이머 쌍이 혼성화되는 것을 허용하는 조건이다.

"(표적 서열)에 특이적인"이라는 용어는 프로브 또는 프라이머가 엄밀 혼성화 조건하에서 표적 서열을 포함하는 샘플 중 표적 서열에만 혼성화된다는 것을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 지칭한다. 예를 들면, 유성 교배로 생성된 옥수수 식물이 본 발명 옥수수 식물 유래의 유전자이전 이벤트 게놈 DNA를 포함하는지 여부를 측정하기 위하여, 옥수수 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA는 삽입된 이종유래 DNA의 삽입 부위에 인접하는 식물 게놈의 플랭킹 서열로부터 유도된 프라이머, 및 삽입된 이종유래 DNA로부터 유도된 제2의 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용한 핵산 증폭법에 적용됨으로써, 이벤트 DNA의 존재에 대하여 진단성인 앰플리콘을 생성시킬 수 있다. 상기 앰플리콘은 역시 이벤트에 대하여 진단성인 길이 및 서열을 가진다. 상기 앰플리콘은 길이가 프라이머 쌍의 합쳐진 길이 더하기 1개 뉴클레오티드 염기 쌍, 및/또는 프라이머 쌍의 합쳐진 길이 더하기 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000개 또는 그 이상 뉴클레오티드 염기 쌍 (더하기 또는 빼기 상기에 열거된 증분들 중 어느 것)의 범위일 수 있다. 다르게는, 프라이머 쌍은 전체 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앰플리콘을 생성시키도록, 삽입된 DNA 양측의 플랭킹 서열로부터 유도될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유도되는 프라이머 쌍의 구성원은 삽입 DNA 서열로부터 원거리에 위치될 수 있다. 이와 같은 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍으로부터 약 2만개 뉴클레오티드 염기 쌍까지의 범위일 수 있다. "앰플리콘"이라는 용어의 사용은 특히 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수도 있는 프라이머 이량체는 배제한다.

핵산 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함하여, 업계에 알려져 있는 다양한 핵산 증폭법들 중 어느 것에 의해 수행될 수 있다. 다양한 증폭법들이 업계에 알려져 있는데, 특히 U.S. 특허 제4,683,195호 및 U.S. 특허 제4,683,202호에 기술되어 있다. PCR 증폭법은 22 kb 이하의 게놈 DNA를 증폭하도록 개발되어 있다. 이러한 방법들은 물론, DNA 증폭 업계에 알려져 있는 기타 방법들이 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 이종유래 이전유전자 DNA 삽입물의 서열 또는 본 발명 옥수수 이벤트 유래의 플랭킹 게놈 서열은 본원에서 제공되는 서열로부터 유도되는 프라이머를 사용하여 이벤트 유래의 해당 서열을 증폭하는 것에 이어지는 PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 서열분석에 의해 확인 (및 필요에 따라서는 보정)될 수 있다.

이러한 방법들에 의해 생성되는 앰플리콘은 다수의 기술에 의해 검출될 수 있다. 아가로스 겔 전기영동 및 브롬화 에티듐을 사용한 염색이 보편적으로 잘 알려져 있는 DNA 앰플리콘 검출 방법이다. 또 다른 해당 방법은 인접하는 플랭킹 게놈 DNA 서열과 삽입 DNA 서열 양자에 중복되는 DNA 올리고뉴클레오티드가 설계되는 유전자 파편 분석(Genetic Bit Analysis)이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트(microwell plate)의 웰에 고정된다. 관심 영역의 PCR (삽입 서열의 하나의 프라이머, 및 인접 플랭킹 게놈 서열의 하나를 사용)에 이어, 단일-가닥의 PCR 생성물은 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 후, DNA 폴리머라제 및 예상되는 다음 염기에 특이적인 표지 ddNTP를 사용한 단일 염기 연장 반응에 주형으로서 사용될 수 있다. 반응은 형광 또는 ELISA-기반의 것일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인한 삽입/플랭킹 서열의 존재를 표시해준다.

본원에서 언급 또는 인용되는 모든 특허, 특허 출원, 가출원, 및 공개들은, 그것이 본 명세서의 명백한 교시와 모순되지 않는 한, 그 전체가 참조로써 개재된다.

[ 실시예 ]

실시예 1 - 전체 게놈 DNA 의 단리 및 정량 및 PCR 프라이머 증폭

샘플 당 8개의 잎 디스크를 펀칭(punching)하고, 제노그라인더(Genogrinder) 2000을 사용하여 상기 디스크를 미세 분말로 마쇄함으로써, 개별 샘플로부터 Cry1F 동종접합체, 반접합체 및 야생형 샘플 유래의 게놈 DNA를 단리하였다. 주문제작된 차지스위치(ChargeSwitch)® gDNA 식물 키트 (인비트로겐(Invitrogen) 사, 캘리포니아 칼스배드 소재) 또는 키아겐 디엔이지(Qiagen DNeasy) 96-웰 키트 (발렌시아(Valencia) 사, 캘리포니아 소재)를 사용하여 DNA를 추출하였다. PCR에 앞서, 제작자의 지침에 따라 퀀트(Quant)-iT™ 피코그린(PicoGreen)® 정량 키트 (인비트로겐 사, 캘리포니아 칼스배드 소재)를 사용하여 DNA 샘플을 정량하였다.

MWG 바이오테크(Biotech) (하이 포인트(High Point) 사, 노스캐롤라이나 소재)에 의해, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 FAM 및 블랙 홀 켄처 1 (BHQ1)을 사용한 이중 표지 태크맨 프로브를 합성하였다 (표 1b).

<표 1b>

IDT (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies) 사, 아이오와 코랄빌 소재)에 의해 Cy5 및 BHQ2가 구비된 이중 표지 태크맨 프로브를 합성하였다. 모든 프라이머를 200 μM로, 그리고 프로브를 100 μM로, 1x 트리스(Tris)-EDTA에 용해시켰다. 프라이머와 이중 표지 태크맨 프로브의 작업용 모액을 분자 등급의 물로 10-배 희석하였다.

2.5 mM 내지 5.5 mM의 MgCl₂ 농도를 사용하여, 모노-플렉스(mono-plex) 반응의 경우인 표 2a, 2b 및 2c에 따라 PCR 반응을 설정하였다.

<표 2a>

<표 2b>

<표 2c>

표 3에 따라 다중 반응용 PCR 반응을 설정하였다. 키아겐 사 (캘리포니아 발렌시아 소재, 카탈로그 # 203203 또는 203205)의 핫스타 태크(HotStar Taq) DNA 폴리머라제 (핫스타 태크, lOx PCR 버퍼, 및 25 mM MgCl₂) 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사 (캘리포니아 포스터 시티 소재, 카탈로그 # N8080260)의 10 mM dNTP 뉴클레오티드 혼합물을 사용하였다. 아이싸이클러(iCycler) 광학 시스템 (바이오래드(BioRad) 사, 캘리포니아 허큘리스 소재)에서 권장되어 있는 대로 95 ℃에서 15분 변성으로 시작하여, 이후 95 ℃ 15초, 60 ℃ 1분의 50 순환으로써, 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 각 순환 종료시에 형광 신호를 기록하였다.

표 3에 따라 종료점 태크맨 PCR 분석을 설정하였다. ABI 진앰프(GeneAmp)® PCR 시스템 9700 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재)을 증폭에 사용하였다. 28 순환인 것으로 결정된 적정한 수의 순환 후, 4% E-겔(Gel) (인비트로겐 사, 캘리포니아 칼스배드 소재) 또는 분광형광측정기 (테칸 제니오스(Tecan GENios) 사, 스위스 만네도르프 소재) 중 어느 것에 의해, PCR 생성물을 측정하였다 (표 4).

<표 3>

<표 4>

아이싸이클러 소프트웨어 (버젼 3.0a)에 의해 자동으로, 바탕값을 약간 상회하는 형광 값을 가지는 실시간 PCR 역치(threshold)가 계산되었다. 순환 역치 (Ct값)는 확정된 역치를 상회하는 형광을 발생시키는 데에 요구되는 순환 수로 결정하였다. PCR 효율은 투입 게놈 DNA 및 Ct값을 기준으로 평가하였다.

FAM 대 Cy5의 바탕에 대비한 신호의 비를 계산하였다. 상기 비의 절대값을 엑셀에서 각 군집에 대하여 플로팅하였다. 유전형 선언(genotype call)은 대조 (동종접합체, 반접합체 및 야생형)은 물론 분리 군집(segregating population)의 집단 분포(cluster distribution)를 기준으로 하였다.

실시예 2 - 옥수수 내생 유전자에 대한 PCR 효율 시험

종료점 태크맨 접합성 분석 개발의 일 양태는 참조 유전자로서의 가장 적합한 내생 유전자의 선택이었다. 종-특이적이며 게놈에서 적은 사본 수를 가지는 인버타제를 적합한 참조 유전자로서 선택하였다. 처음에는, 가능성이 있는 수천 종 중 4종의 옥수수 내생 유전자 알콜 데히드로제나제 1 (adh1), 고-이동성 군 단백질 (hmga), 인버타제 (ivr), 및 제인 (zein)을 이벤트 TC1507에서의 가능한 옥수수 Cry1F용 참조 유전자로서 조사하였다.

적합한 참조 유전자의 선택 과정은, 모든 프라이머에 대한 PCR 효율을 평가하기 위하여, 먼저 30 ng의 추출된 Cry1F 동종접합체, 반접합체 및 야생형 옥수수 게놈 DNA 대조 (본 실시예에서 기술되는 단리 절차에 따라 추출됨)를 풀화하는 것(pooling)을 포함하였다. 표 2c에 따라, TC1507 및 5종의 처음에 선택된 참조 유전자들 (ivr , ivr104 , adh , hmg , zein)에 대한 PCR을 설정하였다. 다음에, 32 순환 후의 PCR 생성물을 4 % E-겔에서 가시화하였다. 모든 프라이머들이 예상 크기의 단편들을 증폭하였으며, 4종의 참조 유전자들은 유사한 강도를 가지는 밴드를 나타내었다. 참조 유전자 선택사항 adh에 있어서의 분석은 다른 최초 선택 참조 유전자 분석에 비해 생성물을 덜 생성시켰다. TC1507 이벤트 특이적 올리고는 동종접합체 및 반접합체 대조에서만 앰플리콘을 생성시켰으며, 동종접합체 샘플이 더 밝은 밴드를 나타내었다.

종료점 태크맨 분석을 위하여, 이전유전자 및 참조 유전자 반응액 양자를 단일 반응으로 증폭시켰다 (다중화). 양 유전자에 대하여 최적 PCR 효율을 달성하기 위한 시도로써, 실시간 PCR을 사용하여, 동종접합체 샘플로부터의 게놈 DNA 30 ng에 대한 가변 농도의 MgCl₂로 모든 프라이머들을 3반복 시험하였다 (표 2a, 2b 및 2c 참조).

표 5는 상이한 MgCl₂ 농도에서의 Cry1F 동종접합체 게놈 DNA 30 ng을 사용한 ivr, adh , ivr104 , hmg , zein 및 TC1507에 대한 실시간 PCR의 Ct값을 제공한다.

<표 5>

처음에 선택된 참조 유전자 zein 및 TC1507에 있어서의 순환 역치 (Ct)의 평균 값들은 고농도의 MgCl₂ (4 mM 및 5.5 mM)에서는 유사하였던 (약 21) 반면, 처음에 선택된 참조 유전자 ivr 및 hmg에 있어서의 평균 값은 더 높은 Ct값 (~23 내지 ~25)을 가졌다. 처음에 선택된 참조 유전자 adh는 26을 초과하는 Ct값을 가졌으므로, 선택사항에서 제거되었다. MgCl₂ 농도 5.5 mM이 모든 시험된 유전자의 증폭 반응에 대하여 가장 낮은 Ct값을 가졌으며, 그에 따라 이후의 실험에 사용되었다.

처음에 선택된 참조 유전자 ivr, ivr104, hmg 및 zein에 대한 프라이머들은 표 3에 따라 실시간 PCR을 사용하고, 풀화된 동종접합체로부터의 DNA의 1;2 연속 희석을 사용하여, TC1507과 다중화되었다 (3반복으로 수행).

PCR의 효율을 비교하는 데에는 역시 Ct값이 사용되었다. 도 2는 조사된 상이한 참조 유전자들과의 TC1507의 복식 조합을 나타낸다. TC1507의 Ct값은 각 희석 사이에 대략 1 순환의 차이를 나타내었다. TC1507에 있어서의 PCR 효율은 100 %이었다. 대부분의 희석물에서, 참조 유전자는 물론 TC1507 반응을 수행하였다.

실시예 3 - 접합성 유전형화(zygosity genotyping)를 위한 종료점 태크맨 분석의 시험

분리 TC1507을 가지는 Cry1F 단일 적층 군집 (Q:07K:PF04DS_ZYGO)을 사용하여 종료점 태크맨 PCR (표 3)을 사용한 TC1507과의 일 참조 유전자 (ivr, ivr104, hmg 또는 zein)의 다중화를 시험하였다. 종료점 태크맨 PCR에 앞서, DNA를 10 ng/㎕로 표준화하였다. 28 순환에서 태크맨 PCR 반응을 종료한 다음, 분광형광측정기를 사용하여 측정하였다. 바탕 1에 비교한 신호 (SOB1)로서의 바탕 (H₂O)에 비교한 FAM (TC1507)의 형광 신호, 및 바탕 2에 비교한 Cy5 (참조 유전자) (SOB2)를 계산하였다. SOB1/SOB2 비를 엑셀에서 스캐터 플롯(scatter plot)으로 플로팅하였다. 분리 군집에서는, 컷-오프점(cut-off point)이 시각적으로 측정되는 것을 가능케 하도록 3개의 데이터점 집단이 수득되어야 한다. 본원에서 개시되는 반응 조건하에서 TC1507과 다중화된 Ivr104 만이 명확한 유전형 선언을 할 수 있다는 것이 발견되었다. 처음에 선택되었던 다른 참조 유전자 반응액들 (ivr, hmg 및 zein)은 명확한 유전형 선언을 이끌어내는 동종접합체와 반접합체 사이의 충분한 분리를 창출하는 데에 실패하였다.

실시예 4 - 상이한 군집을 사용한 프로토콜의 사용

인베이더 및 PCR-기반 접합성 분석 (5)은 식물의 유전적 바탕(genetic background)에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 알려져 있다. 상이한 유전적 바탕 유래의 3종의 군집을 사용하여, 식물의 유전적 바탕에 의한 효과에 대하여 헤르큘렉스 I 이벤트 TC1507에 있어서의 종료점 태크맨 접합성 분석을 시험하였다. 각 바탕은 184개의 샘플 (2개 96-웰 플레이트의 DNA)로 구성되었다. 3종의 군집은 하기였다: Cry34/35_PoCry1F 및 PoCry1F_NK603 이중 적층체 및 PoCry1F 단일 적층체. 도 4a 및 도 4b에 도시되어 있는 바와 같이, Cry34/35_PoCry1F 및 PoCry1F 양자는 동종접합체가 상부, 반접합체가 중간 및 야생형 (WT)이 저부인 통상적인 3개 집단을 생성시켰다. 반면, PoCry1F_NK603 (도 4c)은 2개의 집단 (동종접합체 및 반접합체) 만을 가졌는데, 예상대로 WT 식물이 제초제 분무에 생존하지 못하였기 때문이다. 결과를 인베이더 분석과 비교해보면, 2종의 분석간에 98.8 %의 점수가 동일하다. 점수가 불일치하는 7개의 식물 중, 인베이더 분석에서의 6개의 동종접합체가 종료점 태크맨을 사용하여 분석하였을 때 반접합체가 되었다. 1개의 반접합체는 동종접합체가 되었다.

강력한 접합성 분석은 관심 유전자의 2종의 대립유전자가 분리 군집에서 분명하게 구별될 필요가 있다. 본 연구에서 기술되는 바와 같이, 상이한 참조 유전자는 결과에 있어서의 상당한 차이에 기여할 수도 있다. 또한, 유전형 선언은 각 군집 데이터로부터의 집단을 기준으로 해야 한다.

옥수수 내생 유전자 인버타제가 옥수수에서의 TC1507 이벤트를 위한 적합한 참조 유전자라는 것이 확인되었다. 이와 같이 하여, 실시예 5에 따라, 강력한 유전형을 생성시킬 수 있는, TC1507 이벤트 특이적 접합성 분석을 위한 고처리량의 복식 종료점 태크맨 PCR이 개발되었다.

실시예 5 - 옥수수에서 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507 의 접합성을 측정하기 위한 고 처리량 복식 종료점 태크맨 PCR 에서의 인버타제의 사용

통상적으로, 알려져 있는 게놈 DNA 주형에서 이전유전자 및/또는 참조 서열 모두를 허용가능한 상대적 형광 단위 (RFU)로 증폭시키는 PCR 및 열 순환 조건을 설정한다. 내생 참조 유전자가 증폭되지 않는 경우, 또는 이전유전자 서열이 유전자이전 대조보다 0.5-1 단위 더 높은 형광 해독치로 증폭되지 않는 경우에는, 프라이머 농도 및/또는 기타 파라미터를 변화시키는 것에 의한 최적화가 수행될 수 있다.

주형 DNA: 샘플 당 8개의 잎 디스크를 샘플링하고, 제작자의 지침에 따라 (게놈 DNA 추출 키트 (디엔이지 96-웰 키트, 키아겐 사, 캘리포니아 발렌시아 소재, 카탈로그 # 69181) 또는 등가물) 주형 DNA를 제조하였다 (일부 추가 재료 및 그의 공급원에 대한 추가적인 기술은 실시예 1에서 찾아볼 수 있음). 일반적으로, 반응액 25 ㎕ 당 30 ng의 총 게놈 DNA가 최상의 결과를 산출하였다.

시험 및 대조 물질: 음성 대조 옥수수 DNA 샘플은 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507을 포함하지 않는 비-유전자이전 또는 유전자이전 옥수수 잎 DNA이었다.

헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507 옥수수 DNA 샘플은 반접합성 또는 동종접합성 중 어느 것인 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507을 포함하는 유전자이전 옥수수 잎 DNA 샘플이었다. 동일 비율의 음성 대조 DNA를 조합하는 것에 의해 동종접합성 헤르큘렉스 ^® I 옥수수 DNA가 가용하지 않은 경우에는, 반접합성 샘플이 제조될 수 있다.

양성 및 음성 대조를 표 6에 예시하였다.

<표 6>

DNA 추출, 정제, 및 정량을 위한 절차. 연속되는 순서로 하기의 단계들을 수행하였다. 샘플 당 8개 잎 디스크의 펀칭, 및 키아겐 수집 튜브로의 전달. 각 샘플링 후, 70 % 알콜을 사용한 펀칭장치의 세척에 이어지는 수중에서의 신속 세정, 및 이후의 닦아 건조하기. 제작자의 권장사항에 따른 DNA 추출 버퍼의 제조. 제작자의 권장사항에 따른 DNA의 단리. 퀀트-iT™ 피코그린® 정량 키트 및 분광광도측정기 또는 등가물을 사용한 DNA 농도의 측정.

PCR 조건. 연속되는 순서로 하기의 단계들을 수행하였다. DNA 주형을 제외한 모든 성분을 함유하는 모체 혼합물로서의 하기 반응 혼합물의 제조. 상기 혼합물 제조시에는, 그것이 실제 요구되는 것에 비해 10 % 더 많은 반응액용으로 충분할 것.

헤르큘렉스 ® I 이벤트 TC1507 및 내생 유전자 인버타제 올리고 뉴클레오티드를 함유하는 복식 반응액용 성분은 하기이었음 (모든 DNA 샘플의 농도는 표준화되었음):

하기와 같이 프라이머 및 프로브를 제조하여 이용하였다.

<표 7>

<표 8>

프라이머 모액을 분취하여, 20 μM의 최종 작업 농도까지 H₂O로 1:10 희석하였다.

<표 9>

프로브 모액을 분취하여, 10 μM의 최종 작업 농도까지 H₂O로 1:10 희석하였다. 프로브는 광 민감성이므로, 가능한 최대한 암중에 저장되어야 한다. 냉동 및 해동 순환의 수를 최소화하기 위해서는, 각 프로브의 다수의 분취량이 제조되어야 한다.

적절한 대조를 사용하여 PCR 분석을 설정하였다. 96-웰 플레이트가 사용되는 경우, 하기의 웰이 대조로 사용될 것이 권장된다: H11 - H12 = 음성 대조 (시약, DNA는 없음), A1 = 헤르큘렉스 ^® I TC1507 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 동종접합성 양성 대조; A2 = 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507을 포함하는 반접합성 양성 대조; A3 = 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507 없이 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 음성 대조, 및 A4 - H10 = 미지 샘플.

진앰프(GenAmp) PCR 시스템 9700에서 하기의 조건하에 DNA를 증폭하였다:

하기와 같이 샘플을 분석하였다. 기기 설정: PCR 결과 해독을 위한 권장 파장은 하기와 같다.

헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507 게놈 DNA를 포함하지 않는 샘플은 참조 유전자 PCR 생성물의 형광 해독치만을 야기하게 된다. 반접합성 또는 동종접합성 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507 게놈 DNA를 포함하는 샘플은 음성 바탕 대조의 것보다 0.5-1 단위 이상 더 높은 FAM 프로브에 대한 RFU 해독치를 야기하게 된다. 샘플이 이전유전자 또는 내생 유전자 대립유전자에 대한 PCR 생성물을 산출하지 않는 경우에는, DNA가 적정한 품질 또는 양의 것이 아닐 수 있다. 그와 같은 경우, 새로운 DNA 조제 또는 새로운 반응이 수행되어야 한다. 결과는 하기의 경우에 허용가능하다:

* 알려져 있는 반접합성 및 동종접합성 대조가 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507 및 참조 유전자 인버타제에 대하여 예상되었던 높은 형광 해독치를 나타냄. 2종 대조 사이의 SOB1/SOB2 비가 0.5-1.0 단위의 해독치로 분리되어야 함.

* 음성 대조가 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507 및 참조 유전자 모두에 대하여 매우 낮은 형광 해독치를 나타내야 함.

* 비-유전자이전 DNA 대조가 참조 유전자에 대해서만 형광 해독치를 나타내야 함.

태크맨 PCR 및 형광 해독의 완료에 이어, 표 및 분포 그래프를 작성하였다 (표 10, 도 1). 유사한 유전적 바탕을 가지는 '야생형' (Wt), '반접합성', 및 '동종접합성' 대조가 음성 및 양성 대조로서 사용될 수 있다. 분리 군집에서는, 컷-오프점이 시각적으로 측정되도록, 3개 집단의 데이터점이 수득되어야 한다. 이러한 컷-오프점은 임의의 것으로써, 집단 간 차이는 보통 약 0.5-1 단위이다. 그러나, 분석상의 가변성으로 인하여, 데이터점이 분산될 수 있다. 하기에 예시된 실시예에서는, 3개 데이터점 집단이 분명하게 눈에 보인다. 야생형의 데이터점은 0.5 미만이며, '반접합성' 샘플의 것은 0.5-1.1 범위이고, '동종접합성"의 것은 1.1을 상회한다.

표 10은 데이터 표의 예이다. 리포터1 = FAM 해독치, 리포터2 = Cy5 해독치, SOB1 = 바탕에 비교한 FAM의 신호 (535 nm에서의 바탕 신호 평균에 비교한 샘플 신호의 비), SOB2 = 바탕에 비교한 Cy5의 신호 (670 nm에서의 바탕 신호 평균에 비교한 샘플 신호의 비), 비 = SOB1/SOB2 (절대값), 선언(Call) = 헤르큘렉스 ^® I 이벤트 TC1507에 관한 야생형 (비 < 0.5), 반접합성 (비 > 0.5, 그러나 < 1.1), 및 동종접합성 (비 > 1.1) 샘플 해석.

<표 10>

PCR 및 형광 해독의 완료시, 상기한 바와 같이 분포 그래프를 작성하였다. 도 1을 참조하라.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences <120> ENDPOINT TAQMAN METHODS FOR DETERMINING ZYGOSITY OF CORN COMPRISING TC1507 EVENTS <130> DAS-P0164 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' flanking sequence of Genetically Modified Maize event TC1507 <400> 1 actagtttcc tagcccgcgt cgtgccccta ccccaccgac gtttatggaa ggtgccattc 60 cacggttctt cgtggccgcc cctaaggatg taaatggtcg gtaaaatccg gtaaatttcc 120 ggtaccgttt accagatttt tccagccgtt ttcggattta tcgggatata cagaaaacga 180 gacggaaacg gaataggttt tttttcgaaa acggtacggt aaacggtgag acaaacttac 240 cgtccgtttt cgtatttctc gggaaactct ggtatattcc cgtatttgtc ccgtattttc 300 ccgacccacg gacctgccaa tcaaccatca gccagtcagc ccatccccac agctatggcc 360 catggggcca tgttggccac atgcccacgc aacgcaaggc agtaaggctg gcagcctggc 420 acgcattgac gcatgtggac acacacagcc gccgcctgtt cgtgtttctg tgccgttgtg 480 cgagactgtg actgcgagtg gcggagtcgg cgaacggcga ggcgtctccg gagtctggac 540 tgcggctgtg gacagcgacg ctgtgacggc gactcggcga agccccaagc taccaagccc 600 ccaagtcccc atccatctct gcttctctgg tcatctcctt cccctggtcg atctgcaggc 660 gccagaccgg ccgaagcatc acgaaacgca ctaagacctc gaaggagtca aaccactcct 720 ccgaggcctc gggggctaca cccggcgggt gcgctcgcgc gcacccaccg gaacaaaatg 780 taaccgagaa aggtcggtcc ccttgcaaaa aaagtgcgac aaaagcctcc aagcgagtat 840 taacactcac tttgaggctc gggggctact gtcggggacc ataattaggg gtacccccaa 900 gactcctaat ctcagctggt aacccccatc agcacaaagc tgcaaaggcc tgatgggtgc 960 gattaagtca aggctcggtc cactcaaggg acacgatctc gcctcgcccg agcccagcct 1020 cgggcaaggg cggccgaccc cgaggattca cgtctcgccc gagggccccc tcaagcgacg 1080 ggcacacctt cggctcgccc gaggcccatt cttcgccgag aagcaacctt ggccagatcg 1140 ccacaccgac cgaccgtatc gcaggagcat ttaatgcgag gatcgcctga caccttatcc 1200 tgacgcgcgc tcttcagtcg acagagccga agtgaccgca atcacttcgc cgctccactg 1260 accgacctga caagaagaca gcgccgcctg cgtcgctccg actgctgtgc cactcgacag 1320 agtgaggctg acagcagcca agtccggcct cgggcgccat aggaagctcc gcctcgcccg 1380 accctagggc tcggactcgg cctcggctcc ggaagacgac gaactacgct tcgcccgacc 1440 ccagggcttg gactcagcct cggctccgga agacgacgaa ttccgcctcg cccgacccca 1500 gggctcggac tcggcctcgg ctccagaaga cgacgaactc cgcctcgccc gaccccaggg 1560 ctcggactca gcctcggctc cggaagacga cgaactccgc ctcgcccgac cccagggctc 1620 ggactcagcc tcggcctcag acgatggtct ccgcctcgcc cgacccgggg ctcggactcg 1680 acctttctat cggaccttgt cagatcctgt cttcgtccga ggaggctttg gcaatcctca 1740 ctatgtactc ggtcttaggg gagtggcctt tcaacaaact ggtacgaatc acacccgcac 1800 attcaggaac tccgggacca ttgactctct agatgagata ccacctcaag acaacagcgg 1860 cgcaccttgg aatgactact cccatgtgct gaatcatgtt acctttgtgc gctggccagg 1920 tgagatctca ggttccgact catggagagc accaatgttc tcttggacgc atcgtagcgc 1980 tacccccaca aacaccattg atccagagag aatcactcat tcttcaagaa ctgcatatct 2040 tgccgagatc ctcatcccta aaggtacttg acaatagtat tattggagtc gatacacaac 2100 tcacaaaaaa tacaagaagt cgactaggtg gattggtccg agtgaagaga aaaaaaagcc 2160 atacagaact caaaatcttt tccggagata ttcattttcc tgaagaggcg gataagatat 2220 taggtggcag tttgatacca ccagaaagag aaaaaaaaga ttctaaggaa 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taatggatat ttttattata 180 atattgatga tatctcaatc aaaacgtaga taataataat atttatttaa tatttttgcg 240 tcgcacagtg aaaatctata tgagattaca aaataccgac aacattattt aagaaacata 300 gacattaacc ctgagactgt tggacatcaa cgggtagatt ccttcatgca tagcacctca 360 ttcttgggga caaaagcacg gtttggccgt tccattgctg cacgaacgag ctttgctata 420 tcctcgggtt ggatcatctc atcaggtcca atcaaatttg tccaagaact catgttagtc 480 gcaacgaaac cggggcatat gtcgggtatc tcgagctcgc gaaagcttgg ctgcaggtcg 540 acggatcctt caacaaaagg gtacctgtac ccgaaaccga cacaggtggg taggtagaga 600 atacctaggg gcgcgagaca actctctcta aggaactcgg caaaatagcc ccgtaacttc 660 gggagaaggg gtgccccccg ctaacaataa acgaatacgg tttatgtatg gattccggta 720 aaataccggt actcgatttc ataagagtcg aataggaagt taagatgagg gtggtatcat 780 cataaaaatg gagtagtatc ctaaattata ctaatccacg tatgatatgt atgcctttcc 840 ttatcaaccg gaagtagtgc aaaaaaaatt ctatactgca ctgctctctt tttactgaga 900 aatgcaaaaa aataaaagtg aagtaagggt gccccataga tatttgatct tgcctcctgt 960 cccccccccc cttttttcat caaaaatttc catgaaaaaa gaaaagatga atttgtccat 1020 tcattgaacc ctagttcggg actgacgggg ctcgaacccg cagcttccgc ctgttcctag 1080 ccttccaggg cccagcgtaa gcaataccag ccacagcacc ctcaacctca gcaaccaacc 1140 aagggtatct atcttgcaac ctctctagat catcaatcca ctcttgtggt gtttgtggct 1200 ctgtcctaaa gttcactgta gacgtctcaa tgtaatggtt aacgatatca caaaccgcgg 1260 aacacaagaa cgaaagcacc ttttcattct ttcatatact aggggttttt acttggaaaa 1320 gacaatgttc catactaaag gatagctgca gaagccgcca ccgtcttgag gaccttccgg 1380 ggagccagac cggtcgaacc gtgcctccac ttgctaagga gaaagggaaa atcagggcca 1440 ggacatacga aggaggagcc agaacgaaga tatcctaaga tacttactcg ctccgggcca 1500 tgatcaatca tgcctgtggg gaggtctctc gcacctcgat ccatgaaggt accaccgagg 1560 tctgccccgc cgccggcttc ggtaccgtcc tcgccttggg cgcccgaggc acccggggga 1620 tggactgccc aggcgcagcc acgacgaccc aaggatcacc ctcctgcgca gtcggcacga 1680 gcaatagttc tcggggaaca ggcagcttgg cctgactccc cggggtcacc tcaactacct 1740 cggccgaggg gtcaagtacc ccctcagtcc gcccccgctc ttcggaccgg gaccccgacg 1800 tcccggcccc ggataccgac ggcaccagcc cgctcggggg ctggcttgac gacccctggc 1860 ccagcctcag atctgggctg aggccgaggc aggcggccat gtcgtcgtct tcatcatcgt 1920 cttcatcatc gtcgtcgtca tcaggcgtct ccggcgacgg ctcccttggg agcccctccc 1980 tctcctgccg acgacgaagc ctttccaagg catcccgagc ccacgtccgc tcgtgggccc 2040 gagccttctt tgcgtccttc ttctccttcc tcttctccgc ggtgaccctc cgcgcagctc 2100 ggtccaccgc atcctccggg actggtggca gggaaggctt gtgatgccct acctcctgga 2160 gacagacgaa aagtctcagc tatgagaacc gagggcaatc tgacgcaaga aggaagaagg 2220 agcggatact caccagagac acgcacccgc gatcgggacg cattaagggc tgggaaaaag 2280 tgccggcctc taatttcgct accgtgccgt ccacccacct gtggaggtca tcgatgggaa 2340 ggggaa 2346 <210> 3 <211> 11361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Contiguous Sequence for Maize Event TC1507 including 5' flanking sequence, cry1F insert, and 3' flanking sequence <400> 3 actagtttcc tagcccgcgt cgtgccccta ccccaccgac gtttatggaa ggtgccattc 60 cacggttctt cgtggccgcc cctaaggatg taaatggtcg gtaaaatccg gtaaatttcc 120 ggtaccgttt accagatttt tccagccgtt ttcggattta tcgggatata cagaaaacga 180 gacggaaacg gaataggttt tttttcgaaa acggtacggt aaacggtgag acaaacttac 240 cgtccgtttt cgtatttctc gggaaactct ggtatattcc cgtatttgtc ccgtattttc 300 ccgacccacg gacctgccaa tcaaccatca gccagtcagc ccatccccac agctatggcc 360 catggggcca tgttggccac atgcccacgc aacgcaaggc agtaaggctg gcagcctggc 420 acgcattgac gcatgtggac acacacagcc gccgcctgtt cgtgtttctg tgccgttgtg 480 cgagactgtg actgcgagtg gcggagtcgg cgaacggcga ggcgtctccg gagtctggac 540 tgcggctgtg gacagcgacg ctgtgacggc gactcggcga agccccaagc taccaagccc 600 ccaagtcccc atccatctct gcttctctgg tcatctcctt cccctggtcg atctgcaggc 660 gccagaccgg ccgaagcatc acgaaacgca ctaagacctc gaaggagtca aaccactcct 720 ccgaggcctc gggggctaca cccggcgggt gcgctcgcgc gcacccaccg gaacaaaatg 780 taaccgagaa aggtcggtcc ccttgcaaaa aaagtgcgac aaaagcctcc aagcgagtat 840 taacactcac tttgaggctc gggggctact gtcggggacc ataattaggg gtacccccaa 900 gactcctaat ctcagctggt aacccccatc agcacaaagc tgcaaaggcc tgatgggtgc 960 gattaagtca aggctcggtc cactcaaggg acacgatctc gcctcgcccg agcccagcct 1020 cgggcaaggg cggccgaccc cgaggattca cgtctcgccc gagggccccc tcaagcgacg 1080 ggcacacctt cggctcgccc gaggcccatt cttcgccgag aagcaacctt ggccagatcg 1140 ccacaccgac cgaccgtatc gcaggagcat ttaatgcgag gatcgcctga caccttatcc 1200 tgacgcgcgc tcttcagtcg acagagccga agtgaccgca atcacttcgc cgctccactg 1260 accgacctga caagaagaca gcgccgcctg cgtcgctccg actgctgtgc cactcgacag 1320 agtgaggctg acagcagcca agtccggcct cgggcgccat aggaagctcc gcctcgcccg 1380 accctagggc tcggactcgg cctcggctcc ggaagacgac gaactacgct tcgcccgacc 1440 ccagggcttg gactcagcct cggctccgga agacgacgaa ttccgcctcg cccgacccca 1500 gggctcggac tcggcctcgg ctccagaaga cgacgaactc cgcctcgccc gaccccaggg 1560 ctcggactca gcctcggctc cggaagacga cgaactccgc ctcgcccgac cccagggctc 1620 ggactcagcc tcggcctcag acgatggtct ccgcctcgcc cgacccgggg ctcggactcg 1680 acctttctat cggaccttgt cagatcctgt cttcgtccga ggaggctttg gcaatcctca 1740 ctatgtactc ggtcttaggg gagtggcctt tcaacaaact ggtacgaatc acacccgcac 1800 attcaggaac tccgggacca ttgactctct agatgagata ccacctcaag acaacagcgg 1860 cgcaccttgg aatgactact cccatgtgct gaatcatgtt acctttgtgc gctggccagg 1920 tgagatctca ggttccgact catggagagc accaatgttc tcttggacgc atcgtagcgc 1980 tacccccaca aacaccattg atccagagag aatcactcat tcttcaagaa ctgcatatct 2040 tgccgagatc ctcatcccta aaggtacttg acaatagtat tattggagtc gatacacaac 2100 tcacaaaaaa tacaagaagt cgactaggtg gattggtccg agtgaagaga aaaaaaagcc 2160 atacagaact caaaatcttt tccggagata ttcattttcc tgaagaggcg gataagatat 2220 taggtggcag tttgatacca ccagaaagag aaaaaaaaga ttctaaggaa tcaaaaaaaa 2280 ggaaaaattg ggtttatgtt caacggaaaa aatttctcaa aagcaaggaa aagtattgtg 2340 gctatttatc tatccgtgca gctgatatgg ccgcggtttg tgatatcgtt aaccattaca 2400 ttgagacgtc tacagtgaac tttaggacag agccacaaac accacaagag tggattgatg 2460 atctagagag gttgcaagat agataccctt ggttggttgc tgaggttgag ggtgttgtgg 2520 ctggtattgc ttacgctggg ccctggaagg ctaggaaccc tcaacctcag caaccaacca 2580 atggtatcta tcttgcaacc tctctagatc atcaatccac tcttgtggtg tttgtggctc 2640 tgtcctaaag ttcactgtag acgtctcaat gtaatggtta acgatatcac aaaccgagag 2700 aagagggatc 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acattgaagc actaagagag tgggaagcca atcctaacaa tgcccaactg 5280 agagaagatg tgcgtatacg ctttgctaac acagatgatg ctttgatcac agccatcaac 5340 aacttcaccc ttaccagctt cgagatccct cttctctcgg tctatgttca agctgctaac 5400 ctgcacttgt cactactgcg cgacgctgtg tcgtttgggc aaggttgggg actggacata 5460 gctactgtca acaatcacta caacagactc atcaatctga ttcatcgata cacgaaacat 5520 tgtttggata cctacaatca gggattggag aacctgagag gtactaacac tcgccaatgg 5580 gccaggttca atcagttcag gagagacctt acacttactg tgttagacat agttgctctc 5640 tttccgaact acgatgttcg tacctatccg attcaaacgt catcccaact tacaagggag 5700 atctacacca gttcagtcat tgaagactct ccagtttctg cgaacatacc caatggtttc 5760 aacagggctg agtttggagt cagaccaccc catctcatgg acttcatgaa ctctttgttt 5820 gtgactgcag agactgttag atcccaaact gtgtggggag gacacttagt tagctcacgc 5880 aacacggctg gcaatcgtat caactttcct agttacgggg tcttcaatcc cgggggcgcc 5940 atctggattg cagatgaaga tccacgtcct ttctatcgga ccttgtcaga tcctgtcttc 6000 gtccgaggag gctttggcaa tcctcactat gtactcggtc ttaggggagt ggcctttcaa 6060 caaactggta cgaatcacac ccgcacattc aggaactccg ggaccattga ctctctagat 6120 gagataccac ctcaagacaa cagcggcgca ccttggaatg actactccca tgtgctgaat 6180 catgttacct ttgtgcgctg gccaggtgag atctcaggtt ccgactcatg gagagcacca 6240 atgttctctt ggacgcatcg tagcgctacc cccacaaaca ccattgatcc agagagaatc 6300 actcagattc ccttggtgaa ggcacacaca cttcagtcag gaactacagt tgtaagaggg 6360 ccggggttca cgggaggaga cattcttcga cgcactagtg gaggaccatt cgcgtacacc 6420 attgtcaaca tcaatgggca acttccccaa aggtatcgtg ccaggatacg ctatgcctct 6480 actaccaatc taagaatcta cgttacggtt gcaggtgaac ggatctttgc tggtcagttc 6540 aacaagacaa tggataccgg tgatccactt acattccaat ctttctccta cgccactatc 6600 aacaccgcgt tcacctttcc aatgagccag agcagtttca cagtaggtgc tgataccttc 6660 agttcaggca acgaagtgta cattgacagg tttgagttga ttccagttac tgccacactc 6720 gagtaaggat ccgtcgacct gcagccaagc tttcgcgagc tcgagatccc cgacatatgc 6780 cccggtttcg ttgcgactaa catgagttct tggacaaatt tgattggacc tgatgagatg 6840 atccaacccg aggatatagc aaagctcgtt cgtgcagcaa tggaacggcc aaaccgtgct 6900 tttgtcccca agaatgaggt gctatgcatg aaggaatcta cccgttgatg tccaacagtc 6960 tcagggttaa tgtctatgta tcttaaataa tgttgtcggt attttgtaat ctcatataga 7020 ttttcactgt gcgacgcaaa aatattaaat aaatattatt attatctacg ttttgattga 7080 gatatcatca atattataat aaaaatatcc attaaacacg atttgataca aatgacagtc 7140 aataatctga tttgaatatt tattaattgt aacgaattac ataaagatcg aatagaaaat 7200 actgcactgc aaatgaaaat taacacatac taataaatgc gtcaaatatc tttgccaaga 7260 tcaagcggag tgagggcctc atatccggtc tcagttacaa gcacggtatc cccgaagcgc 7320 gctccaccaa tgccctcgac atagatgccg ggctcgacgc tgaggacatt gcctaccttg 7380 agcatggtct cagcgccggc tttaagctca atcccatccc aatctgaata tcctatcccg 7440 cgcccagtcc ggtgtaagaa cgggtctgtc catccacctc tgttgggaat tccggtccgg 7500 gtcacctttg tccaccaaga tggaactgcg gccgcggacc gaattcccat ggagtcaaag 7560 attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt catacagagt 7620 ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca cgacacgctt 7680 gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat tgagactttt 7740 caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt 7800 attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga 7860 aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg 7920 aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt 7980 gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc 8040 tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacagggt acccggggat ccaccatgtc 8100 tccggagagg agaccagttg agattaggcc agctacagca gctgatatgg ccgcggtttg 8160 tgatatcgtt aaccattaca ttgagacgtc tacagtgaac tttaggacag agccacaaac 8220 accacaagag tggattgatg atctagagag gttgcaagat agataccctt ggttggttgc 8280 tgaggttgag ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctggg ccctggaagg ctaggaacgc 8340 ttacgattgg acagttgaga gtactgttta cgtgtcacat aggcatcaaa ggttgggcct 8400 aggatccaca ttgtacacac atttgcttaa gtctatggag gcgcaaggtt ttaagtctgt 8460 ggttgctgtt ataggccttc caaacgatcc atctgttagg ttgcatgagg ctttgggata 8520 cacagcccgg ggtacattgc gcgcagctgg atacaagcat ggtggatggc atgatgttgg 8580 tttttggcaa agggattttg agttgccagc tcctccaagg ccagttaggc cagttaccca 8640 gatctgagtc gacctgcagg catgcccgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat 8700 ctctctctat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt cttatagggt 8760 ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact 8820 tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tggcgagctc gaattcgagc 8880 tcgagcccgg gtggatcctc tagagtcgac ctgcagaagc ttcggtccgg cgcgcctcta 8940 gttgaagaca cgttcatgtc ttcatcgtaa gaagacactc agtagtcttc ggccagaatg 9000 gcctaactca aggccctcac tccgcttgat cttggcaaag atatttgacg catttattag 9060 tatgtgttaa ttttcatttg cagtgcagta ttttctattc gatctttatg taattcgtta 9120 caattaataa atattcaaat cagattattg actgtcattt gtatcaaatc gtgtttaatg 9180 gatattttta ttataatatt gatgatatct caatcaaaac gtagataata ataatattta 9240 tttaatattt ttgcgtcgca cagtgaaaat ctatatgaga ttacaaaata ccgacaacat 9300 tatttaagaa acatagacat taaccctgag actgttggac atcaacgggt agattccttc 9360 atgcatagca cctcattctt ggggacaaaa gcacggtttg gccgttccat tgctgcacga 9420 acgagctttg ctatatcctc gggttggatc atctcatcag gtccaatcaa atttgtccaa 9480 gaactcatgt tagtcgcaac gaaaccgggg catatgtcgg gtatctcgag ctcgcgaaag 9540 cttggctgca ggtcgacgga tccttcaaca aaagggtacc tgtacccgaa accgacacag 9600 gtgggtaggt agagaatacc taggggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 9660 tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc ccccgctaac aataaacgaa tacggtttat 9720 gtatggattc cggtaaaata ccggtactcg atttcataag agtcgaatag gaagttaaga 9780 tgagggtggt atcatcataa aaatggagta gtatcctaaa ttatactaat ccacgtatga 9840 tatgtatgcc tttccttatc aaccggaagt agtgcaaaaa aaattctata ctgcactgct 9900 ctctttttac tgagaaatgc aaaaaaataa aagtgaagta agggtgcccc atagatattt 9960 gatcttgcct cctgtccccc cccccctttt ttcatcaaaa atttccatga aaaaagaaaa 10020 gatgaatttg tccattcatt gaaccctagt tcgggactga cggggctcga acccgcagct 10080 tccgcctgtt cctagccttc cagggcccag cgtaagcaat accagccaca gcaccctcaa 10140 cctcagcaac caaccaaggg tatctatctt gcaacctctc tagatcatca atccactctt 10200 gtggtgtttg tggctctgtc ctaaagttca ctgtagacgt ctcaatgtaa tggttaacga 10260 tatcacaaac cgcggaacac aagaacgaaa gcaccttttc attctttcat atactagggg 10320 tttttacttg gaaaagacaa tgttccatac taaaggatag ctgcagaagc cgccaccgtc 10380 ttgaggacct tccggggagc cagaccggtc gaaccgtgcc tccacttgct aaggagaaag 10440 ggaaaatcag ggccaggaca tacgaaggag gagccagaac gaagatatcc taagatactt 10500 actcgctccg ggccatgatc aatcatgcct gtggggaggt ctctcgcacc tcgatccatg 10560 aaggtaccac cgaggtctgc cccgccgccg gcttcggtac cgtcctcgcc ttgggcgccc 10620 gaggcacccg ggggatggac tgcccaggcg cagccacgac gacccaagga tcaccctcct 10680 gcgcagtcgg cacgagcaat agttctcggg gaacaggcag cttggcctga ctccccgggg 10740 tcacctcaac tacctcggcc gaggggtcaa gtaccccctc agtccgcccc cgctcttcgg 10800 accgggaccc cgacgtcccg gccccggata ccgacggcac cagcccgctc gggggctggc 10860 ttgacgaccc ctggcccagc ctcagatctg ggctgaggcc gaggcaggcg gccatgtcgt 10920 cgtcttcatc atcgtcttca tcatcgtcgt cgtcatcagg cgtctccggc gacggctccc 10980 ttgggagccc ctccctctcc tgccgacgac gaagcctttc caaggcatcc cgagcccacg 11040 tccgctcgtg ggcccgagcc ttctttgcgt ccttcttctc cttcctcttc tccgcggtga 11100 ccctccgcgc agctcggtcc accgcatcct ccgggactgg tggcagggaa ggcttgtgat 11160 gccctacctc ctggagacag acgaaaagtc tcagctatga gaaccgaggg caatctgacg 11220 caagaaggaa gaaggagcgg atactcacca gagacacgca cccgcgatcg ggacgcatta 11280 agggctggga aaaagtgccg gcctctaatt tcgctaccgt gccgtccacc cacctgtgga 11340 ggtcatcgat gggaagggga a 11361 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tagtcttcgg ccagaatgg 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctttgccaag atcaagcg 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 taactcaagg ccctcactcc g 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgctctgtac aagcgtgc 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcaaagtgtt gtgcttggac c 21 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 cacgtgagaa tttccgtcta ctcgagcct 29 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgtcgtttcc catctcttcc tcc 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ccactccgag accctcagtc 20 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 aatcagggct cattttctcg ctcctca 27 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ttggactaga aatctcgtgc tga 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gctacatagg gagccttgtc ct 22 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 18 caatccacac aaacgcacgc gta 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgcagcaact gttggcctta 20 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcatgttagg cgtcatcatc tgt 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 catcactggc atcgtctgaa gcgg 24

Claims

옥수수(Zea mays) 조직에서의 TC1507 이벤트의 접합성(zygosity) 측정 방법으로서, 상기 TC1507 이벤트는 cry1F 유전자를 포함하는 이전유전자(transgene) 구성체를 포함하고, 상기 방법은 상기 TC1507 이벤트 및 내생 참조 유전자를 검출하는 데에 형광-기반의 종료점 태크 PCR 분석을 사용하는 것을 포함하며, 상기 방법은
상기 옥수수 조직으로부터 게놈 DNA의 샘플을 수득하는 것,
상기 샘플을
a. 이벤트 정방향 프라이머 및 이벤트 역방향 프라이머 (여기서 상기 이벤트 프라이머들 중 1종 이상은 상기 이전유전자 구성체에 특이적으로 결합되며, 상기 프라이머들은 상기 이벤트가 상기 샘플 중에 존재할 경우, 그에 대하여 진단성인 이벤트 앰플리콘(amplicon)을 생성시킴)
b. 상기 내생 참조 유전자로부터 참조 앰플리콘을 생성시키는 참조 정방향 프라이머 및 참조 역방향 프라이머
c. 상기 이벤트 앰플리콘과 혼성화되는 형광 이벤트 프로브
d. 상기 참조 앰플리콘과 혼성화되는 형광 참조 프로브
와 접촉시키는 것,
상기 이벤트 앰플리콘에 혼성화된 상기 형광 이벤트 프로브를 정량하는 것,
상기 참조 앰플리콘에 혼성화된 상기 형광 참조 프로브를 정량하는 것,
혼성화된 형광 이벤트 프로브와 혼성화된 형광 참조 프로브의 양을 비교하는 것, 및
혼성화된 형광 이벤트 프로브와 혼성화된 형광 참조 프로브의 형광 비를 비교함으로써 TC1507의 접합성을 측정하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 1종의 이벤트 프라이머는 TC1507 플랭킹 서열에 혼성화되고, 1종의 이벤트 프라이머는 상기 이전유전자 구성체에 혼성화되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 TC1507 플랭킹 서열이 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 이전유전자 구성체가 SEQ ID NO:3의 잔기 2830-9015인 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 유전자가 내생 옥수수 인버타제 유전자인 방법.
제2항에 있어서, 상기 플랭킹 서열이 SEQ ID NO:3의 잔기 2629-2829인 방법.
제2항에 있어서, 상기 플랭킹 서열이 SEQ ID NO:3의 잔기 9016-9216인 방법.
제5항에 있어서, 또 다른 옥수수 주(line)로의 TC1507 이벤트의 번식 유전자이입에 사용되는 방법.
제8항에 있어서, 상기 또 다른 옥수수 주가 무효(null) TC1507 옥수수 주인 방법.
제1항에 있어서, 상기 이벤트 앰플리콘이 58 염기쌍인 방법.
제5항에 있어서, 상기 참조 유전자가 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 및 SEQ ID NO:9로 구성되는 군에서 선택되는 서열을 포함하거나, 그에 혼성화되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 프라이머가 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8을 포함하며, 상기 참조 프로브가 SEQ ID NO:9를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 프로브가 형광 염료 및 켄처(quencher)로 표지되는 방법.
제13항에 있어서, 상기 이벤트 프로브가 상기 형광 염료로서 상기 이벤트 프로브의 5' 말단에 FAM을 포함하며, 상기 켄처로서 상기 이벤트 프로브의 3' 말단에 블랙 홀 켄처 1 (BHQ1)을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 유전자가 단일 또는 적은 사본 수의 PCR 증폭을 할 수 있는 보존되는 옥수수 내생 유전자인 방법.
제13항에 있어서, 상기 참조 프로브가 상기 참조 프로브의 5' 말단에서 Cy5에 의해 표지되며, 상기 참조 프로브의 3' 말단에서 블랙 홀 켄처 2 (BHQ2)에 의해 표지되는 방법.
제12항에 있어서, 상기 참조 앰플리콘이 상기 프라이머들에 의해 증폭된 104 염기쌍 단편인 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 프로브가 SEQ ID NO:9를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 정방향 프라이머가 SEQ ID NO:7을 포함하며, 상기 참조 역방향 프라이머가 SEQ ID NO:8을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 결과가 직접 플레이트 해독기에서 해독되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플이 포장(field)에서 옥수수 식물로부터 수득되는 방법.
제1항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서,
a. 이벤트 정방향 프라이머 및 이벤트 역방향 프라이머 (여기서 상기 이벤트 프라이머들 중 1종 이상은 상기 cry1F 이전유전자 구성체에 특이적으로 결합되며, 상기 프라이머들은 상기 이벤트가 상기 샘플 중에 존재할 경우, 그에 대하여 진단성인 이벤트 앰플리콘을 생성시킴);
b. 상기 내생 참조 유전자로부터 참조 앰플리콘을 생성시키는 참조 정방향 프라이머 및 참조 역방향 프라이머;
c. 상기 이벤트 앰플리콘과 혼성화되는 이벤트 프로브; 및
d. 상기 참조 앰플리콘과 혼성화되는 참조 프로브
를 포함하는 키트.