CN108359717A

CN108359717A - 一种直扩rpa现场可视化检测方法

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Publication number: CN108359717A
Application number: CN201810447842.XA
Authority: CN
Inventors: 赵凯; 范小瑞; 赵笑; 杜亚楠; 张琪; 张晓霞; 吴文静; 张皖静; 赵庆; 史斌; 赵桓震; 赵斌安; 潘磊
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2018-08-03

Abstract

一种直扩RPA现场可视化检测方法，包括如下步骤：1)粗提待测样品基因组DNA；2)针对目的基因设计RPA特异性引物；3)将RPA特异性引物加入到RPA反应体系中进行RPA扩增反应，所述RPA反应体系中成分的终浓度为：外引物F 0.12‑0.48μM，内引物R 0.12‑0.48μM，dNTPs1.4‑1.8mM，MgOAc 8.4‑14mM，模板DNA 1～2μL；反应程序：32‑42℃，5‑10min；4)鉴定扩增结果：向扩增产物中加入SYBR Green I染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性；显色为橘色的样品为阴性。本发明可应用于来源于动物、植物、微生物的所有基因进行RPA检测，对RPA扩增产物实现了快速、简便、可视化鉴定。

Description

一种直扩RPA现场可视化检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及可用于所有基因检测的直扩RPA现场可视化检测方法，还涉及用于检测转基因玉米TC1507和金黄色葡萄球菌的直扩RPA现场可视化检测方法。

背景技术

目前，涉及到基因检测，传统的分子诊断方法主要有PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片和环介导等温扩增方法(LAMP)，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymeraseamplification，RPA)。RPA是一种新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。自2006年问世后，已应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。

现有的RPA检测方法虽然应用广泛，但是仍然存在一些缺陷，其中，最主要的表现在对于产物的检测方面。RPA与琼脂糖凝胶电泳结合，RPA扩增产物检测时，为了避免体系其他成分对电泳的影响例如产生拖带，需要对扩增产物进行纯化，去掉引物、酶等干扰检测的成分。与exo探针结合的实时荧光定量RPA技术，在结果检测时需要使用荧光检测仪。与nfo探针结合的RPA-LFD检测技术，在结果检测时需要使用侧流试纸条，并且RPA扩增产物需要稀释才能使用该方法检测，否认反应底物对试纸上抗体会造成干扰。RPA与染料法结合，RPA产物检测是使用SYBR GreenⅠ染料对RPA产生的DNA双链进行染色，以此实现对结果的可视化观察，具体是对扩增产物双倍稀释后，在紫外手电筒的帮助下，通过肉眼观察结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直扩RPA现场可视化检测方法，应用于来源于动物、植物、微生物的所有基因进行RPA检测，对RPA扩增产物实现快速、简便、可视化鉴定。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种直扩RPA现场可视化检测方法，其包括如下步骤：

1)粗提待测样品的基因组DNA；

2)针对目的基因设计用于RPA检测的特异性引物，所述RPA特异性引物包括外引物F和内引物R；

3)将步骤1)粗提的基因组DNA作为模板，步骤2)设计的RPA特异性引物加入到RPA反应体系中，进行RPA扩增反应：

以ddH₂O为阴性对照，以含有目的片段的待测样品基因组DNA为阳性，配制RPA反应体系：所述RPA反应体系包含外引物F、内引物R、dNTPs、MgOAc(醋酸镁)、模板DNA，其中，成分的终浓度为：外引物F 0.12-0.48μM，内引物R 0.12-0.48μM，dNTPs 1.4-1.8mM，MgOAc8.4-14mM，模板DNA 1～2μL；

RPA扩增反应的程序为：32-42℃，5-10min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)RPA扩增反应结束后，向扩增产物中加入SYBR Green I染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性；显色为橘色的样品为阴性。

进一步，所述粗提待测样品基因组DNA的方法包括：向待测样品中加入粗提试剂对待测样品进行5～10倍稀释，混匀，室温放置1min以上，即可作为待测样品模板使用；所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为：48～52：1。

本发明所述RPA反应体系还包含2×Reaction Buffer(反应缓冲液)、10×BasicE-mix(基本酶混合液)、20×Core Reaction Mix(核心反应混合液)。

优选的，步骤3)中，所述RPA反应体系(50μL)中各成分的终浓度为：F 0.24-0.48μM，R 0.24-0.48μM，2×Reaction Buffer 25μL，dNTPs 1.4-1.6mM，10×Basic E-mix 5μL，20×Core Reaction Mix 2.5μL和MgOAc 11.2-14mM，模板DNA 1～2μL。

优选的，步骤3)中，所述RPA扩增反应程序中反应温度为36-42℃。

本发明提供的直扩RPA现场可视化检测方法适用于检测来源于动物、植物、微生物的所有基因，例如，可用于检测待测样品中是否含有玉米、大豆、水稻、油菜、转基因玉米、转基因大豆、转基因水稻、转基因油菜等成分；待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、腊样芽孢杆菌、炎链球菌、单核增生李斯特氏菌、致病性大肠杆菌、肉毒梭菌等。

本发明还提供一种直扩RPA现场可视化检测试剂盒，其包含RPA反应体系，所述RPA反应体系中成分的终浓度为：正向引物F 0.12-0.48μM，反向引物R 0.12-0.48μM，dNTPs1.4-1.8mM，MgOAc 8.4-14mM。

进一步，所述直扩RPA现场可视化检测试剂盒中RPA反应体系还包含2×ReactionBuffer、10×Basic E-mix、20×Core Reaction Mix。

本发明还提供一种用于直扩RPA方法检测转基因玉米TC1507的RPA特异性引物，包括外引物F和内引物R，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

内引物R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC。

一种检测转基因玉米TC1507的直扩RPA现场可视化检测方法，其包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组DNA

2)设计RPA特异性引物

RPA特异性引物包括外引物F和内引物R，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

内引物R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC；

3)将步骤2)设计的RPA特异性引物加入到RPA反应体系中，进行RPA扩增反应；

以ddH₂O为阴性对照，以包含待测样品基因组DNA为阳性(待测样品目的序列的基因组为阳性)，配制RPA反应体系；

所述RPA反应体系中成分的终浓度为：外引物F 0.12-0.48μM，内引物R 0.12-0.48μM，dNTPs 1.4-1.8mM，MgOAc 8.4-14mM，模板DNA 1～2μL；

RPA扩增反应的程序为：36-42℃，5-10min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)RPA扩增反应结束后，向扩增产物中加入SYBR Green I染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有转基因玉米TC1507基因组DNA；显色为橘色的样品为阴性，不含有转基因玉米TC1507基因组DNA。

进一步，步骤1)中，粗提待测样品基因组DNA的方法为：向待测样品中加入粗提试剂，混匀，室温放置1min以上，即可作为待测样品模板使用；待测样品与粗提试剂lysisbuffer的质量体积比为：0.5～1：1×10⁴，单位：g/μL；所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为48～52：1。

步骤3)中，所述RPA反应体系还包含2×Reaction Buffer、10×Basic E-mix、20×Core Reaction Mix。

优选的，上述步骤3)中，所述RPA反应体系(50μL)中各成分的终浓度为：F 0.24-0.48μM，R 0.24-0.48μM，2×Reaction Buffer 25μL，dNTPs 1.4-1.6mM，10×Basic E-mix5μL，20×Core Reaction Mix 2.5μL和MgOAc 11.2-14mM，模板DNA 1～2μL。

本发明还提供一种用于直扩RPA方法检测金黄色葡萄球菌的RPA特异性引物，包括外引物F和内引物R，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物F：ATGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；

内引物R：CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。

一种检测金黄色葡萄球菌的直扩RPA现场可视化检测方法，其包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组DNA

2)设计RPA特异性引物

外引物F：ATGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；

内引物R：CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA；

RPA扩增反应的程序为：32-42℃，5-10min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)RPA扩增反应结束后，向扩增产物中加入SYBR Green I染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有金黄色葡萄球菌基因组DNA；显色为橘色的样品为阴性，不含有金黄色葡萄球菌基因组DNA。

进一步，步骤1)中，所述粗提待测样品基因组DNA包括如下步骤：将待测样品切碎后加灭菌的生理盐水得到浆液，向浆液中加入粗提试剂，混匀，室温放置1min以上，即可作为待测样品模板使用；其中，待测样品与生理盐水的质量体积比为1：1～9，单位：g/μL；浆液与粗提试剂的体积比为：1:4～9；所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为48～52：1。

再，步骤3)中，所述RPA反应体系还包含2×Reaction Buffer、10×Basic E-mix、20×Core Reaction Mix。

优选的，步骤3)中，所述的50μL的RPA反应体系中，各成分的终浓度为：外引物F0.12-0.48μM，内引物R 0.12-0.48μM，2×Reaction Buffer 25μL，dNTPs 1.4-1.8mM，10×Basic E-mix 5μL，20×Core Reaction Mix2.5μL和MgOAc 8.4-14mM，模板基因组DNA 1～2μL。

更优选的，所述的50μL的RPA反应体系中，各成分的终浓度为：F 0.24-0.48μM，R0.24-0.48μM，2×Reaction Buffer 25μL，dNTPs 1.4-1.6mM，10×Basic E-mix 5μL，20×Core Reaction Mix 2.5μL和MgOAc 11.2-14mM，模板基因组DNA 1～2μL。

本发明对RPA反应体系中的引物浓度、MgOAc浓度、dNTPs浓度和反应程序中反应温度、反应时间进行了改进。改进后的RPA反应体系和反应程序适用于所有基因的RPA检测。因此，在检测不同基因时，可根据待测样品和检测目的不同进行特异性RPA引物设计，然后使用本发明的直扩RPA快速即时可视化检测方法进行检测。

本发明所述RPA反应体系中内、外引物浓度为0.24-0.48μM，dNTPs浓度范围为1.4-1.8mM，MgOAc浓度范围为8.4-14mM，RPA扩增反应时退火温度范围为：32-42℃，反应时间范围为5-10min。在上述反应体系和反应程序下进行扩增，使用凝胶电泳法可检测出明显的阳性目的条带，即目的条带单一、无杂带，且目的条带更宽更亮更清晰，易与阴性条带区分开来，并且在扩增产物中加入染料后，阳性样品颜色变化明显为绿色且亮度更明显，而阴性样品仍为橘色。

本发明提供的检测方法可在恒温条件下(32～42℃，优选36～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且在5～10min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的操作性，可在非实验条件下完成核酸检测，具有广阔的应用前景。

本发明提供的RPA反应体系可制备成相应的试剂盒，方便使用。

本发明基于对RPA反应体系和反应程序的上述改进，对RPA反应体系中模板DNA的纯度要求大大降低，通过待测样品与粗提试剂反应1min以上(实际操作中，反应1min即可获得非常好的RPA扩增效果)，再稀释5-10倍即可作为模板使用，省去提取基因组这一步骤，不仅节约时间，还简化步骤，避免污染，节省成本，这是本发明的一个显著进步。

在结果判定方面，由于现有技术必须将RPA扩增产物进行纯化或稀释后加染料。但纯化或稀释后扩增产物浓度降低，就需要紫外线照射才能观察到显色，既增加了实验操作步骤，又增加了仪器设备，还会对产物带来不同程度的污染。

本发明利用改进后的RPA反应体系和程序得到的扩增产物杂质少、没有经过稀释，纯度高，达到可直接显色的要求，因此，本发明直接在扩增产物中加染料进行显色观察，且显色结果明亮、清晰，可在日光灯或者阳光下直接观察到。可见，本发明无需对扩增反应产物进行纯化或稀释，减少了产物污染的几率；不用多余的显色试剂盒(如侧流层析)，不借助紫外手电筒等，无需任何仪器设备，固本发明简化了结果判定步骤，节约了时间，减少了成本，实现了反应结果的可视化、易判定，可应用于现场检测，达到快速、即时、免仪器显色的特点。

本发明在上述这些方面的改进真正使RPA检测做到了无仪器，快速，可视化。因此，本发明中直扩RPA现场可视化检测在非实验室条件也能检测，尤其是放牧场，种植基地，基层兽医站，养殖场和偏远地区等实验条件简陋的地方。

本发明提供的直扩RPA现场可视化检测方法，首先，通过直扩试剂粗提基因组用于RPA实验，整个粗提过程1～2min可完成；整个RPA扩增反应约5-10min且能达到指数级的扩增并且能检测出产物；最后在RPA扩增产物中加显色剂，在日光灯或阳光下可快速、直接观察到实验结果，整个过程约6-15min即可完成，这在现场检测中很大程度上做到简单、快速、灵敏有效，真正达到快速、可视化、现场检测的目的。

与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的RPA-染色检测法具有如下优势：(1)RPA反应利用人体体温就可以完成反应，即在腋下或者握在拳头里就能实现RPA扩增，RPA反应不需要仪器；(2)扩增产物不需要后续的稀释或者纯化，可直接与染料反应在日光灯或者阳光下进行显色观察。这些改进在操作上节约了时间，节省了试剂，简化了实验步骤。

由于利用粗提试剂对基因组进行粗提得到的基因组中DNA不纯，杂质较多，无法满足现有RPA扩增要求。本发明提供的检测方法可直接用粗提基因组进行扩增，使本发明的RPA技术更简单化，更适用于样品的现场检测，尤其是在放牧场、种植基地、基层兽医站、养殖场和偏远地区等，这在操作上降低了成本，节约时间，易于推广。同时该检测方法在保证高灵敏、高特异性的同时，操作简单、耗时短，在常温(32-42℃)下5-10min内对靶DNA进行扩增，可实现快速可视化现场检测这一目的，使得在非实验室条件下进行核酸扩增检测成为现实，适用于兽医、食品安全、生物防御、农业等领域的快速诊断，适用于仪器设备较为简陋的地方，适合大范围推广应用。

本发明提供的直扩RPA现场可视化检测方法用于检测转基因成分时检测限为模板浓度0.1％，因此，使用本发明方法检测食品时，如果扩增产物显色为绿色，则该食品中含有转基因成分。

本发明设计的用于检测转基因玉米TC1507的RPA特异性引物，包括外引物F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；内引物R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC。该引物特异性强，与其他转基因作物、非转基因作物都无交叉反应，不会产生交叉感染，灵敏度高，可在模板浓度为0.1％和0.01ng/μL时扩增，非常适用用于RPA检测转基因玉米TC1507。

本发明设计的用于检测金黄色葡萄球菌的RPA特异性引物包括：外引物F：ATGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；内引物R：CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。该引物特异性强，与其他病原微生物都无交叉反应，不会产生交叉感染，灵敏度高，可在模板浓度的检测限为10¹cfu/ml时扩增，非常适用用于RPA检测食源性病原微生物。

本发明提供的RPA检测方法特异性好，灵敏度高，例如选用两种典型的实例进行了特异性和灵敏度检测，具体是：在对转基因玉米TC1507的诊断中，可在转基因成分质量为0.1％和基因组浓度为0.01ng/μL下进行扩增；对食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的诊断中，检测限约为10¹cfu/ml。因此，本发明所述直扩RPA现场可视化检测方法具有普适性，可应用于来源于动物、植物、微生物的所有基因检测，并具有反应条件简单、操作简便快速、灵敏度高、结果判定方便、准确等优点。

附图说明

图1为本发明实施例2中RPA引物筛选电泳结果示意图。

图2为本发明实施例3中RPA可视化结果示意图。

图3为本发明实施例3中RPA电泳结果示意图。

图4为本发明实施例4中不同含量的基因组DNA进行RPA灵敏度检测的电泳结果示意图。

图5为本发明实施例4中不同含量的基因组DNA进行RPA灵敏度检测的可视化结果示意图。

图6为本发明实施例4中不同含量的基因组DNA进行PCR灵敏度检测的电泳结果示意图。

图7为本发明实施例4中不同浓度的基因组DNA进行RPA灵敏度检测的电泳结果示意图。

图8为本发明实施例4中不同浓度的基因组DNA进行RPA灵敏度检测的可视化结果示意图。

图9为本发明实施例4中不同浓度的基因组DNA进行PCR灵敏度检测的电泳结果示意图。

图10为本发明实施例5中RPA特异性电泳结果示意图。

图11为本发明实施例5中RPA特异性可视化结果示意图。

图12为本发明实施例6中模拟样品检测RPA灵敏度电泳结果示意图。

图13为本发明实施例6中模拟样品检测RPA灵敏度可视化示意图。

图14为本发明实施例8中RPA可视化结果示意图

图15为本发明实施例8中RPA电泳结果示意图

图16为本发明实施例9中RPA灵敏度电泳结果示意图。

图17为本发明实施例9中RPA灵敏度可视化结果示意图。

图18为本发明实施例9中RPA特异性电泳结果示意图。

图19为本发明实施例9中RPA特异性可视化结果示意图。

图20为本发明实施例9中模拟样品检测RPA灵敏度电泳结果示意图。

图21为本发明实施例9中模拟样品检测RPA灵敏度可视化结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例(一)

实施例1用于检测转基因玉米TC1507的RPA引物组的获得

根据GMDD(GMO Detection method Database)中找到转基因玉米TC1507的保守序列进行引物设计，由于RPA技术发展的不成熟，故而不像PCR或者LAMP那样有专门设计引物的软件，因此，RPA的引物设计需要人工手动设计，进一步在实验中验证，筛选出最合适的引物对。

在设计RPA引物时，需要遵循的如下原则：

1)引物长30-35bp，引物的长度影响重组酶的活性，引物过短会降低重组酶效率，长引物可以用来扩增，有试验证明45bp的引物也可以使用，但引物过长会增加引物二级结构形成的可能性，不一定会增加效率；

2)GC含量在40-60％，其中，引物的5’端的3-5个核苷酸中存在胞嘧啶有助于片段重组，应尽量避免聚鸟嘌呤，3’末端的3个核苷酸中存在鸟嘌呤和胞嘧啶更有助于聚合酶的结合稳定性，提高引物扩增性能；

3)应当尽量避免形成二级结构：引物-探针互作、引物二聚体、发夹结构等；

4)应避免出现长串的重复序列。设计探针应当注意：避免形成引物-探针互作，特别是标记引物与探针发生反应会造成结果的假阳性。然而，长引物和长探针的设计要求必然会增加引物、探针设计的难度，相对于PCR、LAMP来说，更易形成引物-引物、引物-探针互作。

TC1507保守序列的具体序列如下：

1：GAAGGAGTCA AACCACTCCT CCGAGGCCTC GGGGGCTACA CCCGGCGGGT；

51：GCGCTCGCGC GCACCCACCG GAACAAAATG TAACCGAGAA AGGTCGGTCC

101：CCTTGCAAAA AAAGTGCGAC AAAAGCCTCC AAGCGAGTAT TAACACTCAC；

151：TTTGAGGCTC GGGGGCTACT GTCGGGGACC ATAATTAGGG GTACCCCCAA；

201：GACTCCTAAT CTCAGCTGGT AACCCCCATC AGCACAAAGC TGCAAAGGCC；

251：TGATGGGTGC GATTAAGTCA AGGCTCGGTC CACTCAAGGG ACACGATCTC；

301：GCCTCGCCCG AGCCCAGCCT CGGGCAAGGG CGGCCGACCC CGAGGATTCA；

351：CGTCTCGCCC GAGGGCCCCC TCAAGCGACG GGCACACCTT CGGCTCGCCC；

401：GAGGCCCATT CTTCGCCGAG AAGCAACCTT GGCCAGATCG CCACACCGAC；

451：CGACCGTATC GCAGGAGCAT TTAATGCGAG GATCGCCTGA CACCTTATCC。

设计的转基因玉米TC1507特异性引物组序列如下：

T6-F AAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATTA；

T6-R GACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC。

T9-F AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

T9-R ACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGCTT。

T10-F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

T10-R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC。

实施例2RPA引物筛选

本实施例将设计的三对TC1507的引物，按照Twist DXLiquid BasicKit的说明书进行实验，并筛选出一对扩增出较好的目的条带的引物组。

配制RPA反应体系：ddH₂O 0.2μL，浓度10μM的引物F/R 2.4μL，2×ReactionBuffer 25μL，浓度10mM的dNTPs 9μL，10×Basic E-mix 5μL，20×Core Reaction Mix 2.5μL和浓度280mM的MgOAc 2.5μL，提取的基因组DNA 1μL。

RPA反应程序为：37℃，20min。

RPA结果采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测，T6、T9和T10目的片段长度分别为158bp，159bp，161bp。检测结果如图1所示，T6，T9和T10分别是转基因玉米TC1507的不同引物的样品，N6、N9和N10分别是转基因玉米TC1507的不同引物的阴性对照。图1表明，T10的目的条带和阴性对照效果较好，故筛选出来TC1507的特异性引物组为T10。

实施例3

1)使用DNA提取试剂盒(上海博满生物科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取转基因玉米TC1507基因组DNA。

2)配制RPA反应体系

设置阴性对照(ddH₂O)体系，以包含转基因玉米TC1507目的序列的基因组为阳性，配制RPA反应体系，设置阴性对照以证明反应体系未被其他基因组污染，达到辨别阳性样品的目的，验证测定结果的正确性。

为防止实验出现假阳性结果，配制RPA反应体系和对照体系时，进行分区操作。

配制反应体系时，不添加模板，先将外引物F、内引物R、2×Reaction Buffer、dNTPs，10×Basic E-mix配制好并混匀，再在管盖上加入20×Core Reaction Mix，混匀并分装分成两组，分别加入阴性对照(ddH₂O)和待测样品(TC1507)基因组DNA，加入阴性对照的成为阴性对照体系，加入待测样品(TC1507)基因组DNA的成为反应体系，再分别在两组的管盖上加入MgOAc，将各体系的混合物涡旋混匀、瞬离，放入PCR仪中37℃保温5min。

50μL的RPA反应体系中包括：ddH₂O 3.4μL，浓度10μM的引物T10F/R各1.8μL，2×Reaction Buffer 25μL，浓度10mM的dNTPs 7μL，10×Basic E-mix 5μL，20×CoreReaction Mix 2.5μL和浓度280mM的MgOAc 2.5μL，提取的基因组DNA 1μL。

3)进行RPA扩增反应

配制好反应体系后进行RPA扩增反应，反应程序为：37℃5min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)RPA扩增反应结束后，直接向扩增产物中加入SYBR Green I染料(50×)3μL，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有转基因玉米TC1507基因组DNA；显色为橘色的样品为阴性，不含转基因玉米TC1507基因组DNA，结果参见图2，其中T为转基因玉米TC1507，N为阴性对照。图2中，T显示绿色，N显示橙色。

或者将RPA产物用AXYGEN纯化试剂盒进行纯化，取纯化后的产物5μL在Goldview染色的2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像仪器的紫外光下显影观察，出现目的条带的样品为阳性，含有转基因玉米TC1507基因组DNA；无目的条带出现的样品为阴性，不含转基因玉米TC1507基因组DNA，结果参见图3，其中T为转基因玉米TC1507，N为阴性对照。由图3可知，样品T显示目的条带161bp。

由图2-3可以看出，电泳结果和显色结果的阴性对照(N)均表现为阴性结果，检测样品(T)均表现为阳性结果，可见，本实施例提供的RPA可视化快速检测结果与电泳结果一致。因此，本发明提供的引物、RPA反应体系、反应时间均可用于检测转基因玉米TC1507。

实施例4灵敏度验证

本实施例将提取的转基因玉米TC1507(转基因含量为10％)稀释到5％，1％，0.5％，0.1％，0.01％，分别进行RPA和PCR检测方法的灵敏度进行测试。

将提取的转基因玉米TC1507进行浓度测定，把浓度调整到5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，分别进行RPA和PCR检测方法的灵敏度进行测试。

RPA反应体系：ddH₂O 3.4μL，浓度10μM的外引物T10F、内引物T10R各1.8μL，2×Reaction Buffer 25μL，浓度10mM的dNTPs 7μL，10×Basic E-mix 5μL，20×CoreReaction Mix 2.5μL和浓度280mM的MgOAc 2.5μL，基因组DNA 1μL。RPA反应程序为：37℃，5min。

PCR反应体系：ddH₂O 17μL，浓度2.5mM的1×dNTPs 2.0μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，浓度10μM的外引物F 1.0μL，浓度10μM的内引物R 1.0μL，提取的TC1507的DNA 1μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL。PCR反应程序为：95℃预变性10min，进入PCR反应循环：95℃变性60s，87℃退火40s，72℃延伸35s，共进行35个循环，72℃总延伸7min。

RPA结果判定方法参见实施例2，电泳结果和显色结果分别如图4、图5，图7、图8所示，PCR结果采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测，目的片段长为161bp，检测结果如图6、图9所示。

其中，图4-图6中模板含量分别为5％，1％，0.5％，0.1％，0.01％，即1为5％的TC1507基因组DNA，2为1％的TC1507基因组DNA，3为0.5％的TC1507基因组DNA，4为0.1％的TC1507基因组DNA，5为0.01％的TC1507基因组DNA，N为阴性对照。图6中，1-4均显示绿色，5及阴性对照(N)显示橙色。

图7-图9模板浓度分别为5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，即1为5ng/μL浓度的TC1507基因组DNA，2为1ng/μL浓度的TC1507基因组DNA，3为0.5ng/μL浓度的TC1507基因组DNA，4为0.1ng/μL浓度的TC1507基因组DNA，5为0.01ng/μL浓度的TC1507基因组DNA，6为0.001ng/μL浓度的TC1507基因组DNA，N为阴性对照。图11中，1-5均显示绿色，6及阴性对照(N)显示橙色。

由图4、图5结果表明：本发明的RPA检测限是0.1％，由图6结果表明：PCR的检测限是0.1％。

由图7、图8结果表明：本发明的RPA检测限是0.01ng/μL，图9结果表明：PCR的检测限是0.01ng/μL。

由此可知，本发明提供的RPA检测方法和PCR灵敏度基本相同，同时可以看出，转基因TC1507的RPA可视化快速检测方法与电泳结果一致。

实施例5特异性验证

本实施例为验证筛选出来的转基因玉米TC1507引物T10的特异性，进行的RPA扩增反应。模板分别为转基因玉米TC1507，BT176，GA21，非转基因玉米，大豆，油菜籽，小麦和棉花。

本实施例RPA反应体系为：ddH₂O 3.4μL，浓度10μM的引物T10F/R各1.8μL，2×Reaction Buffer 25μL，浓度10mM的dNTPs 7μL，10×Basic E-mix 5μL，20×CoreReaction Mix 2.5μL和浓度280mM的MgOAc 2.5μL，转基因玉米TC1507基因组DNA 1μL。RPA反应程序为：37℃，5min。

RPA结果判定方法参见实施例2，电泳结果参见图10和显色结果参见图11，其中，1为转基因玉米TC1507基因组DNA，2为转基因玉米BT176基因组DNA，3为转基因玉米GA21基因组DNA，4为非转基因玉米基因组DNA，5为大豆基因组DNA，6为油菜籽基因组DNA，7为小麦基因组DNA，8为棉花基因组DNA，N为阴性对照基因组DNA。图11中，1显示绿色，2-8及阴性对照(N)显示橙色。

由图10-11结果表明：转基因玉米TC1507表现为阳性结果，阴性对照(N)和其他样品均表现为阴性结果。因此，本发明转基因玉米TC1507的RPA可视化快速检测的特异性好，不与其他作物产生交叉感染。同时说明加入荧光染料后，可视化结果与电泳结果一致。

实施例6模拟样品检测

本实施例为验证本发明的实际应用性，实验中人工配制6个模拟样品，样品1-6转基因玉米TC1507含转基因成分分别是10％，5％，1％，0.5％，0.1％，0.01％。其中，样品1、2的制备是通过将转基因玉米TC1507与转基因玉米BT176、NK603相混合。样品3、4的制备是通过将转基因玉米TC1507与非转基因玉米相混合。样品5、6的制备是通过将转基因玉米TC1507与非转基因大豆、水稻相混合。

模拟样品1-6均应用粗提试剂(lysis buffer(0.5M NaOH，10mM Na₂EDTA))抽提基因组DNA。具体粗提步骤如下：

1)称量样品粉末0.02g；

2)加入粗提试剂lysis buffer 200μL；

3)剧烈混匀5s，室温放置1min；

4)加无菌水对步骤3)的液体进行5倍稀释，即可作为待测样品模板使用。

本实施例RPA反应体系为：ddH₂O 3.4μL，浓度10uM的引物T10外引物F、内引物R各1.8μL，2×Reaction Buffer 25μL，浓度10mM的dNTPs 7μL，10×Basic E-mix 5μL，20×Core Reaction Mix 2.5μL和浓度280mM的MgOAc 2.5μL，模板DNA 1μL。RPA反应程序为：37℃，5min。

RPA结果判定方法参见实施例2，电泳结果参见图12和显色结果参见图13，其中，1为样品1，2为样品2，3为样品3，4为样品4，5为样品5，6为样品6，N为阴性对照。

由图12可知，1-5均显示目的条带161bp。

图13中，1-5显示绿色，6显示橙色，N显示橙色。

图12-13结果表明：RPA的检测限为0.1％，与实施例4的灵敏度检测限一致，也说明，TC1507的RPA可视化快速检测与电泳结果一致。

实施例(二)

本实施例将本发明的RPA检测方法应用于食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的检测中。

实施例7用于检测食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的RPA引物组的获得

从NCBI中找到金黄色葡萄球菌(登录号：JQ278707.1)的特异性序列，使用软件Primer Premier 5.0，根据RPA引物设计原则进行引物设计，并对其进行合成，完成一系列的引物筛选。

金黄色葡萄球菌的特异性序列如下：

1：AAATCCAGCA CAACAGGAAA CGACACAATCAGCATCAACAAATGCAACTA；

51 CAGAAGAAA CACCGGTAACT GGTGAAGTTACTACTACGGCAACGAATCAA；

101 GCTAATACA CCGGCAACAAC

TCAATCAAGCAATACAAATGCGGAAAAATC；

151 AGTGAATCA AACAAGTAATG AAACGACTTCTAATGATACTAATACAGTAT；

201 CATCTGTAAA TTCACCTCAAA ATTCTACAAATGCGGAAAATGTTTCAACA；

251 ACGCAAGATA CTTCAACTGAA GCAAAACCTTCAAACAATGAATCAGCTCC；

301 ACAGAGTACA GATGCAAGTAA TAAAGATGTAGTTAATCAAGCGGTTAATA；

351 CAAGTGCGCC TAGAATGAGAG CATTTAGTTTAGCGGCTGTAGCTGCAGAT；

401 GCACCGGCTG CTGGCACAGA TATTACGAATCAGTTGACGAATGTGACAGT；

451 TGGTATTGAC TCTGGAGATA CAGTTTATCCGCACCAAGCAGGCTATGTCA；

501 AACTGAATTA TGGGTTCTCA GTACCCAATTCTGCGGTTCAAGGTGACACA；

551 TTTAAAATAA CTGTACCTAA AGAATTAAACTTAAATGGTGTAACCTCAAC；

601 TGCTAAAGTG CCACCAATTA TGGCCGGAGAT。

设计金黄色葡萄球菌的引物序列如下：

S1-F CAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTAATAAAG；

S1-R CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。

S3-F TGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；

S3-R TCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。

S4-F AGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTAATAAAG；

S4-R TCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。

S7-F：ATGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；

S7-R：CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。

最终筛选出的引物为引物组S7。

实施例8

1)粗提基因组DNA

a.取金黄色葡萄球菌菌液20μL；

b.加入粗提试剂lysis buffer(0.5M NaOH，10mM Na₂EDTA)180μL，相当于对金黄色葡萄球菌菌液进行10倍稀释；

c.剧烈混匀5s，室温放置1min。

2)配制RPA反应体系

设置阴性对照(ddH₂O)体系，以包含金黄色葡萄球菌目的序列的基因组为阳性，配制RPA反应体系，设置阴性对照以证明反应体系未被其他基因组污染，达到辨别阳性样品的目的，验证测定结果的正确性。

配制反应体系，ddH₂O 3.4μL，浓度10uM的引物S7F/R各1.8μL，2×ReactionBuffer 25μL，浓度10mM的dNTPs 7μL，10×Basic E-mix 5μL，20×Core Reaction Mix 2.5μL和浓度280mM的MgOAc 2.5μL，基因组DNA 1μL。

RPA反应程序为：37℃，5min。

RPA结果判定方法参见实施例3，显色结果参见图14和电泳结果参见图15，其中S为黄色葡萄球菌，N为阴性对照。

图14中，S显示绿色，N显示橙色。由图15可知，样品S显示目的条带180bp。

由图14-15可以看出：电泳结果和显色结果的阴性对照(N)均表现为阴性结果，检测样品(S)均表现为阳性结果，可见，本实施例提供的RPA可视化快速检测结果与电泳结果一致。因此，本发明提供的引物、RPA反应体系、反应时间均可用于检测金黄色葡萄球菌。

实施例9灵敏度和特异性验证，并且对其进行模拟现场检测。

本实施例使用实施例8的体系和程序，对其进行特异性和灵敏度验证，并且对其进行模拟现场检测。RPA结果判定方法参见实施例3。

1)在验证灵敏度实验中，金黄色葡萄球菌RPA实验电泳结果参见图16，显色结果图参见17，其中，金黄色葡萄球菌模板浓度分别为10⁵cfu/ml，10⁴cfu/ml，10³cfu/ml，10²cfu/ml，10¹cfu/ml，10⁰cfu/ml，即1为10⁵cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，2为10⁴cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，3为10³cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，4为10²cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，5为10¹cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，6为10⁰cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，N为阴性对照。其中，模板是用粗提试剂对金黄色葡萄球菌进行粗提，并稀释10倍制备得到。

图16中1-5均扩增出目的条带180bp。图17中1--5均显示绿色，6、N显示橙色。

图16-17表明，金黄色葡萄球菌的检测限都是10¹cfu/ml，并且其RPA可视化快速检测与电泳结果一致。

2)在验证特异性实验中，金黄色葡萄球菌RPA实验电泳结果参见图18，显色结果参见图19。其中，模板分别是金黄色葡萄球菌，变形杆菌ATCC12453，克雷伯杆菌ATCC46114，福氏志贺氏菌CMCC51571，铜绿假单胞菌IQCC12625，腊样芽孢杆菌ATCC1220，炎链球菌ATCC27336，沙门氏菌ATCC14028，N为阴性对照。即1为金黄色葡萄球菌，2为变形杆菌ATCC12453，3为克雷伯杆菌ATCC46114，4为福氏志贺氏菌CMCC51571，5为铜绿假单胞菌IQCC12625，6为腊样芽孢杆菌ATCC1220，7为炎链球菌ATCC27336，8为沙门氏菌ATCC14028，N为阴性对照。其中，模板是用粗提试剂对样品进行粗提，并稀释10倍制备得到。

图18显示样品1扩增出目的条带180bp，样品2-8均没有显示目的条带。图19中样品1显示绿色，其他样品均显示橙色。

图18-19表明：食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的引物组S7的特异性特别好，与其他病原微生物无交叉反应，并且其RPA可视化快速检测与电泳结果一致。

3)在验证模拟现场检测实验中，通过验证人工污染猪肉的检出限来进行。

取经国家标准检测证实不含有食源性致病菌(金黄色葡萄球菌)的猪肉25克，切碎后加入225ml灭菌的生理盐水匀浆，制备猪肉匀浆液。

将金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基中，在培养箱中37℃，220rpm振荡过夜培养，采用分光光度计进行测定，测出在波长为660时的OD值，并换算成菌落数。

取致病菌菌液1ml加入到9ml猪肉匀浆液中，混合后作为污染食品样品原样，用匀浆液作为稀释液进行10倍倍比稀释(用匀浆液进行稀释)，取每个稀释度菌液20μL用粗提试剂(180μL)lysis buffer(0.5M NaOH，10mM Na₂EDTA)提取基因组DNA，进行RPA扩增确定金黄色葡萄球菌在猪肉中的检出限。

金黄色葡萄球菌RPA实验电泳结果参见图20，显色结果参见图21，其中，模板浓度分别为10³cfu/ml，10²cfu/ml，10¹cfu/ml，10⁰cfu/ml，即1为10³cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，2为10²cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，3为10¹cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，4为10⁰cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA，N为阴性对照。

图20显示1-3均扩增出目的条带180bp。图21中1-3均显示绿色，4、N显示橙色。

图20-21表明：食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的灵敏度很高，能检测出浓度为10¹cfu/ml的金黄色葡萄球菌，说明本发明RPA方法的重复性也很好。

Claims

1.一种直扩RPA现场可视化检测方法，包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组DNA；

2)针对目的基因设计用于RPA检测的特异性引物，所述特异性引物包括外引物F和内引物R；

3)将步骤1)粗提的基因组DNA作为模板，步骤2)设计的RPA特异性引物加入到RPA反应体系中，进行RPA扩增反应；

所述RPA反应体系包含外引物F、内引物R、dNTPs、MgOAc、模板DNA，成分的终浓度为：外引物F 0.12-0.48μM，内引物R 0.12-0.48μM，dNTPs 1.4-1.8mM，MgOAc 8.4-14mM，模板DNA1～2μL；RPA扩增反应程序为：32-42℃，5-10min；RPA扩增反应程序中反应温度优选36-42℃；

4)鉴定扩增结果

2.根据权利要求1所述的直扩RPA现场可视化检测方法，其特征在于，步骤1)中，粗提待测样品基因组DNA的方法为：向待测样品中加入粗提试剂lysis buffer对待测样品进行5～10倍稀释，混匀，室温放置1min以上，即可作为模板DNA使用；

所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为48～52：1。

3.一种用于直扩RPA方法检测转基因玉米TC1507的RPA特异性引物，包括外引物F和内引物R，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

内引物R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC。

4.一种检测转基因玉米TC1507的直扩RPA现场可视化检测方法，包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组DNA；

2)设计RPA特异性引物

RPA特异性引物包括外引物F和内引物R，具体序列如下：

外引物F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

内引物R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC；

3)RPA扩增反应；

所述RPA反应体系中成分的终浓度为：外引物F 0.12-0.48μM，内引物R 0.12-0.48μM，dNTPs 1.4-1.8mM，MgOAc 8.4-14mM，模板DNA 1～2μL；RPA扩增反应程序为：32-42℃，5-10min；RPA扩增反应程序中反应温度优选36-42℃；

4)鉴定扩增结果

5.根据权利要求4所述的直扩RPA现场可视化检测方法，其特征在于，步骤1)粗提待测样品基因组DNA的方法为：向待测样品中加入粗提试剂lysis buffer，混匀，室温放置1min以上，即可作为模板DNA使用；

待测样品与粗提试剂lysis buffer的质量体积比为：0.5～1：1×10⁴，单位：g/μL；

所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为：48～52：1。

6.一种用于直扩RPA方法检测金黄色葡萄球菌的RPA特异性引物，包括外引物F和内引物R，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物F：ATGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；

内引物R：CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。

7.一种检测金黄色葡萄球菌的直扩RPA现场可视化检测方法，包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组DNA

2)设计RPA特异性引物

RPA特异性引物包括外引物F和内引物R，具体序列如下：

外引物F：ATGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；

内引物R：CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA；

3)RPA扩增反应

4)鉴定扩增结果

8.根据权利要求7所述的直扩RPA现场可视化检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述粗提待测样品基因组DNA包括如下步骤：将待测样品切碎后加灭菌的生理盐水得到浆液，向浆液中加入粗提试剂，混匀，室温放置1min以上，即可作为模板DNA使用；其中，待测样品与生理盐水的质量体积比为1：1～9，单位：g/μL；浆液与粗提试剂的体积比为：1：4～9；所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为：48～52：1。

9.根据权利要求1或4或7所述的直扩RPA现场可视化检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述RPA反应体系还包含2×Reaction Buffer、10×Basic E-mix、20×Core ReactionMix。

10.一种直扩RPA现场可视化检测试剂盒，包含权利要求1或4或7所述的RPA反应体系，所述RPA反应体系中成分的终浓度为：正向引物F 0.12-0.48μM，反向引物R 0.12-0.48μM，dNTPs 1.4-1.8mM，MgOAc 8.4-14mM。

11.根据权利要求10所述的直扩RPA现场可视化检测试剂盒，其特征在于，所述RPA反应体系还包含2×Reaction Buffer、10×Basic E-mix、20×Core Reaction Mix。