CN107723346A - 一种用于转基因玉米多重检测的微滴pcr偶联dgge分析方法 - Google Patents

一种用于转基因玉米多重检测的微滴pcr偶联dgge分析方法 Download PDF

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Abstract

一种用于转基因玉米多重检测的微滴PCR偶联DGGE分析方法，首先，针对待测样品分别设计PCR特异性引物对，进行微滴PCR扩增，扩增产物经纯化后进行DGGE电泳，并进行SYBRGreen染色，在紫外光下显影观察，来检测转基因玉米基因组的多重DNA分子。该方法可以实现高通量分析多个DNA目标核酸分子，且灵敏度高，内标基因的稳定性也很好。因此，本发明利用微滴PCR偶联DGGE技术实现了生物基因定性、高通量检测。

Description

一种用于转基因玉米多重检测的微滴PCR偶联DGGE分析方法
技术领域
本发明属于核酸分子检测技术领域，具体涉及一种用于转基因玉米多重检测的微滴聚合酶链式反应(PCR)偶联变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析方法。
背景技术
微滴PCR(microdroplet-based PCR)就是PCR技术和乳化技术相结合的最先进的PCR技术，是传统PCR技术的升级换代技术，即将油相和PCR反应体系的水相混合在一起，利用“油包水”的乳化技术将PCR反应体系分隔成109个独立的微滴，每个微滴可以含有一个模板和一对引物，然后单独进行反应，提高了目标扩增的通量，同时减少了宝贵的试剂和样品的消耗，避免了普通多重PCR不同引物和模板间的相互干扰，产生扩增效率的不一致和非特异性产物的出现。
变性梯度凝胶电泳又称DGGE，该方法在20世纪80年代初由勒曼等发明，起初主要用于医学上。DGGE技术是在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入变性剂(尿素和去离子甲酰胺)梯度，使得长度相同但序列组成成分不同的DNA片段分离，形成易于观察的清晰条带。每一段DNA都是由特定序列的碱基组成，这种特定序列组成决定了双链DNA的解链行为和解链区域，所以，不同的双链DNA在变形梯度凝胶中当达到其解链的最低变性梯度时，DNA双链开始解链，部分解链的DNA在凝胶中的迁移速率会大大降低，进而和其他的DNA序列分离开来。所以，具有相同长度的DNA片段因其序列组成不同，使其在变性梯度凝胶电泳中停留在不同的位置上，从而将那些在普通的凝胶中无法分离的DNA片段分离开来。
在实际的实验操作中，研究者往往在设计好的引物的5’端加上一段约含有30-50bp的GC碱基(俗称“GC夹子”)。这是因为双链DNA分子在变性梯度凝胶电泳中完全分离成单链后会在胶中继续迁移，并且迁移速率比双链DNA更快，为了防止已经完全解链成单链的双链DNA分子经过最高凝胶梯度而迁移出凝胶的外面，所以在引物的5’添加了“GC夹子”，因为GC的Tm值很高，避免了双链DNA在凝胶中完全解链，使得不同的DNA片段停留在凝胶的不同位置。
虽然目前还没有确切的科学证据证明转基因农产品对人类有严重危害，但是其危害具有“可能性低、后果严重”的特点，所以我们要尽快建立完善的检测和评价技术，以对转基因农产品的安全性问题进行深入研究，防患于未然。
目前，将微滴PCR与DGGE技术偶联起来进行转基因产品多重检测的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于转基因玉米多重检测的微滴PCR偶联DGGE分析方法，进行转基因玉米定性、高通量多重检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种用于转基因玉米定性、高通量多重检测的引物组，该引物组包括转基因玉米BT176、TC1507和MON863的特异性引物对，具体引物序列如下：
玉米品系 引物序列(5’to3’)
BT176：正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACT；
反向引物：TGGGCGTGGTATCGACTTTATAG；
MON863：正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCTTGGTTCGGAGAGCACTTGTTGG；
反向引物：ACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAA；
TC1507：正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCCACCCACCGGAACAAAATGTAAC；
反向引物：GCCTTGACTTAATCGCACCCATC。
本发明还提供一种用于转基因玉米多重检测的微滴PCR偶联DGGE分析方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)制备微滴
水油乳化剂制备方法：25℃下，取微滴PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到微滴PCR油相中，混合后形成水油乳化剂，每微升的水油乳化剂包含3×106到1×107个微滴，微滴的直径为1-8μM；
所述微滴PCR油相组分及各组分终浓度为：Span80 4.5％(v/v)、Tween80 0.4％(v/v)、Triton X-100 0.05％(v/v)矿物油95.5％(v/v)；
所述微滴PCR水相组分及各组分终浓度为：正向引物300-500nM，反向引物300-500nM，10×PCR Buffer，BSA 8-12g/l，dNTPs 0.1-0.3mM，TaKaRa Taq 4-6U，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)；
3)微滴PCR扩增反应
将水油乳化剂体系分装到PCR管中进行微滴PCR扩增反应，反应程序为：94℃预变性5min，进入PCR反应循环：94℃变性30s，61-65℃退火30-60s，72℃延伸30s，共进行30个循环，72℃总延伸7min；
4)微滴PCR产物分离及纯化
将微滴PCR扩增完成后的反应液收集到离心管中，离心；离心后油相位于离心管的上层，水相在离心管的下层；收集下层的水相反应液，得到纯化后的微滴PCR产物；
5)DGGE检测微滴PCR产物
取纯化后的微滴PCR产物进行DGGE电泳，并进行SYBRGreen染色，在紫外光下显影观察；经DGGE电泳分析，在相应的片段位置，有目的条带显示的则为阳性，无目的条带显示则为阴性。
进一步，待测样品和微滴PCR水相中对应的引物对序列如下所示：
玉米品系引物序列(5’to3’)
BT176：正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACT；
反向引物：TGGGCGTGGTATCGACTTTATAG；
MON863：正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCTTGGTTCGGAGAGCACTTGTTGG；
反向引物：ACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAA；
TC1507：正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCCACCCACCGGAACAAAATGTAAC；
反向引物：GCCTTGACTTAATCGCACCCATC。
进一步，所述水油乳化剂制备方法中微滴PCR水相与微滴PCR油相的体积比为1:2，例如25℃下，取200微升体积份微滴PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到400微升体积份微滴PCR油相中混合形成水油乳化剂。
优选的，步骤2)中，所述微滴PCR水相组分及各组分终浓度为正向引物350-450nM，反向引物350-450nM，10×PCR Buffer，BSA 10-12g/l，dNTPs 0.2-0.3mM，TaKaRa Taq5-6U，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)。
本发明所述微滴PCR水相中，10×buffer的添加遵循本领域中的常规添加原则，通常为反应总体积的十分之一。
本发明在传统聚合酶链式反应的基础上加以改进和创新，建立了常规引物微滴聚合酶链式反应(PCR)偶联变性梯度凝胶电泳(DGGE)的转基因玉米及其加工制品的定性、多重检测方法。该方法可以实现高通量分析多个DNA目标核酸分子，且灵敏度高，内标基因的稳定性也很好。由此可见，利用微滴PCR偶联DGGE技术可实现生物基因定性、高通量检测。
本发明设计的转基因玉米BT176、TC1507、MON863品系特异性引物对，扩增片段长短相近，在250bp左右，且引物退火的温度也相近，且上述三组特异性引物对的特异性很好，不与其他作物发生交叉反应。
本发明根据三种转基因玉米BT176、TC1507和MON863的特异性引物对计算微滴PCR反应退火温度，退火温度过高或过低都会对酶的活性产生较大影响，本发明对转基因玉米BT176、TC1507和MON863的微滴PCR反应温度进行了优化，确定合适的退火温度范围为61-65℃，在该温度范围内，微滴PCR反应效率和产物产量较高。
本发明利用微滴PCR偶联DGGE的技术对转基因玉米BT176、TC1507和MON863进行定性、高通量检测。这三种转基因玉米检测时，均能在相应的位置形成单一条带：微滴PCR产物进行DGGE检测后，在180bp位置有目的条带显示，则为转基因BT176；在201bp位置有目的条带显示，则为转基因TC1507；在234bp位置有目的条带显示，则为转基因MON863；且灵敏度高，混合物中各个转基因玉米的检测限为0.5％。由此可见，利用微滴PCR偶联DGGE技术可实现对转基因玉米BT176、TC1507和MON863的定性、高通量检测。
与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：
微滴PCR虽然能提高反应的特异性和目标扩增的通量，但检测的通量较少，达不到高通量检测的效果。DGGE方法虽然检测通量高，其多重PCR的扩增存在非特异性扩增，从而达不到高通量单拷贝检测的效果。本发明将这两种技术结合起来，更好的发挥微滴PCR与DGGE的优点，从而实现多重高通量检测。
本发明利用微滴PCR偶联DGGE的方法一次反应可以实现多个DNA目标核酸分子分析，是一种高通量检测方法。三种转基因玉米BT176、TC1507和MON863混合检测时均在相应的位置形成单一条带，因此该微滴PCR能高通量分析多个DNA目标核酸分子。
本发明中微滴PCR检测方法特异性好，灵敏度高，在检测三种转基因玉米BT176、TC1507和MON863混合物中，转基因玉米BT176、TC1507和MON863的检测限均为0.5％，而且形成了梯度。
附图说明
图1为本发明实施例3转基因玉米BT176、TC1507、MON863引物特异性示意图。
图2为本发明实施例4转基因玉米BT176、TC1507和MON863混合物灵敏度示意图。
图3为本发明实施例5转基因玉米BT176内标基因IVR稳定性示意图。
图4为本发明实施例5转基因玉米TC1507内标基因IVR稳定性示意图。
图5为本发明实施例5转基因玉米MON863内标基因IVR稳定性示意图。
图6为本发明实施例6转基因玉米BT176、TC1507和MON863的模拟样品检测示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1微滴PCR偶联DGGE技术的引物组的获得
根据GMDD数据库中所获得转基因玉米BT176、TC1507、MON863的旁临序列，使用引物设计软件primer 5.0进行它们各自的品系特异性引物的设计。设计引物使得扩增片段长短相近，在250bp左右，且引物退火的温度也需要相近。另外玉米内源基因IVR的引物从文献中获得。
具体序列如表1所示：
表1
实施例2微滴PCR偶联DGGE技术的检测方法
1)使用上海出入境检验检疫局联合上海市农业科学院生物技术所研制的植物基因组DNA抽提试剂盒，提取待测样品DNA；
2)配制微滴PCR反应体系：
a)微滴PCR油相制备
在25℃条件下按照表2中的试剂来制备油-表面活性剂混合物(微滴PCR油相)。
表2油-表面活性剂混合物成分
试剂 终浓度(v/v)
Span 80 4.5％
Tween 80 0.4％
Triton X-100 0.05％
矿物油 95.5％
b)微滴PCR水相制备
以ddH2O为阴性对照，以包含三种转基因玉米(BT176，TC1507和MON863)质粒为阳性对照，配制微滴PCR反应体系即微滴PCR水相；
微滴PCR水相中各成分的终浓度为：正向引物300-500nM，反向引物300-500nM，10×PCR Buffer，BSA 8-12g/L，dNTPs 0.1-0.3mM，TaKaRa Taq4-6U，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)。
c)水油乳化剂配制
在25℃条件下，取出200μL微滴PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到400μL微滴PCR油相中，与此同时利用调速式磁力搅拌器进行混匀。加完之后，继续混合5分钟，形成均匀的水油乳化剂。
水油乳化剂包含大小不等的微滴，微滴的直径为1～8μM，每微升的水油乳化剂包含3×106到1×107个微滴。
3)微滴PCR扩增反应
配制好反应体系后进行微滴PCR扩增反应：经过乳化的600μL的水油乳化剂平均分配到12个PCR管中，另外取出50μL微滴PCR水相加入模板进行常规PCR作为非乳化对照。
微滴PCR反应程序为：94℃预变性5min，进入PCR反应循环：94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，72℃总延伸7min。
4)微滴PCR产物分离及纯化
将微滴PCR扩增完成后的反应液收集到一个1.5ml的离心管中。在13000rpm的条件下，离心5分钟。此时，油相位于离心管的上层，水相在离心管的下层。先吸出部分上层的油液，再小心的吸出下层的水相反应液，放到新的离心管中，4℃保存，得到纯化后的微滴PCR产物。
5)DGGE检测微滴PCR产物
取纯化后的PCR扩增产物进行DGGE电泳，并进行SYBRGreen染色，在凝胶成像仪器的紫外光下显影观察。
经DGGE电泳分析，Marker是以三种转基因玉米的阳性质粒为模板，引物为三种玉米的混合引物，进行基于DGGE的微滴PCR实验。在相应的片段位置，有目的条带显示的则为阳性，无目的条带显示则为阴性。
实施例3特异性验证
本实施例为验证三种转基因玉米BT176、TC1507和MON863对应引物的特异性。
分别配制BT176、TC1507和MON863玉米的微滴PCR反应体系，模板为BT176、MON863、TC1507、NK603、BT11、GA21、MON810、T25、野生型玉米、GM油菜、GM油菜的混合物。微滴PCR水相配制好进行微滴制备，分装到PCR管中放到PCR仪中按照上述微滴PCR扩增程序进行PCR。PCR完成后，收集水相PCR产物，按照实施例2步骤进行变性梯度凝胶电泳检测微滴PCR产物。
本实施例微滴PCR水相：浓度10μM的正向引物5.2μL，浓度10μM的反向引物5.2μL，10×PCR Buffer，浓度2.5mM的1×dNTPs 20.8μL，浓度100g/l的BSA 26μL，浓度2U/μL的TaKaRa Taq 2.6μL，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)，ddH2O补足至260μL。
微滴PCR反应程序和结果显示方法参见实施例2，采用DGGE技术分别对转基因玉米(BT176、TC1507和MON863)进行SYBRGreen显色检测，BT176、TC1507和MON863的目的片段大小在250bp左右，检测结果如图1所示。
图1中，Marker是以三种转基因玉米的阳性质粒为模板，引物为三种玉米的混合引物，为阳性对照；
1号样品的引物为三种转基因玉米(BT176、TC1507、MON863)的特异性引物的混合引物，不含模板，作为阴性对照；
2号样品的引物为Bt176的特异性引物，模板为Bt176的阳性对照质粒；
3号样品的引物为TC1507的特异性引物，模板为TC1507的阳性对照质粒；
4号样品的引物为MON863的特异性引物，模板为MON863的阳性对照质粒；
5号样品的引物为Bt176的特异性引物，模板为BT176、MON863、TC1507、NK603、BT11、GA21、MON810、T25、野生型玉米、GM油菜、GM大豆的混合物；
6号样品的引物为TC1507的特异性引物，模板为BT176、MON863、TC1507、NK603、BT11、GA21、MON810、T25、野生型玉米、GM油菜、GM大豆的混合物；
7号样品的引物为MON863的特异性引物，模板为BT176、MON863、TC1507、NK603、BT11、GA21、MON810、T25、野生型玉米、GM油菜、GM大豆的混合物。
由图1可知，转基因玉米BT176、TC1507、MON863和阳性对照质粒(BT176、TC1507、MON863)均在相应位置出现目的条带，显示为阳性结果，阴性对照(NTC)表现为阴性结果。因此，本发明三种转基因玉米没有与其他作物产生交叉反应，说明本发明设计的转基因玉米BT176、TC1507和MON863对应引物的特异性非常好。
实施例4灵敏度验证
本实施例将经测序验证过的三种转基因玉米BT176、TC1507和MON863，以不同质量浓度的样品(10.0％，5.0％，3.0％，1.0％，0.5％，0.1％，0.05％)提取得到的标准DNA样品进行微滴PCR扩增，对建立的DGGE检测方法的灵敏度进行测试。
微滴PCR反应体系(微滴PCR水相)：浓度10μM的正向引物5.2μL，浓度10μM的反向引物5.2μL，10×PCR Buffer，浓度2.5mM的1×dNTPs20.8μL，浓度100g/l的BSA 26μL，浓度2U/μL的TaKaRa Taq2.6μL，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)，ddH2O补足至260μL。
微滴PCR反应程序和结果显示方法参见实施例2，电泳结果见图2，Marker是以三种转基因玉米BT176、TC1507和MON863的阳性质粒为模板，引物为三种转基因玉米的混合引物；
样品1-样品9的引物均为三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863的特异性引物的混合引物；
1号样品不含模板，作为阴性对照；
2号样品的模板为BT176、TC1507、MON863的阳性对照质粒；
3号样品的模板为含有三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863各10％的混合样品(70％为非转基因玉米)提取得到的标准DNA样品；
4号样品的模板为含有三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863各5.0％(85％为非转基因玉米)提取得到的标准DNA样品；
5号样品的模板含有三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863各3.0％(91％为非转基因玉米)提取得到的标准DNA样品；
6号样品的模板为含有三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863各1.0％(97％为非转基因玉米)提取得到的标准DNA样品；
7号样品的模板为含有三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863各0.5％(98.5％为非转基因玉米)提取得到的标准DNA样品；
8号样品的模板为含有三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863各0.1％(99.7％为非转基因玉米)提取得到的标准DNA样品；
9号样品的模板为含有三种转基因玉米BT176、TC1507、MON863各0.05％(99.85％为非转基因玉米)提取得到的标准DNA样品。
由图2可知，2-7号都有相应的条带且形成了梯度，因此，混合物中转基因玉米BT176、TC1507、MON863的检测限均为0.5％，表明使用微滴PCR偶联DGGE技术的检测方法具有很好的灵敏度。
实施例5内标基因IVR稳定性验证
本实施例将经测序验证过的三种转基因玉米(BT176,TC1507和MON863)，以不同质量浓度的玉米样品(10.0％，5.0％，3.0％，1.0％，0.5％，0.1％，0.05％)提取得到的标准DNA样品进行微滴PCR扩增，对建立的检测方法的玉米内标基因IVR稳定性进行测试。
微滴PCR水相配制好进行微滴制备，分装到PCR管中放到PCR仪中按照实施例2中微滴PCR扩增程序进行PCR。PCR完成后，收集水相PCR产物，按照实施例2中步骤进行变性梯度凝胶电泳检测微滴PCR产物。
微滴PCR水相：浓度10μM的正向引物5.2μL，浓度10μM的反向引物5.2μL，10×PCRBuffer，浓度2.5mM的1×dNTPs 20.8μL，浓度100g/L的BSA 26μL，浓度2U/μL的TaKaRa Taq2.6μL，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)，ddH2O补足至260μL。
微滴PCR反应程序和结果显示方法参见实施例2，电泳结果见图3-图5。图3-图5分别是转基因玉米Bt176、TC1507、MON863的内标基因IVR的稳定性检测图，其中，Marker是以玉米内标基因IVR的阳性质粒为模板；1为阴性对照；2为阳性对照质粒；3-9样品中转基因玉米的含量分别为10.0％，5.0％，3.0％，1.0％，0.5％，0.1％，0.05％。
由图3-5可知，阴性对照和阳性对照质粒均显示为阴性结果，转基因玉米Bt176、TC1507或MON863含量为10.0％，5.0％，3.0％，1.0％，0.5％，0.1％，0.05％的转基因玉米均显示为阳性结果。这三种转基因玉米均在相同的位置形成亮度相同的单一条带，说明该内标基因的稳定性很好。由此可见，本发明可实现生物基因定性、多重检测。
实施例6模拟样品检测
本实施例为验证该发明的实际应用性，实验中人工配制5个模拟样品，各样品的组成见表3检测样品成分，其中，样品1、2、3的制备是通过将上述三种转基因玉米与非转基因玉米相混合。样品4、5的制备是通过将上述三种转基因玉米与非转基因大豆相混合。
表3单位：质量百分数
样品1 样品2 样品3 样品4 样品5
MON863 1.5％ 1.5％ 0.9％ 0.05％ 0.06％
TC1507 1.8％ 2.0％ 0.08％ 0.1％ 1.3％
Bt176 0.1％ 1.5％ 2.5％ 0％ 0.1％
对三种转基因玉米的模拟样品进行微滴PCR扩增，经变性梯度凝胶电泳分析，其他同实施例2。电泳结果见图6，Marker是以三种转基因玉米的阳性质粒为模板，引物为三种玉米的混合引物，进行基于DGGE的微滴PCR实验，1-5分别为表3中模拟样品1-5。
由图6可知，1号样品出现两条带；2号样品出现三条带；3号样品出现两条带；4号样品无条带出现；5号样品出现一条带；参考上述表格样品混合物中BT176、MON863、TC1507的含量，验证了本发明微滴PCR偶联DGGE技术的灵敏度为0.5％，同时也验证了三对特异性引物分别与对应检测样品的特异性，实现了定性、多重高通量检测。

Claims (5)

1.一种用于转基因玉米定性、高通量多重检测的引物组，该引物组包括转基因玉米BT176、TC1507和MON863的特异性引物对，具体引物序列如下：
玉米品系 引物序列(5’to3’)
BT176： 正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCGTG
GGTTTCTGGCAGCTGGACT；
反向引物：TGGGCGTGGTATCGACTTTATAG；
MON863： 正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCTTG
GTTCGGAGAGCACTTGTTGG；
反向引物：ACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAA；
TC1507： 正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCCAC
CCACCGGAACAAAATGTAAC；
反向引物：GCCTTGACTTAATCGCACCCATC。
2.一种用于转基因玉米多重检测的微滴PCR偶联DGGE分析方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)制备微滴
水油乳化剂制备：25℃下，取微滴PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到微滴PCR油相中，混合后形成水油乳化剂体系，每微升的水油乳化剂体系包含3×106到1×107个微滴，微滴的直径为1～8μm；
所述微滴PCR水相组分及各组分终浓度为：正向引物300-500nM，反向引物300-500nM，10×PCR Buffer，BSA 8-12g/l，dNTPs 0.1-0.3mM，TaKaRa Taq 4-6U，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)；
所述微滴PCR油相组分及各组分体积浓度为：Span80 4.5％、Tween80 0.4％、TritonX-100 0.05％、矿物油95.5％；
3)微滴PCR扩增反应
将水油乳化剂体系分装到PCR管中进行微滴PCR扩增反应，反应程序为：94℃预变性5min，进入PCR反应循环：94℃变性30s，61-65℃退火30-60s，72℃延伸30s，共进行30个循环，72℃总延伸7min；
4)微滴PCR产物分离及纯化
将微滴PCR扩增完成后的反应液收集到离心管中，离心；离心后油相位于离心管的上层，水相位于离心管的下层；收集下层的水相，得到纯化后的微滴PCR产物；
5)DGGE检测微滴PCR产物
取纯化后的微滴PCR产物进行DGGE电泳，并进行SYBRGreen染色，在紫外光下显影观察；经DGGE电泳分析，在相应的片段位置，有目的条带显示的则为阳性，无目的条带显示则为阴性。
3.根据权利要求2所述的微滴PCR偶联DGGE分析方法，其特征在于，待测样品和微滴PCR水相中对应的引物对序列为：
玉米品系 引物序列(5’to3’)
BT176： 正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCGTGG
GTTTCTGGCAGCTGGACT；
反向引物：TGGGCGTGGTATCGACTTTATAG；
MON863：正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCTTGG
TTCGGAGAGCACTTGTTGG；
反向引物：ACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAA；
TC1507： 正向引物：
CGCCCGCCGCCGCGGCGGCGGGGCGGGGGCCACC
CACCGGAACAAAATGTAAC；
反向引物：GCCTTGACTTAATCGCACCCATC。
4.根据权利要求2或3所述的微滴PCR偶联DGGE分析方法，其特征在于，步骤2)中，所述水油乳化剂制备方法中微滴PCR水相与微滴PCR油相的体积比为1:2。
5.根据权利要求2-4任一项所述的微滴PCR偶联DGGE分析方法，其特征在于，步骤2)中，所述微滴PCR水相组分及各组分终浓度为：正向引物350-450nM，反向引物350-450nM，10×PCR Buffer，BSA 10-12g/l，dNTPs 0.2-0.3mM，TaKaRa Taq5-6U，PCR模板≤109molecules(1.66fmol)。
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