CN102888398B

CN102888398B - 转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列及其应用

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Publication number: CN102888398B
Application number: CN201110206849.0A
Authority: CN
Inventors: 金芜军; 宛煜嵩; 王文娟; 张秀杰; 苗朝华
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2031-07-22
Also published as: CN102888398A

Abstract

本发明涉及转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列及其应用，所述旁侧序列包括3’端旁侧序列和5’端旁侧序列，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。利用该旁侧序列作为目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的转基因水稻品系Bar68-1的品系特异性定性PCR检测方法，可广泛用于生物技术领域中转基因水稻的安全评估和检测。

Description

转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列及其应用

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，具体地说，涉及转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列，以及根据该旁侧序列设计特异性引物PCR检测转基因水稻品系Bar68-1。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的研究和应用，已经有多个转基因水稻品系进入了环境释放，并申请商业化种植。2009年8月，我国农业部发放了转基因水稻品系华恢1号和Bt汕优63的生产应用安全证书。对转基因植物进行品系特异性的检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。而外源基因的旁侧序列是评估转基因植物安全性的最重要的分子特征之一，因此，转基因植物外源插入片段的旁侧序列是评估转基因生物安全性的重要资料。

目前，已知一些转基因水稻外源插入载体旁侧序列的相关报道，例如，谢家建等人利用TAIL-PCR、Genome walking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号的外源插入片段的旁侧序列，并建立了品系特异性的检测方法。但是，目前为止，尚未发现任何关于转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列及其应用。

本发明的另一目的是提供一种转基因水稻Bar68-1的品系特异性PCR检测方法。

本发明的进一步目的是提供用于检测转基因水稻品系Bar68-1的特异性引物及含有该引物的检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示的序列同源性在99％以上的核苷酸序列。

所述3’端旁侧序列的制备方法：以转基因水稻品系Bar68-1的基因组DNA为模板，通过hi TAIL-PCR扩增得到。

本发明的转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5’端旁侧序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示的序列同源性在99％以上的核苷酸序列。

所述5’端旁侧序列的制备方法：以转基因水稻品系Bar68-1的基因组DNA为模板，通过hi TAIL-PCR和PCR扩增得到。

根据SEQ ID NO.1中第1-318位核苷酸序列设计正向引物，根据SEQ ID NO.1的第319-1099位核苷酸序列设计反向引物，建立转基因水稻Bar68-1品系特异性的定性PCR检测方法：

所述正向引物为Bar-F：5′-CCATATTCAGCTCGCCTTGC-3′；

所述反向引物为Bar-R：5′TGGTTTTTGTTGTCCGTGCCT-3′。

前述的方法包括以下步骤：1)提取植物基因组；2)以步骤1)的基因组为模板，利用上述特异性引物Bar-F和Bar-R进行PCR检测。

优选的PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。

优选的PCR反应体系如表1所示：

表1PCR反应体系

反应试剂	体积(μl)	终浓度
			DNA模板	1	100ng/μl
10×PCR缓冲液	5	1×(1.5mM MgCl₂)²
			dNTPs	2	0.2mM
引物Bar-F	0.5	0.2μM
			引物Bar-R	0.5	0.2μM

DNA聚合酶	0.125	1.25u
			ddH₂O	补足至25μl

本发明进一步提供含有上述特异性引物Bar-F和Bar-R的检测试剂盒，以及该试剂盒在检测转基因水稻品系Bar68-1中的应用。

本发明以转基因水稻品系Bar68-1为材料，提取植物基因组DNA，利用hi TAIL-PCR方法分离得到3’端旁侧序列1099bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过分析，该3’端旁侧序列包括：外源插入片段，来源于Escherichia coli基因组部分序列，其核苷酸序列与SEQ IDNO.1中的第1-318位的核苷酸序列完全相同；以及水稻基因组序列，位于水稻3号染色体(GenBank登记号：AC137073)的第97323-98103位，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1中的319-1099位的核苷酸序列完全相同。

利用hi TAIL-PCR和PCR扩增方法分离得到5’端旁侧序列1348bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过分析，该5’端旁侧序列包括：水稻基因组序列，位于水稻3号染色体上(GenBank登记号：AC137073)的第96442-97322位，其核苷酸序列与SEQ ID NO.2中的第1-881位的核苷酸序列完全相同；以及外源载体部分序列，其核苷酸序列与SEQID NO.2中的第882-1348位的核苷酸序列完全相同。

本发明首次克隆了转基因水稻品系Bar68-1外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的转基因水稻品系Bar68-1的品系特异性定性PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。

本发明首次根据Bar68-1外源插入片段的3’旁侧序列，设计品系特异性定性PCR引物，建立了转基因水稻外源基因整合事件Bar68-1的品系特异性定性PCR检测方法。所建立的该品系特异性定性PCR扩增的特异性片段只能在转基因水稻Bar68-1基因组中扩增获得，而不能在其他转基因水稻品系(如，∏优明恢86、∏优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号等)及其它转基因植物(如，MON863玉米、GHB614棉花、MON5747大豆和油菜GT73等)基因组中扩增获得。

本发明建立的品系特异性定性PCR检测方法，用于检测转基因水稻品系Bar68-1，灵敏度高，能够检测到的最低转基因含量为0.05％。

附图说明

图1为转基因水稻品系Bar68-1的3’端旁侧序列hi TAIL-PCR扩增结果；其中，M为1Kb DNA marker；1为空白对照；2为阴性对照；3-5分别为AD1-3hi TAIL-PCR第1、2、3轮扩增产物；6-8分别为AD1-4hiTAIL-PCR第1、2、3轮扩增产物。

图2为转基因水稻品系Bar68-1的5’端旁侧序列hi TAIL-PCR扩增结果；其中，M为100bp DNA marker；1为空白对照；2为阴性对照；3-5分别为hi TAIL-PCR第1、2、3轮扩增产物。

图3为转基因水稻品系Bar68-1的上游水稻(5’端)序列PCR扩增结果；其中，M为100bp DNA marker；1为引物OS-F1/R1扩增产物；2为引物OS-F2/R2扩增产物。

图4为Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测方法的特异性分析结果；其中，M为100bp DNA marker，1为阴性对照(水)，2-13分别为转基因水稻Bar68-1、转基因水稻∏优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号、转基因玉米MON863、转基因棉花GHB614、转基因大豆MON5747、转基因油菜GT73和常规水稻明恢63。

图5为Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度分析结果；其中，M为100bp DNA marker，1为阴性对照(水)，2-7分别为转基因水稻Bar68-1的DNA含量为100％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0％。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHaboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用试剂和材料均为市售商品。

实施例1转基因水稻品系Bar68-1外源插入片段的旁侧序列的克隆

一、实验材料

1、植物材料

转基因水稻：转基因水稻品系Bar68-1

常规水稻：明恢63

2、酶与试剂

dNTPs、DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司。Ex TaqDNA聚合酶及其缓冲液购自大连宝生物工程有限公司。pGEM-T Easy克隆载体均购自Promega公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自OMEGA。引物由上海生物工程有限公司合成。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3、实验仪器

PCR扩增仪：Veriti 96well Thermal Cycler(Applied Biosystems)

核酸电泳仪：DYY-11型电泳仪(北京市六一仪器厂)

DNA电泳分析系统：G：BOX iChemi XT(Syngene)

其它仪器包括：天平，恒温水浴锅，离心机等。

二、实验方法与过程

1、植物基因组DNA的提取与检测

1.1植物DNA提取

1.1.1CTAB提取缓冲液的配置

600mL水中加入81.7g NaCl和20g CTAB，充分溶解后加入1mol/LTris-HCl(pH 7.5)溶液100mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)溶液100mL，最后用HCl或NaOH溶液调pH至8.0，加水定容至1000mL。高温高压(103.4kPa/121℃)条件下灭菌20min后使用。

1.1.2提取方法

a.100mg样品，在液氮中充分研磨成粉末后转移至2ml离心管中。

b.1ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，并轻柔混合。

c.65℃水浴40min，期间颠倒混匀数次。

d.12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管，加入等体积酚、氯仿-异戊醇(24∶1)，充分混合。

e.12000r/min离心10min。转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，充分混合。

f.12000r/min离心10min，取上清，加入2/3体积异丙醇，1/10体积乙酸钠。-20℃放置2小时或更长时间。

g.12000r/min离心10min。

h.弃上清，加入500μL，70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000r/min离心10min。

i.弃上清，将离心管倒立于吸水纸吸干，并使乙醇充分挥发，干燥DNA。

g.加100μl水溶解DNA。

k.用重蒸馏水将DNA溶液浓度调制为100ng/μl，储存于-20℃备用。

1.2DNA检测

取3μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断DNA的质量。

采用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度和纯度。

2、hi TAIL-PCR分离Bar68-1的3’端旁侧序列

hi TAIL-PCR详细的描述见Liu等(Liu等，2007，BioTechniques，43：649-656)，用于扩增已知区域的旁侧序列。根据已知序列的3’端区域设计三个特异性巢式PCR引物SPS-P1，SPS-P2和SPS-P3，其中SPS-P1与简并引物AD1-3，AD1-4进行第一轮hi TAIL-PCR扩增，SPS-P2与AD-C进行第二轮hi TAIL-PCR扩增，SPS-P3与AD-C进行第三轮hi TAIL-PCR扩增(图1)。引物序列见表2，PCR反应条件见表3。

表2用于hi TAIL-PCR扩增的简并引物和特异性引物

引物名称	序列(5’-3’)
		SPS-P1	TGGGTGTAAGGAACTTCAATGGTAG
SPS-P2	ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGCTGCCCTGTTAGGCGAGACAATATC
		SPS-P3	TGTGATACCAAAGGGACAGGGGGCT
OS-P1	TGCCTGTTTTATTACTACTTCCTCTGTTC
		OS-P2	ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTCCGCGAGACACGATATATTAGAATATGTG
OS-P3	GAAAGCGATATCACACACTTGCCACAC
		AD1-3	ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA
AD1-4	ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNAGGT
		AD-C	ACGATGGACTCCAGAG

表3hi TAIL-PCR反应程序和条件

3、PCR扩增Bar68-1的5’端水稻基因组

根据获得的3’端旁侧序列中的水稻3号染色体的97323-98103位基因组序列，在其上游区域(5’端)的水稻基因组序列上设计引物对覆盖水稻3号染色体的96708-97322位，引物OS-F1/R1，OS-F2/R2组合进行PCR扩增(图3)。引物序列见表3。

表4用于扩增Bar68-1的5’端水稻基因组的引物

引物名称	序列(5’-3’)
		OS-F1	ATAGCCACCCCTTTTAGTATTGCCG
OS-F2	CTGTCTCTTCTTTTACCTGCCTGCTTTG
		OS-R1	CGTATGTGTACTTGTGTTGGGACAT
OS-R2	GTACCATTGAGGCGACCGTTTTGAT

PCR扩增体系为：

PCR扩增程序为：94℃变性5min；(94℃30s，58℃30s，72℃30s)35个循环；72℃延伸7min。

4、hi TAIL-PCR分离Bar68-1的3’端旁侧序列

在Bar68-1的上游(5’端)水稻基因组序列上设计三个特异性巢式PCR引物OS-P1，OS-P2和OS-P3，其中OS-P1与简并引物AD1-4进行第一轮hi TAIL-PCR扩增，OS-P2与AD-C进行第二轮hi TAIL-PCR扩增，OS-P3与AD-C进行第三轮hi TAIL-PCR扩增(图3)。引物序列见表2，PCR反应条件见表3。

5、hi TAIL-PCR扩增体系

PCR扩增体系：

第一轮hi TAIL-PCR

反应体系：第一轮特异性引物0.5μl(引物浓度10μM)，AD-C引物0.5μL(引物浓度20μM)，Ex Taq DNA聚合酶0.125μL(5U/μL)，10×Ex Taq缓冲液2.5μl，dNTPs 2.0μL(2.5mM)，100ng/μL水稻基因组DNA0.5μL，去离子水补足体积至25μL。

第二轮hiTAIL-PCR

反应体系：第二轮特异性引物0.5μl(引物浓度10μM)，AC引物0.5μL(引物浓度20μM)，Ex Taq DNA聚合酶0.125μL(5U/μL)，10×Ex Taq缓冲液2.5μl，dNTPs 2.0μL(2.5mM)，稀释500倍的第一轮PCR产物1μL，去离子水补足体积至25μL。

第三轮hiTAIL-PCR

反应体系：第三轮特异性引物1μl(引物浓度10μM)，AC引物1μL(引物浓度20μM)，Ex Taq DNA聚合酶0.25μL(5U/μL)，10×ExTaq缓冲液5μl，dNTPs 4.0μL(2.5mM)，稀释500倍的第一轮PCR产物1μL，去离子水补足体积至50μL。

6、序列测定和分析

PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，用OMEGA GelExtraction Kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy载体上，将连接产物转化到JM109感受态细胞中。将筛选出的单克隆从测序公司测序。将获得的序列信息，利用NCBI提供的Blastn检索，分析不同部分序列的来源，从而获得受体基因组与外源插入片段的连接区域特点。

三、实验结果

1、Bar68-1的3’端和5’端旁侧序列的获得

根据外源插入片段已知序列的3’端区域设计的3个特异性巢式引物与简并引物组合进行hi TAIL-PCR扩增获得了3’端外源插入片段的旁侧序列(图1)。在获得的水稻基因组序列的上游区域设计引物进行PCR扩增，验证了其上游水稻基因组序列。再在验证的水稻基因组序列的上游区域设计三个特异性巢式PCR引物与简并引物组合进行hiTAIL-PCR扩增获得了5’端外源插入片段的旁侧序列(图2)。

2、3’端外源插入片段的旁侧序列分析

hi TAIL-PCR扩增获得转基因水稻品系Bar68-1的3’端外源插入片段的旁侧序列，经DNA序列分析和核酸数据库中检索表明：扩增片段长度为1099bp，其中第1-318位为外源插入片段序列，来源于Escherichia coli基因组部分序列，第319-1099为水稻基因组序列，位于水稻3号染色体(GenBank登记号：AC137073)的第97323-98103位。具体的转基因水稻品系Bar68-1的3’端外源插入片段的旁侧序列的信息见SEQ ID NO.1。

3、5’端外源插入片段的旁侧序列分析

利用hi TAIL-PCR和PCR扩增方法分离到转基因水稻品系Bar68-15’端外源插入片段的旁侧序列1082bp，经DNA序列分析和核酸数据库中检索表明：扩增片段长度为1082bp，其中第1-615位为水稻基因组序列，位于水稻3号染色体上(GenBank登记号：AC137073)的第96708-97322位，616-1082位为外源插入载体部分序列。具体的转基因水稻品系Bar68-1的5’端外源插入片段的旁侧序列的信息见SEQ IDNO.2。

实施例2基于转基因水稻品系Bar68-1外源插入片段的旁侧序列建立的转基因水稻Bar68-1的品系特异性PCR检测方法

一、实验材料

1、植物材料

转基因水稻：Bar68-1、∏优明恢86、∏优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号等。

常规水稻：明恢63。

其它转基因植物：MON863玉米、GHB614棉花、MON5747大豆和油菜GT73等。

2、酶与试剂

分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶及其缓冲液购自Promega公司。引物由上海生物工程有限公司合成。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3、实验仪器

PCR扩增仪：Veriti 96well Thermal Cycler(Applied Biosystems)。

核酸电泳仪：DYY-11型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

DNA电泳分析系统：G：BOX iChemi XT(Syngene)。

其他仪器包括：天平，恒温水浴锅，离心机等。

二、实验方法与过程

1、植物基因组DNA的提取与检测

同实施例1中的“植物基因组DNA的提取与检测”。

2、基于3’端旁侧序列的品系特异性定性PCR检测

根据实施例1中SEQ ID NO.1所示的3’端旁侧序列，利用引物设计软件primer 5.0，分别在外源插入片段及水稻基因组上设计引物。具体的引物序列见表5。

表5转基因水稻Bar68-1定性品系特异性检测引物序列

3、Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测体系及反应程序的建立

4、经过优化，Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测的体系见表6，PCR反应程序见表7。

表6PCR反应体系

反应试剂	体积(μl)	终浓度
			DNA模板	1	100ng/μl
10×PCR缓冲液	5	1×(1.5mM MgCl₂)²
			dNTPs	2	0.2mM
引物Bar-F	0.5	0.2μM
			引物Bar-R	0.5	0.2μM
Go Taq DNA聚合酶	0.125	1.25u
			ddH₂O	补足至25μl

表7PCR反应程序

实施例3Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测方法的特异性分析

以特异性引物Bar-F和Bar-R建立的定性PCR扩增结果表明，在Bar68-1水稻基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(263bp)，在其它转基因水稻∏优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号和其它转基因植物MON863玉米、GHB614棉花、MON5747大豆和油菜GT73，以及常规水稻明恢63基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段。通过测序分析表明Bar68-1水稻基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。上述结果表明引物Bar-F和Bar-R建立的转基因水稻Bar68-1品系特异性定性PCR检测方法具有高度特异性。(图4)

实施例4Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度分析

以特异性引物Bar-F和Bar-R建立的定性PCR灵敏度扩增结果显示，转基因水稻Bar68-1的DNA含量为1％、0.5％、0.1％、0.05％的PCR反应中都扩增出了目的片段大小的条带，说明Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度为0.05％。(图5)

实施例5Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测试剂盒

该检测试剂盒包含以下引物：

正向引物Bar-F：5′-CCATATTCAGCTCGCCTTGC-3′和

反向引物Bar-R：5′-TGGTTTTTGTTGTCCGTGCCT-3′。

以引物Bar-F和Bar-R建立的定性PCR灵敏度扩增结果显示，转基因水稻Bar68-1的DNA含量为1％、0.5％、0.1％、0.05％的PCR反应中都扩增出了目的片段大小的条带，说明Bar68-1水稻品系特异性定性PCR检测试剂盒的灵敏度为0.05％。(图5)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。