CN102628040A

CN102628040A - 一种转基因水稻外源插入载体旁侧序列及其应用

Info

Publication number: CN102628040A
Application number: CN2012100841277A
Authority: CN
Inventors: 杨正友; 李文华; 赵凤春; 田园
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2012-03-27
Publication date: 2012-08-08

Abstract

本发明涉及一种转基因水稻外源插入载体旁侧序列及其应用，属于生物技术领域。本发明首次克隆了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段，建立特异性的转基因水稻品系SK-2的品系特异性定性PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。利用该旁侧序列设计特异性引物用于目的DNA的扩增，能建立特异性的转基因水稻品系SK-2的品系特异性定性、定量PCR检测。

Description

一种转基因水稻外源插入载体旁侧序列及其应用

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列。具体的说，涉及一种转基因水稻品系SK-2的外源插入载体的旁侧序列。

背景技术

自1983年首例转基因烟草作物问世以来, 基因工程技术发展日新月异, 转基因作物新品种不断涌现，近年来，玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等转基因作物已在许多国家允许种植和生产，并被广泛用作食品或饲料的加工原料。由于转基因产品存在着生态风险和食品安全等一系列的问题，因此，世界各国政府和相关国际组织纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良作物及其产品实施标识制度。

为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，建立高效、快速、特异的检测技术十分必要，它是各国际组织和国家管理遗传改良作物的有力技术支撑。基于核酸的聚合酶链反应（PCR）检测技术因具有高灵敏度和特异性强的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的遗传改良作物及其产品检测技术。PCR检测方法建立的主要依据是特异性的扩增遗传改良植物的外源基因片段。在转基因植物中，稳定表达的外源DNA插入片段一般包括启动子、目的基因和终止子三类元件。针对扩增的外源DNA片段差异，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测。品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每个遗传改良作物品系，都具有特异性的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，因此品系特异性检测方法具有较筛选、基因特异性和构建特异性PCR检测方法更高的特异性和准确性，能够特异性的检测专一的遗传改良作物品系。因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。

水稻是我国最重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。为了对转基因水稻进行监督管理，保障其健康发展，对转基因水稻的外源插入片段的旁侧序列进行分离非常关键。

目前已经有部分专利和文献报道了转基因植物外源插入片段的旁侧序列，例如：张大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法，谢家建等人于2007年利用TAIL-PCR、genome walking和D-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号、科丰8号的外源插入片段的旁侧序列，并建立了品系特异性的检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。

发明内容

针对上述领域中的空白，提供了一种转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列。

进一步，本发明还提供该转基因品系特异性的PCR检测方法。

一种转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3'端旁侧序列，其特征在于：3'端旁侧序列如SEQ ID NO:1所示。

一种转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5'端旁侧序列，其特征在于：5'端旁侧序列如SEQ ID NO:2所示。

3'端旁侧序列的制备方法，其特征在于提取转基因水稻品系SK-2植物基因组DNA，通过TAIL-PCR扩增得到。

5’端旁侧序列的制备方法，其特征在于提取转基因水稻品系SK-2植物基因组DNA，通过PCR扩增得到。

转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为3’端旁侧序列的特异性引物：一条引物为依据SEQ ID NO:1中1-2262位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO:1的2263-3221位序列设计的反向引物。合成引物如下：Sk2-F1：5'-CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC-3'和Sk2-R2: 5'-GTAGGGGTAGGTA ATTGGGAAGG-3'。

转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为5’端旁侧序列的特异性引物：一条引物为依据SEQ ID NO:2中1-89位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO:2的90-518位序列设计的反向引物。合成引物如下：Sk2-F2：5'- ATATAGGGTCCACATGTTAGG-3'和Sk2-R2: 5'- ATGACGTATCAAAGTACCGAC-3'。

提取总DNA，利用SK2-F1/SK2-R1或SK2-F2/SK2-R2组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，如存在产物则说明样品中含有转基因水稻品系SK-2来源的成分。

根据朱常香等（朱常香等. 用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得. 农业生物技术学报. 1999,7:259-266.）报道的用于转化的载体pBW3的结构（见图1），含有由Actin启动子和PinII终止子调控目的基因CryIA（b）和由35S启动子和Nos 终止子调控的筛选标记基因Bar两个基因。

本发明采用常规方法，提取植物基因组DNA，利用TAIL-PCR分离法得到3’端旁侧序列3221bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过分析，该:3’端旁侧序列包括：转化载体pBW3部分序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1中1-2262位的核苷酸序列完全相同；水稻基因组序列，位于水稻8号染色体（GenBank登记号：AP005734.4）的54604-55562位，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从2263-3221位的核苷酸序列完全相同。

利用PCR扩增得到:5’端旁侧序列518bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。通过分析，该:5’端旁侧序列包括：水稻基因组序列，位于水稻8号染色体（GenBank登记号：AP005734.4）的55444-55531位，其核苷酸序列与SEQ ID N0:2中从1-89位的核苷酸序列完全相同。转化载体pBW3部分序列，其核苷酸序列与SEQ ID N0:2中的90-518位的核苷酸序列完全相同。

转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，以3’ 端旁侧序列或5'端旁侧序列作为目的DNA扩增片段。根据3’ 端旁侧序列设计特异性引物，一条引物为依据SEQ ID NO:1中1-2262位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO:1的2263-3221位序列设计的反向引物：正向引物：Sk2-F1：5'-CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC-3'；反向引物：SK2-R1 ：5'-GTAGGGGTAGGTAATTGGGAAGG-3'。据5’ 端旁侧序列设计特异性引物，一条引物为依据SEQ ID NO:2中1-89位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO:2的90-518位序列设计的反向引物。合成引物如下：Sk2-F2：5'- ATATAGGGTC CACATGTTAGG-3'和Sk2-R2: 5'- ATGACGTATCAAAGTACCGAC-3'。

本发明首次克隆了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段，建立特异性的转基因水稻品系SK-2的品系特异性定性PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。

附图说明

图1 pBW3载体的结构示意图，

图2 3’端边界TAIL-PCR扩增图谱，

泳道M：DNA Marker，大小依次为5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；泳道1，2，3：引物 AD1的三级TAIL-PCR扩增反应产物；泳道4，5，6：引物 AD2的三级TAIL-PCR扩增反应产物；泳道7，8，9：引物 AD3的三级TAIL-PCR扩增反应产物。

图3转基因水稻品系SK-2 5’端旁侧序列PCR扩增图谱，

M：DNA Marker，大小依次为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；泳道1：引物组合ORT-F/Act-R扩增产物。

图4 转基因水稻品系SK-2 3’端旁侧序列特异性引物SK2-F1/SK2-R1检测，

M：marker大小依次为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；泳道1，转基因水稻品系SK-2；泳道2：对照圣稻301。

图5 转基因水稻品系SK-2 3’端旁侧序列特异性引物SK2-F2/SK2-R2检测，

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

转基因水稻品系SK-2的外源插入载体的旁侧序列的克隆

一、实验材料

1、植物材料

转基因水稻：转基因水稻品系SK-2。

二、实验方法和过程

1、水稻基因组DNA提取与检测

1）水稻基因组DNA的提取

取苗期水稻叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒（天泽基因公司）的操作手册，进行水稻材料总DNA的提取。

2）水稻基因组DNA检测

取5ul提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。

2、转基因水稻品系SK-2旁侧序列的分离

1）TAIL-PCR分离转基因水稻品系SK-2 3’端旁侧序列

TAIL-PCR用于扩增已知区域的侧翼序列。根据SK-2 插入载体（图1）Nos终止子DNA序列设计三个巢式特异性PCR引物TNos-F1、TNos-F2和TNos-F3，依次与3个简并引物AD1-AD3分别组合进行3次PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应条件见表2。

表1用于TAIL-PCR扩增的简并引物和特异性引物

引物名称	序列（引物序列（5’-3’）
		TNos-F1	CTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC（SEQ ID N0:3）
TNos-F2	ATGCATGACGTTATTTATGAGATGG （SEQ ID N0:4）
		TNos-F3	GCAATTATACATTTAATACGCGAT（SEQ ID N0:5）
AD1	NTCGASTWTTSGWGTT（SEQ ID N0:6）
		AD2	NGTCGASWGANAWGAA （SEQ ID N0:7）
AD3	AGWGNAGWANCAWAGG（SEQ ID N0:8）

表2 TAIL-PCR反应程序和条件

2）SK-2 5’端旁侧序列的分离

根据已测定的SK-2 3’端旁侧序列水稻基因组序列，在其上游设计引物ORT-F（序列为:5’-ATATAGGGTCCACATGTTAGG-3’），与在载体序列中启动子Actin基因上设计的引物Act-R(序列为：5’-GCAACGGGGGAAAGCTATTTTAATC-3’)组合进行扩增。

反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物（20μM）各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟

3、序列测定和分析

PCR扩增产物在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳，采用Biomiga EZgene^TM Cycle Pure Kit回收扩增片段，连接到pMD-18T载体上, 送上海博尚生物技术有限公司进行序列测定。采用vectorNTI10.0（Invitrogen）比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中用BLAST检索相似的水稻基因组序列。

三、实验结果

1、转基因水稻SK-2的3’端旁侧序列

转基因水稻SK-2外源插入载体pBW3边界的TAIL-PCR扩增结果表明，3个AD引物都扩增出了特异性条带，其中由AD1扩增的第三级产物的条带较单一（图2）。回收AD1的第三级扩增片段，连到pmd18-T载体上，进行序列测定。

序列测定结果表明，扩增片段长度为3221bp，其中1-2262位为pBW3插入载体的部分序列；2263-3221位于水稻8号染色体（GenBank登记号：AP005734.4）的54604-55562位。

2、SK-2的5’端旁侧序列

利用ORT-F/Act-R组合PCR扩增得到了特异性的扩增，见图3。序列测定表明，扩增片段长度为518bp,其中1-89位为水稻基因组序列，位于水稻8号染色体（GenBank登记号：AP005734.4）的55444-55531位；90-518位为转化载体pBW3部分序列。

实施例2

基于转基因水稻品系SK-2的外源插入载体旁侧序列的定性PCR检测方法

一、实验材料

1、植物材料

转基因水稻：转基因水稻品系SK-2。

常规水稻：圣稻301。

二、实验方法和过程

1、植物基因组DNA提取与检测

见实施例1中的“植物基因组DNA提取与检测”

2、基于3’端和5’端旁侧序列的品系特异性PCR检测

根据实施例1中测定的3’端和5’端旁侧序列，分别在其水稻基因组序列部分和转化载体序列部分设计引物，见表8。PCR扩增结果表明，转基因水稻品系SK-2的3’端和5’端扩增引物组合得到了预期的383bp和295bp的扩增片段，而对照圣稻301没有相应的扩增片段，见图4和图5。因此，本发明所克隆、分离的外源插入载体的旁侧序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。

表8 SK-2品系特异性PCR检测引物

Claims

1.一种转基因水稻品系SK-2的外源插入载体的旁侧序列，所述旁侧序列为3'端旁侧序列，其特征在于：3'端旁侧序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种转基因水稻品系SK-2的外源插入载体的旁侧序列，所述旁侧序列为5'端旁侧序列，其特征在于：5'端旁侧序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述的旁侧序列的制备方法，其特征在于提取转基因水稻品系SK-2植物基因组DNA，通过TAIL-PCR扩增得到。

4.权利要求2所述的旁侧序列的制备方法，其特征在于提取转基因水稻品系SK-2植物基因组DNA，通过PCR扩增得到。

5.如权利要求1所述的转基因水稻品系SK-2外源插入载体的旁侧序列的应用，其特征是利用该序列特征设计的转基因水稻SK-2的品系特异性定性PCR检测方法：

合成引物如下：Sk2-F1：5'-CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC-3'和Sk2-R1 5'-GTAGGGGTAGGTAAT TGGGAAGG-3'；

提取总DNA，利用SK2-F1/SK2-R1组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，如存在产物则说明样品中含有转基因水稻品系SK-2来源的成分。

6.按权利要求2所述的转基因水稻品系SK-2外源插入载体的旁侧序列的应用，其特征是利用该序列特征设计的转基因水稻SK-2的品系特异性定性PCR检测方法：

合成引物如下：Sk2-F2：5'- ATATAGGGTCCACATGTTAGG-3'和Sk2-R2: 5'- ATGACGTATCAAAGTACCGAC-3'；提取总DNA，利用SK2-F2/SK2-R2组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，如存在产物则说明样品中含有转基因水稻品系SK-2来源的成分。