CN102206632A

CN102206632A - 转基因玉米mon88017转化事件外源插入载体旁侧基因及其应用

Info

Publication number: CN102206632A
Application number: CN 201110058482
Authority: CN
Inventors: 路兴波; 袁磊; 孙红炜; 武海斌; 李凡; 韩伟
Original assignee: Institute of Plant Protection Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2011-10-05

Abstract

本发明公开了转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因，其序列如序列表中1所示。本发明的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于特异性定性检测转基因玉米及相关产品是否含有MON88017转化事件以及其含量，该检测方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的市场前景。本发明首次分析并确认了转基因玉米Mon88017转化事件外源插入载体旁侧序列中不同碱基的来源，并确定外源插入载体序列和玉米基因组序列的接合位点，为科学研究做出了贡献。

Description

转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因及其应用

技术领域

本发明涉及转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因及其应用。

背景技术

近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获得批准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用做食物添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，40多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。

各国转基因标识制度的相继建立，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，各种转基因检测技术也成为研究热点。常用的转基因检测方法有聚合酶链式反应(PCR)法，外源蛋白检测法，基因芯片检测技术。虽然国外对转基因作物检测方法研究已有十几年，但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新检测方法。

根据不同转基因植物及其产品检测目的的不同，鉴定转基因植物主要包括检测筛选基因、目的基因、不同基因间的交联结构基因、和转入基因与受体植物间的转化体特异结构基因。简介如下：

1.筛选型特异性检测方法

筛选检测通常是检测转基因植物中CaMV35S启动子和NOS终止子，因为外源基因在转入作物中为了加强其表达通常会携带35S启动子和NOS终止子。但是35S启动子存在天然的花椰菜花叶病毒，NOS终止子存在于植物病毒Ti质粒中，抗生素类报告基因自然界中也普遍存在，因而仅是检测转基因植物的筛选基因，极易出现假阳性的结果，同时也达不到鉴定转基因植物的目的。

2.基因特异性检测方法

基因特异性检测就是检测转入转基因植物中的外源目的基因。目前人们检测的目的基因如CP4-EPSPS，BAR，Cry1A(b)基因，但是由于一种作物中可能转入了几种目的基因或一种目的基因已转入到几种作物中，在检测时很容易出现假阴性。

3.构建特异性检测方法

构建特异性检测芯片是利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。但是，由同一个构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此构建特异性检测芯片检测方法不能识别不同的转基因品系，检测结果也很容易出现假阳性，也不能判断该转基因品系是否经过了安全评估。

4.转化体特异性检测方法

转化体特异性检测芯片的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可能重复的。与前三种方法相比，转化体特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因玉米Mon88017外源插入旁侧序列和利用此序列建立转化体特异性定性、定量PCR检测的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术在检测转基因玉米Mon88017中存在的不足，提供了一种转基因玉米Mon88017外源插入载体旁侧基因，及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因，其序列如序列表中1所示，总长504bp(顺序5′～3′)，具体如下：

aaattttgtc ctgaacccct aaaatcccag gaccgccacc tatcatatac atacatgatc 60

ttctaaatac ccgatcagag cgctaagcag cagaatcgtg tgacaacgct agcagctctc 120

ctccaacaca tcatcgacaa gcaccttttt tgccggagta tgacggtgac gatatattca 180

attgtaaatg gcttcatgtc cgggaaatct acatggatca gcaatgagta tggtggtcaa 240

tatggagaaa aagaaagagt aattaccaat tttttttcaa ttcaaaaatg tagatgtccg 300

cagcgttatt ataaaatgaa agtacatttt gataaaacga caaattacga tccgtcgtat 360

ttataggcga aagcaataaa caaattattc taattcggaa atctttattt cgacgtgtct 420

acattcacgt ccaaatgggg gcttagatga gaaacttcac gatttggcgc gccaaagctt 480

actcgaggtc attcatatgc ttga 504。

所述转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因具有以下特征：

(1)从5′端开始前168bp为玉米基因组序列；

(2)从第169bp至3′末端为插入到玉米中的载体序列，其中从第169bp～479bp为间插序列，从第480bp至3′末端为水稻中P-ract1部分序列，P-ract1是actin1基因启动子，驱动cp4 epsps基因表达；

(3)由来源于玉米基因组的第1至168个碱基和来源于外源插入载体的第169碱基至第504个碱基共同组成转基因玉米Mon88017转化事件外源插入载体旁侧基因序列。

所述的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因的提取方法，步骤如下：

(1)提取并纯化转基因玉米Mon88017基因组总DNA：采用Dra I、EcoR V、Pvu II、Stu I四种限制性内切酶进行充分酶切，并对酶切产物进行纯化；

(2)引物设计：利用BD GenomeWalker试剂盒(美国Clontech公司生产)提供的接头引物AP1和AP2，其序列分别为：

AP1：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；

AP2：5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′；

另外，参照Mon88017插入载体结构序列设计引物如下：

P-ractgsp1：5′-CTTTAGGACTTTAGGGGTTGTT-3′；

P-ractgsp2：5′-GGACTATCCCGACTCTCTTC-3′；

(3)以转基因玉米MON88017基因组酶切产物为模板进行两轮PCR扩增：引物对AP1和P-ractgsp1用于第一轮PCR反应，扩增体系20μL，PCR程序为94℃25s，72℃3min，6个循环；94℃25s，64℃30s，36个循环；64℃延伸7min，1个循环；引物对AP2和P-ractgsp2用于第二轮PCR，在第二轮PCR中用1μL第一轮扩增产物的50倍稀释液作为模板，PCR扩增体系和反应程序与第一轮PCR相同；第二轮PCR产物即为转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因；

(4)将第二轮PCR产物纯化并克隆到TA载体上进行测序，得到转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因。

所述的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于特异性定性检测玉米及相关产品是否含有MON88017转化事件，具体应用时，方法如下：

(1)首先，根据转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因的序列设计引物，引物序列如下：

Mon88017-F：5′-TCCTGAACCCCTAAAATCCC-3′；

Mon88017-R：5′-TTTCTCATCTAAGCCCCCAT-3′；

(2)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用Mon88017-F和Mon88017-R引物组合进行PCR扩增；

(3)上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品为含有MON88017转化事件的转基因玉米或其相关产品；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MON88017转化事件。

所述步骤(2)中PCR程序为：95℃5min预变性；94℃30s，58℃30s，72℃30s，36个循环；72℃延伸7min。

所述的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于特异性定量检测玉米及相关产品是否含有MON88017转化事件及其含量，具体应用时，方法如下：

(1)建立MON88017基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线：

①构建MON88017转化体特异性标准分子：将含有MON88017特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb特异性序列连接到pUC57质粒并导入大肠杆菌，制备表达载体；

②培养上述大肠杆菌，使用质粒提取法试剂盒提取质粒DNA，并用紫外分光光度计测定其OD值，计算出质量浓度，计算出相应的拷贝数；

③对质粒DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MON88017转化事件的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物及探针，进行扩增；

④扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MON88017转化事件的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线；

(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MON88017基因的特异性引物和荧光标记探针，以及ZSSIIb基因的国家标准引物及探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MON88017基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相对应的拷贝数，则转基因玉米MON88017基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MON88017的百分含量。

所述步骤(1)③中，MON88017基因的特异性引物和荧光标记探针是根据转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因的序列设计的，具体如下：

Mon88017-F1：5′-GGACATGAAGCCATTTACAATTGA-3′；

Mon88017-R1：5′-GCTCTCCTCCAACACATCAT-3′；

Mon88017-Probe：5′-FAM-ATATCGTCACCGTCATACTCCGGCAA-TAMRA-3′。

zSSIIb引物和探针序列(国家标准)如下：

zSSIIb-F1：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

zSSIIb-R1：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′；

zSSIIb-Prohe：5′-FAM-TA AGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3′。

所述步骤(1)③中，扩增的参数如下：扩增反应体积为50μl，2×Premix Ex Taq25μl，浓度10μmol/L的Forward Primer2μl，浓度10μmol/L的Reverse Primer2μl，浓度10μmol/L的TaqMan Probe2μl，50×ROX Reference Dye 1μl，DNA模板2.0μl，ddH2O16μl；扩增反应条件：95℃预变性30S，95℃变性5S，60℃退火/延伸31S，共计40个循环。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1.本发明首次测序公布了转基因玉米Mon88017转化事件外源插入载体旁侧序列。

2.本发明首次分析并确认了转基因玉米Mon88017外源插入载体旁侧序列中不同碱基的来源，并确定外源插入载体序列和玉米基因组序列的接合位点。

3.利用本发明发现的序列特征，建立了转基因玉米Mon88017转化体特异性定性、定量PCR检测方法，该检测方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为转基因玉米Mon88017转化体定性PCR扩增结果电泳示意图；

其中：M-分子量Marker，1-转基因玉米Mon88017基因组DNA模板，2-转基因玉米Bt176基因组DNA模板，3-转基因玉米Bt11基因组DNA模板，4-转基因玉米Mon810基因组DNA模板，5-转基因玉米Mon863基因组DNA模板，6-转基因玉米GA21基因组DNA模板，7-转基因玉米NK603基因组DNA模板，8-转基因玉米TC1507基因组DNA模板，9-转基因玉米T25基因组DNA模板，10-非转基因玉米郑单958基因组DNA模板，11-转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA模板，12-转基因棉花Mon531基因组DNA模板，13-非转基因大豆1138-2基因组DNA模板，14-非转基因棉花中49基因组DNA模板，15-空白对照。

图2为实施例2中内标准(zSSIIb基因)定量PCR标准曲线。

图3为实施例2中转基因玉米Mon88017转化体定量PCR标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1转基因玉米Mon88017转化体外源插入载体旁侧序列的PCR扩增

提取转基因玉米Mon88017基因组DNA，利用美国Clontech公司的BD GenomeWalker试剂盒，根据试剂盒提供的方法对Mon88017基因组DNA进行酶切。

合成引物序列如下：

P-ractgsp1：5′-CTTTAGGACTTTAGGGGTTGTT-3′；

P-ractgsp2：5′-GGACTATCCCGACTCTCTTC-3′。

以转基因玉米MON88017为模板进行两轮PCR扩增，引物对AP1和P-ractgsp1用于第一轮PCR反应，扩增体系20μL。PCR程序为94℃25s，72℃3min，6个循环；94℃25s，64℃30s，36个循环；64℃延伸7min，1个循环。引物对AP2和P-ractgsp2用于第二轮PCR，在第二轮PCR中用1μL第一轮扩增产物的50倍稀释液作为模板，PCR扩增体系和反应程序与第一轮PCR相同。用琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，将扩增出的清晰条带进行切割、纯化，克隆到TA载体上测序，利用NCBI提供的BLASTN软件，分析不同部分序列的来源，从而判断基因组和载体的结合位点。

结果如下：以引物对AP1和P-ractgsp1用于第一轮PCR反应，引物对AP2和P-ractgsp2用于第二轮PCR后，成功扩增获得504bp扩增产物。对PCR产物测序，经BLASTN软件分析不同部分序列的来源发现：从5′端开始前168bp为玉米基因组序列，从第169bp至3′末端为插入到玉米中的载体序列，其中从第169bp～479bp为间插序列，从第480bp至3′末端为水稻中P-ract1部分序列，P-ract1是actin1基因启动子，驱动cp4 epsps基因表达。由来源于玉米基因组的第1至168个碱基和来源于外源插入载体的第169碱基至至504个碱基共同组成转基因玉米Mon88017转化事件外源插入载体旁侧序列，其序列如序列表中1所示。

实施例2转基因玉米Mon88017转化事件外源插入载体旁侧基因的应用

1)利用本发明中所提供序列设计转基因玉米Mon88017转化事件转化体特异性定性PCR检测方法：

引物由上海博亚生物公司合成，引物稀释成10μmol/L备用。合成的引物序列如下：

Mon88017-F：5′-TCCTGAACCCCTAAAATCCC-3′；

Mon88017-R：5′-TTTCTCATCTAAGCCCCCAT-3′。

分别提取转基因玉米MON88017、MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21等9种，非转基因玉米郑单958，转基因棉花MON531，非转基因棉花中49，转基因大豆GTS40-3-2，非转基因大豆1138-2基因DNA为模板，分别利用Mon88017-F和Mon88017-R引物组合进行PCR扩增。。PCR程序为：95℃5min预变性；94℃30s，58℃30s，72℃30s，36个循环；72℃延伸7min。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。

结果：利用所设计的引物以提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果如图1所示，由图可见，只有转基因玉米Mon88017基因组成功扩增出特异性446bp PCR产物，而其他转基因和非转基因样品做模板时都没有可观察到的扩增产物。这表明，该引物具有良好的特异性，适合用于转化体特异性的检测。

2)利用本发明中所提供序列设计转基因玉米Mon88017转化事件转化体特异性定量PCR检测方法：

将含有MON88017特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb特异性序列的pUC57质粒导入大肠杆菌，涂抹到含有Amp的固体LB培养基上，等到长出菌斑以后，挑取白色单菌落，并培养菌液。离心收集细菌，使用质粒小量提取试剂盒(天根生物有限公司)提取质粒DNA，用紫外分光光度计测定其OD值，计算出质量浓度。根据每个阳性质粒含2950bp，计算出MW＝1.947×10⁶g/mol，浓度达到7.0×10¹¹拷贝/μl，制备成含有1.0×10¹⁰拷贝/μl质粒DNA分子溶液。把含有1.0×10¹⁰拷贝/μl质粒DNA稀释成1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²拷贝/μl的质粒DNA溶液，在1.0×10⁶、1.0×10⁴和1.0×10²拷贝/μl这3个浓度分别设置2个重复，检测扩增的重复性。

通过Primer Express软件设计适合MON88017的定量PCR检测用的特异性引物和Taqman探针。玉米内标引物及探针(zSSIIb)采用国家标准引物及探针。

Mon88017引物和探针序列如下(序列5′～3′)：

Mon88017-F1：5′-GGACATGAAGCCATTTACAATTGA-3′；

Mon88017-R1：5′-GCTCTCCTCCAACACATCAT-3′；

Mon88017-Probe：FAM-5′-ATATCGTCACCGTCATACTCCGGCAA-3′-TAMRA。

zSSIIb引物和探针序列如下：

zSSIIb-F1：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

zSSIIb-R1：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′；

zSSIIb-Probe：5′-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3′。

扩增反应体积为50μl，2×Premix Ex Taq25μl，Forward Primer(浓度10μmol/L)2μl，Reverse Primer(浓度10μmol/L)2μl，TaqMan Probe(浓度10μmol/L)2μl，50×ROXReference Dye 1μl，DNA模板2.0μl，ddH2O16μl。扩增反应条件：95℃预变性30S，95℃变性5S，60℃退火/延伸31S，共计40个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(空白)和非转基因样品(阴性)对照。

结果：通过对不同质粒拷贝数为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²拷贝/μl的质粒DNA进行实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MON88017标准品(1％、0.5％、0.1％、0.05％、0％)、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品的转基因成分的百分含量。

对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MON88017的转化体特异性引物对同一组质粒DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图2所示，该曲线的斜率为-3.150386，相关系数R²值为0.997565。转基因玉米MON88017的转化体特异性引物的标准曲线如图3所示，该曲线的斜率为-3.149857，相关系数R²值为0.999056。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。然后用转基因玉米的拷贝数与玉米内标准基因的拷贝数之比，就可以得到该样品中转基因玉米MON88017的百分含量。

以上结果可以看出，本发明为转基因玉米Mon88017的定性和定量PCR检测提供了简单、可靠的测定方法，可以用于转基因玉米Mon88017的检测。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，为转基因产品的控制提供了必要的手段。

Claims

1.转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因，其特征在于：其序列如序列表中1所示，具体如下：

aaattttgtc ctgaacccct aaaatcccag gaccgccacc tatcatatac atacatgatc 60

ttctaaatac ccgatcagag cgctaagcag cagaatcgtg tgacaacgct agcagctctc 120

ctccaacaca tcatcgacaa gcaccttttt tgccggagta tgacggtgac gatatattca 180

attgtaaatg gcttcatgtc cgggaaatct acatggatca gcaatgagta tggtggtcaa 240

tatggagaaa aagaaagagt aattaccaat tttttttcaa ttcaaaaatg tagatgtccg 300

cagcgttatt ataaaatgaa agtacatttt gataaaacga caaattacga tccgtcgtat 360

ttataggcga aagcaataaa caaattattc taattcggaa atctttattt cgacgtgtct 420

acattcacgt ccaaatgggg gcttagatga gaaacttcac gatttggcgc gccaaagctt 480

actcgaggtc attcatatgc ttga 504。

2.权利要求1所述的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因的提取方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取转基因玉米Mon88017基因组DNA：采用Dra I、EcoR V、Pvu II、Stu I四种限制性内切酶进行充分酶切，并对酶切产物进行纯化；

(2)引物设计：利用BD GenomeWalker试剂盒提供的接头引物AP1和AP2，其序列分别为：

AP1：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；

AP2：5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′；

另外，参照Mon88017插入载体结构序列设计引物序列如下：

P-ractgsp1：5′-CTTTAGGACTTTAGGGGTTGTT-3′；

P-ractgsp2：5′-GGACTATCCCGACTCTCTTC-3′；

(3)以转基因玉米MON88017基因组酶切产物为模板进行两轮PCR扩增：引物对AP1和P-ractgsp1用于第一轮PCR反应，扩增体系20μL，PCR程序为94℃25s，72℃3min，6个循环；94℃25s，64℃30s，36个循环；64℃延伸7min，1个循环；引物对AP2和P-ractgsp2用于第二轮PCR，在第二轮PCR中用1μL第一轮扩增产物的50倍稀释液作为模板，PCR扩增体系和反应程序与第一轮PCR相同；第二轮PCR产物即为转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因。

3.权利要求1所述的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因应用于特异性定性检测玉米及相关产品是否含有MON88017转化事件。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：定性检测时，方法如下：

Mon88017-F：5′-TCCTGAACCCCTAAAATCCC-3′；

Mon88017-R：5′-TTTCTCATCTAAGCCCCCAT-3′；

(3)上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品含有MON88017转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MON88017转化事件。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中PCR程序为：95℃5min预变性；94℃30s，58℃30s，72℃30s，36个循环；72℃延伸7min。

6.权利要求1所述的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因应用于特异性定量检测玉米及相关产品是否含有MON88017转化事件及其含量。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：定量检测时，方法如下：

(1)建立MON88017转化体特异性引物的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线：

(2)提取纯化待检测样品基因组DNA，然后向基因组DNA提取液中分别加入MON88017的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物及探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MON88017基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相对应的拷贝数，则转基因玉米MON88017基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MON88017的百分含量。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)③中，MON88017基因的特异性引物和荧光标记探针是根据转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因序列设计的，具体如下：

Mon88017-F1：GGACATGAAGCCATTTACAATTGA；

Mon88017-R1：GCTCTCCTCCAACACATCAT；

Mon88017-Probe：FAM-ATATCGTCACCGTCATACTCCGGCAA-TAMRA。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)③中，扩增的参数如下：扩增反应体积为50μl，2×Premix Ex Taq25μl，浓度10μmol/L的Forward Primer2μl，浓度10μmol/L的Reverse Primer2μl，浓度10μmol/L的TaqMan Probe2μl，50×ROXReference Dye 1μl，DNA模板2.0μl，ddH2O16μl；扩增反应条件：95℃预变性30S，95℃变性5S，60℃退火/延伸31S，共计40个循环。