CN103525810B

CN103525810B - 转植酸酶基因玉米外源基因插入位点旁侧序列及检测方法

Info

Publication number: CN103525810B
Application number: CN201310430113.0A
Authority: CN
Inventors: 张大兵; 杨立桃; 石建新; 郭金超; 饶军
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: CN103525810A

Abstract

本发明公开了一种转植酸酶基因玉米外源基因插入位点旁侧序列及检测方法，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。所述检测方法包括以下步骤：提取玉米基因组DNA模板；依据SEQ？ID？No.1中1～3655bp位序列设计正向引物，依据SEQ？ID？No.1中3656～5299bp位序列设计反向引物；配制PCR反应体系；进行PCR扩增反应；将扩增产物在琼脂糖胶上电泳，若能够扩增出206bp产物，则样品为转植酸酶基因玉米BVLA430101。本发明能够高效、灵敏、准确地鉴定植酸酶基因玉米BVLA430101，以及以转植酸酶基因玉米BVLA430101为亲本的玉米品系。

Description

转植酸酶基因玉米外源基因插入位点旁侧序列及检测方法

技术领域

本发明涉及一种转基因植物外源基因插入位点旁侧序列及检测方法，具体涉及一种转植酸酶基因玉米外源基因插入位点旁侧序列及检测方法。

背景技术

玉米是世界粮食三大主力作物之一，是重要的粮食作物和重要的饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物。随着现在生物技术的发展，转基因玉米也迅猛增加。自从1996年转基因作物大规模商业化种植以来，转基因玉米成为世界上第二大已商业化转基因作物，截止到2012年底，全球已有28个国家共种植了25种转基因作物，种植面积达到1亿7千3百万公顷，其中转基因玉米种植面积超过5500万公顷，占玉米种植面积的35%。尽管我国目前还没有批准转基因玉米的种植，但已批准了国外9个转基因玉米品系进口用作加工原料。

2009年8月，我国批准了自主研发的转植酸酶基因玉米BVLA430101的安全生产证书。它是通过基因枪转化法将黑曲霉中的植酸酶基因转入到玉米中，经过多代筛选培育而成的。转入植酸酶基因的目的是降解玉米中大量含有的植酸，释放可被动物利用的无机磷，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本，减少动物粪、尿中磷的排泄，减轻环境污染，具有广阔的应用前景。Chen等2008年报道了转植酸酶基因玉米研发所采用的启动子、终止子和目的基因(RumeiChen，GuangxingXue，etal.Transgenicmaizeplantsexpressingafungalphytasegene.TransgenicRes.2008，17：633-643.)，但并没有提供外源基因整合位点、旁侧序列以及相应的特异性检测方法等信息。对转基因检测来说，外源基因整合位点及旁侧序列至关重要。2010年，谢家建等人报道了转植酸酶基因玉米BVLA430101完整表达框序列以及构建PCR方法（专利公开号为CN101792811A，公开日为2010年08年04），同时他们揭示了该玉米品系转化体外源插入片段的5’端旁侧序列，并基于此序列信息建立了PCR定性检测方法（专利公开号为CN10172812A，公开日为2010年08年04）。然而，目前为止还没有任何文献报道该玉米品系外源插入片段的3’端旁侧序列及其基于此序列信息建立的3’端品系特异性PCR定性检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体外源插入片段的3’端旁侧序列，并依据该3’端旁侧序列建立了3’端品系特异性定性PCR检测方法，该检测方法能够快速、准确、灵敏地鉴定出转植酸酶基因玉米BVLA430101，以及以转植酸酶基因玉米BVLA430101为亲本的衍生品种。

本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：一种转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：一种转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体品系特异性定性PCR检测方法，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米基因组DNA模板；

步骤2，依据SEQIDNo.1中1～3655bp位序列设计正向引物，依据SEQIDNo.1中3656～5299bp位序列设计反向引物；

步骤3，配制PCR反应体系，包括以下组分：所述正向引物、所述反向引物、TaqDNA聚合酶，10×PCRBuffer，dNTP，所述玉米基因组DNA模板；

步骤4，将所述PCR反应体系进行PCR扩增反应；

步骤5，将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，若能够扩增出206bp的产物，则样品为转植酸酶基因玉米BVLA430101。

优选的，步骤2中，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

更优选的，步骤3中，所述反应体系包括以下组分：10μM的所述正向引物1μL、10μM的所述反向引物1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5μL含Mg²⁺的10×PCRBuffer、2.5mmol/L的dNTP2.5μL、20ng/μL的所述玉米基因组DNA模板1μL，加灭菌蒸馏水补足体积至25μL。

最优选的，步骤4中，所述PCR扩增反应的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃，7min。

优选的，所述琼脂糖凝胶为2%（wt）的琼脂糖凝胶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体外源插入片段的3’端旁侧序列以及依赖其建立品系特异性PCR方法，通过使用常规的PCR仪器和试剂能够高效准确地鉴定植酸酶基因玉米BVLA430101，以及以转植酸酶基因玉米BVLA430101为亲本的玉米品系。该方法具有方便快捷、灵敏度高、特异性强的优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为转植酸酶基因玉米BVLA430101的3’端分子特征示意图及其所设计的引物位置；

图2为植酸酶基因表达框的扩增结果；

图3为转植酸酶基因玉米BVLA430101的3’端旁侧序列特异性扩增结果；

图4为转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001）中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1、转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体3’端旁侧序列的克隆

1实验材料

1.1植物材料

转植酸酶基因玉米BVLA430101及其受体，（审批编号：农基安证字（2009）第074号，中国农业科学院生物技术研究所研发），可向公众发放用于实验研究；

1.2酶与试剂

植物DNA提取：应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制生产的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA；dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNAMarker等购自大连宝生物工程有限公司；随机引物，Taqman探针及引物由上海英骏生物技术有限公司合成；

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯；

1.3实验仪器

PCR扩增仪：MJResearch,Waltham,MA,USA

核酸电泳仪：MajorScienceMP250V/300V型电泳仪

DNA测序仪：AppliedBiosystem377型全自动荧光序列分析仪

DNA电泳分析系统：EC3ImagingSystem,UVPInc.USA

其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等；

2实验方法和过程

2.1玉米基因组DNA提取与检测

2.1.1玉米基因组DNA提取

(1)取适量样品放入1.5ml的Eppendorf管中；加入600μlBufferA，轻轻混匀后，65℃水浴保温30min，13200rpm离心10min，取上清于另一Eppendorf管；

(2)在管中加入等体积酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)，混匀静置10min，13200rpm离心10s，吸取上清到一新的Eppendorf管中；

(3)加入等体积BufferB，轻轻混匀放置10s，13200rpm离心10min,去上清，保留沉淀；

(4)将Eppendorf管倒置室温条件下晾干，加入100μlBufferC，于37℃烘箱中30min，溶解沉淀；

(5)向溶解液中加入500μlBufferD，混匀，将溶液吸入离心柱中，再将离心柱放入套管中，放置2min；

(6)同套管一起离心，8000rpm30s后，弃去套管中溶液，向离心柱中加入200μlWashBufferI，8000rpm离心，30s后，弃去溶液；

(7)在离心柱中加入200μlWashBufferI，8000rpm离心，30s后，弃去溶液；

(8)在离心柱中加入200μlWashBufferII，8000rpm离心，30s后，弃去溶液；

(9)在离心柱中加入200μlWashBufferII，12,000rpm离心60s，弃去溶液；

(10)将离心柱放置在一个新的Eppendorf管中，加入50μlElutionBuffer，放置2min后，12000rpm离心30s；离心管中的溶液即可作为PCR反应的模板，保存在-20℃；

2.1.2DNA检测

取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量，采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度；

2.2转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列的克隆

2.2.1Genomewalking初步分离转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列

Genomewalking是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，本实施例采用Genomewalking的方法初步获得转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列，具体步骤参照GenomeWalkerTMUniversalKit(Takara大连公司)试剂盒说明，所设计的引物有34个，具体位置见图1，PCR产物扩增产物在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收扩增片段，连接到pGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer进行序列测定，采用软件VectorNTI10.0(Invitrogen)对测定的序列进行拼接和分析，在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中用BLASTN检索相似的基因组序列；

通过使用引物PF13和PF14（序列见表1）进行Genomewalking扩增得到转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列L3(见图1)，用于后续的TAIL-PCR旁侧序列的扩增；

表1Genomewalking引物

引物	序列(5’to3’)
		PF13	SEQ ID No.4
PF14	SEQ ID No.5

2.2.2TAIL-PCR法进一步获得转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列

热不对称交错PCR（ThermalAsymmetricinterlacedPCR，简称TAIL-PCR）技术由Liu和Whitter首先发表，是使用最广泛的用于分离与已知DNA序列邻近的未知序列的分子生物技术。TAIL-PCR技术的主要原理是利用已知序列，设计3条嵌套的特异性引物(specialprimer,简称sp1，sp2，sp3)，分别和1个退火温度较低的随机引物(Arbitrarydegenerateprimer，简称AD)组合，进行热不对称PCR反应，该反应产物有3种类型：①由特异性引物和随机引物扩增的产物（I型）；②由特异性引物扩增的产物（II型）；③由随机引物扩增的产物（III型）；TAIL-PCR包括3次连续的PCR反应；经过第一次反应，II型产物在3种产物中最多，I型产物稍低，经过第二次反应，I型产物增加到最多，II型产物基本不变，III型产物仍然很低，第三次反应之后，基本只有I型产物，即通过3次PCR反应可得到所需的目的产物，而非目的产物也得以消除；

TAIL-PCR的反应程序和体系见表2～4，所使用的引物序列和位置见表5和图1；

表2TailPCR第一轮反应程序

表3TailPCR第二轮和第三轮反应程序

表4TailPCR反应体系

PCR试剂	体积(μl)
		10×PCR缓冲液	5
2mmol/L dNTP	8
		10μmol/L目标引物	1
10μmol/L随机引物	10
		5U/μl Taq DNA聚合酶	0.5
模板DNA	3
		双蒸水	加至50

表5TAIL-PCR引物

引物	序列(5’to3’)
		TAIL2-AD-2F	SEQ ID No.6
TAIL-L3-2F	SEQ ID No.7
		TAIL-L3-3F	SEQ ID No.8
AD1	SEQ ID No.9
		AD2	SEQ ID No.10
AD3	SEQ ID No.11
		AD4	SEQ ID No.12
AD5	SEQ ID No.13
		AD6	SEQ ID No.14
AD7	SEQ ID No.15
		AD8	SEQ ID No.16

PCR产物扩增产物在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收扩增片段，连接到pGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer进行序列测定，采用软件VectorNTI10.0(Invitrogen)对测定的序列进行拼接和分析，在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中用BLASTN检索相似的基因组序列；

经过TAIL-PCR法扩增得到转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列，如SEQIDNO1所示(另见图1)；

2.2.3转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列的验证

在植酸酶基因表达框的启动子区域设计正向引物3'-3F，L3区域（见图1）设计反向引物Chr3-L3-R，见表6，引物组合扩增转植酸酶基因玉米BVLA430101基因组中的植酸酶基因表达框序列；

在植酸酶基因表达框的终止子区域设计正向引物TAIL2-AD-2F，在玉米基因组区域设计反向引物Insert-L3long-2R，见表6，引物组合扩增转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体外源插入片段的旁侧序列；

表6转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列的验证引物

引物	序列(5’to3’)
		3'-3F	SEQ ID No.17
Chr3-L3-R	SEQ ID No.18
		TAIL2-AD-2F	SEQ ID No.19
Insert-L3long-2R	SEQ ID No.20

反应体系：0.25μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)，2.5μL10×PCRBuffer（Mg²⁺Plus），2.5μLdNTP（各2.5mmol/L），引物各1μL（10μmol/L），模板各1μL（20ng/μL），加灭菌蒸馏水补足体积至25μL；

扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃7min；

经以上两对引物组合分别扩增转植酸酶基因玉米BVLA430101，获得了转基因玉米植酸酶基因完整表达框和外源插入片段的旁侧序列长度分别为3013bp和1858bp，见图2和图3，经拼接获得了转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性序列，其长度为5299bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；

通过序列分析得出，该序列的1-1070bp位置为LEGpromoter区域；1071-2420bp位置为植酸酶基因序列，2421-3218bp为LEGterminator区域，3219-3465bp为骨架序列(lacoperonsequencefrompGEM-5Zf(+)，3465-3604bp为H2B启动子区域，3605-3655bp位为骨架序列(lacoperonsequencefrompGEM-5Zf(+)，3656-5399bp为玉米组序列（chr3196142361-196144004）。

实施例2、转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性的定性PCR鉴定方法

1实验材料

1.1植物材料

转植酸酶基因玉米BVLA430101及其受体，（审批编号：农基安证字（2009）第074号，中国农业科学院生物技术研究所研发）；

转基因玉米种子样品（BT11，MON863，MON810，TC1507），转基因棉花种子样品（MON88913，MON1445），转基因大豆种子样品（RRS，MON89788），转基因油菜（Topas），转基因水稻种子样品（TT51，Kefeng6）；

1.2酶与试剂

见实施例1中的酶与试剂；

1.3实验仪器

见实施例1中的实验仪器；

2实验方法和过程

2.1玉米基因组DNA提取与检测：见实施例1中的玉米基因组DNA提取与检测；

2.2转植酸酶基因玉米BVLA430101的转化体品系特异性定性PCR方法

本发明的PCR方法应用于鉴定种子样品中是否含有转植酸酶基因玉BVLA430101，采用引物ES-qual-1F/ES-qual-2R（序列见表7），检测包括其他转基因玉米、大豆、水稻、棉花、油菜等13个样品；

扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃，7min；

PCR产物扩增产物在2%的琼脂糖胶上进行电泳，见图4，实验结果表明，转植酸酶基因玉米BVLA430101能够特异性扩增出206bp的产物，而且其它13个种子样品中均未扩增出相同大小的片段，也即本发明的PCR方法适用于鉴别样品中是否含有转植酸酶基因玉米BVLA430101。

表7转植酸酶基因玉米BVLA430101的转化体品系特异性定性PCR引物

引物	序列(5’to3’)
		ES-qual-1F	SEQ ID No.2
ES-qual-2R	SEQ ID No.3

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体外源插入片段的旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列为BVLA430101转化体外源插入片段的3’端旁侧序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体品系特异性定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米基因组DNA模板；

步骤3，配制PCR反应体系，包括以下组分：所述正向引物、所述反向引物、TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、dNTP、所述玉米基因组DNA模板；

步骤4，将所述PCR反应体系进行PCR扩增反应；

步骤5，将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，若能够扩增出206bp的产物，则样品为转植酸酶基因玉米BVLA430101；

步骤2中，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤3中，所述反应体系包括以下组分：10μM的所述正向引物1μL、10μM的所述反向引物1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5μL含Mg²⁺的10×PCRBuffer、2.5mmol/L的dNTP2.5μL、20ng/μL的所述玉米基因组DNA模板1μL，加灭菌蒸馏水补足体积至25μL。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤4中，所述PCR扩增反应的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃，7min。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤4中，所述琼脂糖凝胶为质量百分数为2％的琼脂糖凝胶。