CN111334506A - 转基因玉米ztao5-1外源插入旁侧序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因玉米ZTAO5‑1外源插入旁侧序列及其应用。所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了用于检测该旁侧序列的引物对，引物序列分别如SEQ ID No：4‑5和SEQ ID No：6‑7所示的核苷酸序列。本发明的转基因玉米ZTAO5‑1外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于对转基因玉米ZTAO5‑1包括亲本、杂种F1和后代，及其植株、组织、种子及其制品的检测。

Description

转基因玉米ZTAO5-1外源插入旁侧序列及其应用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种转基因玉米ZTAO5-1外源插入旁侧序列及其应用。

背景技术

玉米是重要的饲料原料，约占饲料组分的二分之一，玉米中维生素E含量相对较低，尤其是高活性的α-生育酚的含量很低，饲料中必须外源添加合成的DL-α-生育酚醋酸酯才能满足动物的营养需求。但合成的DL-α-生育酚醋酸酯一方面是活性远远低于天然的维生素E，另一方面其在动物体内的生物利用率也很低。因此，提高饲料原料-玉米中的维生素E含量将对饲料工业具有重要的意义。

另外，磷是动物生长、发育、繁殖所必需的重要矿物元素。植酸磷(六磷酸肌醇)，是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，是动物饲料中的重要成分。但是由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶，导致以植酸磷形式存在的磷不能被直接利用，其利用率仅有0-40％，从而在饲养过程中造成了许多问题：一、磷源浪费。首先是饲料中磷源不能得到有效利用；其次，为了满足动物对磷的需求，实际生产中要在饲料中额外添加无机磷，因此提高了饲料成本。二、形成的高磷粪便污染环境。饲料中85％左右的植酸磷不能被动物有效利用而直接排出体外，造成严重的土壤和水源磷污染，引发例如水环境的富营养和藻类过度生长等不良情况。三、植酸磷是抗营养因子，在动物胃肠道的消化吸收过程中与钙及其它多种金属离子、蛋白质和一些营养物质结合，形成不易被单胃动物吸收和利用的鏊合物，不但造成磷源浪费而且影响了这些营养物质特别是钙离子的吸收利用，不仅增加了饲料成本还降低了动物生产性能。因此，将植酸酶基因转入饲料原料中，使得动物在消化过程中自动利用植酸酶将植酸磷降解成可利用的无机磷。因此，提高饲料原料-玉米中的植酸酶含量将对饲料工业具有重要的意义。

维生素E合成途径中的关键酶基因γ-生育酚甲基转移酶基因(ZmTMT)能将低活性的γ-生育酚转化为高活性的α-生育酚；植酸酶基因(phyA2)能够分解植酸为肌醇衍生物和无机磷。将ZmTMT基因和phyA2基因转移到饲料用玉米品种中，并在玉米中高效表达，培育富含维生素E和植酸酶的玉米品种，可以大大提高植物中高活性的α-生育酚的含量以及植酸酶的含量；而且富含维生素E和植酸酶的转基因玉米可直接应用于动物饲料中，来满足动物对维生素E和无机磷的需求，而无需在饲料中外源添加维生素E和磷酸氢钙或添加通过发酵技术生产的植酸酶添加剂，大大降低了饲料的生产成本，还能缓解因动物不能利用有机磷产生高磷粪便造成的环境污染。

每一个转基因事件都是唯一的，每一个转基因事件所作出的转基因品种都是唯一的，而转基因食品又是关系国计民生的大事，其育种、售卖的过程中必须要经过PCR验证，在这个过程中必定会产生巨大的商机，对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于耐除草剂品质性状改良转基因玉米事件ZTAO5-1外源插入载体旁侧序列和利用此序列建立事件特异性定性、定量PCR检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因玉米ZTAO5-1外源插入片段旁侧序列及其应用。

本发明另一目的在于提供一种转基因玉米ZTAO5-1的PCR检测方法及试剂盒。

本发明的转基因玉米ZTAO5-1培育方法包括如下步骤：将目的玉米基因组第8号染色体的第8179701353位，得到转基因玉米；

所述外源DNA片段含有包括ZmTMT、phyA2和Bar三个基因的表达盒，10419bp；

所述转基因玉米的品质(高α-生育酚和高植酸酶酶活)优于非转基因玉米，和/或所述转基因玉米的耐草铵膦的能力高于非转基因玉米。

上述方法中，所述玉米ZmTMT基因全长1059bp，编码352个氨基酸，蛋白分子量约38.4kDa，ZmTMT基因的表达能够催化γ-生育酚转化为α-生育酚，从而大幅度提高转基因植物中高活性的维生素E组分的含量，可以直接应用于饲料生产，而不用外源添加合成的DL-α-生育酚醋酸酯。

所述黑曲霉phyA2基因全长1350bp，编码449个氨基酸，蛋白分子量约53.95kDa，phyA2基因的表达能够分解植酸为肌醇衍生物和无机磷，从而增加了动物可利用的无机磷的含量，可以直接应用于饲料生产，而不用外源添加磷酸氢钙或者微生物来源的植酸酶。

所述耐草铵膦基因Bar为来自吸水链霉菌的耐草铵膦基因全长552bp，编码183个氨基酸，蛋白分子量约20.6kDa，它可使除草剂草铵膦乙酰化，抑制草铵膦的活性，最终达到耐草铵膦的效果。

进一步的，所述外源DNA片段依次由所述耐草铵膦基因Bar表达盒、所述的黑曲霉phyA2基因表达盒以及所述玉米ZmTMT表达盒组成。

所述玉米ZmTMT表达盒依次由玉米胚特异启动子13387、玉米ZmTMT基因和玉米球蛋白基因终止子Glb1 Term构成。其中启动子13387来自玉米本身，大小为1908bp，驱动目的基因主要在籽粒的胚中表达。终止子Glb1 Term来自玉米本身，大小为1004bp，终止ZmTMT基因转录。

所述黑曲霉phyA2表达盒依次由玉米胚乳特异启动子123387、黑曲霉phyA2基因和玉米LEG1 Term构成。其中启动子123387来自玉米本身，大小为2000bp，驱动目的基因主要在籽粒的胚乳中表达。终止子LEG1 Term来自玉米本身，大小为801bp，终止phyA2基因转录。

所述耐草铵膦基因Bar表达盒依次由CaMV35S启动子、耐草铵膦基因Bar和CaMVpolyA终止子构成。其中CaMV35S启动子来自花椰菜花叶病毒CaMV，大小为781bp，驱动植物耐草铵膦基因Bar的表达。CaMV polyA同样来自于花椰菜花叶病毒CaMV，大小为209bp，终止Bar基因转录。

更进一步的，所述外源DNA片段的核苷酸序列具体如SEQ ID NO：3所示。利用上述方法获得玉米转化事件ZTAO5-1为将SEQ ID NO：3所示的外源DNA片段插入目的玉米基因组第8号染色体的第8179701353位，替换掉第8179701353-8179701503位间131bp的碱基序列后得到的转基因玉米。且自第8179701353位上游且紧邻第8179701353位核苷酸的上游旁侧序列如SEQ ID NO：1所示，自第8179701503位下游且紧邻第8179701503位核苷酸的下游旁侧序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述玉米转化事件ZTAO5-1是将phyA2基因表达盒和ZmTMT基因表达盒连接入pCAMbia3301载体，和载体自带的Bar基因的表达盒在同一个T-border内，利用农杆菌介导法侵染玉米幼胚，以BASTA作为选择压力，对转化的材料进行筛选培养从而获得转基因幼苗。通过分子生物学分析，phyA2基因、ZmTMT基因和Bar基因均在转基因植株中高表达，并且α-生育酚含量和植酸酶酶活都得到了提高；进一步通过回交转育得到了转基因纯系种子。

上述方法中，所述目的玉米可为玉米郑58。

本发明提供的用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的方法包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，所述DNA片段A依次由上游旁侧序列、上述外源DNA片段和下游旁侧序列组成；

若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为所述转基因玉米或其后代；

若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为所述转基因玉米或其后代；

上述用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的方法为如下1)或2)：

1)直接测序；

2)用引物对甲和/或引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若引物对甲扩增得到大小为928bp的条带和/或引物对乙扩增得到大小为675bp的条带，则所述待测植物样品为所述转基因玉米或其后代；否则，所述待测植物样品不为所述转基因玉米或其后代；

所述引物对甲由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子组成；

所述引物对乙由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子组成。

本发明提供的用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的试剂盒其包括由上述引物对甲和引物对乙组成的成套引物对和/或由上述探针甲和探针乙组成的成套探针。

与现有技术相比，本发明的优异效果主要体现在：本发明提供了优良的转化事件ZTAO5-1，所述转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有高α-生育酚含量、高植酸酶酶活以及耐除草剂草铵膦的能力；外源基因在受体玉米中能够稳定遗传；外源基因的表达可提高α-生育酚含量、植酸酶酶活以及对除草剂草铵膦的抗性，且与野生型玉米农艺性状无明显差异。本发明通过重测序方法得到了耐除草剂品质性状改良的转基因玉米事件ZTAO5-1的两端旁侧序列，根据这两个旁侧序列的序列信息，设计了两对特异性PCR引物并建立针对转基因玉米ZTAO5-1或其后代的检测方法。本发明提供了旁侧序列和特异性引物对适用于对转基因玉米ZTAO5-1或其后代的检测。

附图说明

图1为载体3301-phyA2-ZT的构建图谱；

图2为转基因株系ZTAO5-1的5’侧翼序列特异PCR检测结果M：1kb DNAmarker；K-为阴性对照郑58；1,2分别为以转基因株系ZTAO5-1的两个世代BC5F1和BC5F2的DNA为模板，以特异引物对甲为引物的扩增片段；上样量：M：5μL；K-，1，2：PCR产物5μL+Loading 5μL。

图3为转基因株系ZTAO5-1的3’侧翼序列特异PCR检测结果M：1kb DNAmarker；K-为阴性对照郑58；1，2分别为以转基因株系ZTAO5-1的两个世代BC5F1和BC5F2的DNA为模板，以特异引物对乙为引物的扩增片段；上样量：M：5μL；K-，1，2：PCR产物5μL+Loading 5μL。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；pCAMBIA3301质粒为澳大利亚CAMBIA的产品，含有一个来自吸水链霉菌的耐除草剂草铵膦基因Bar表达盒(CaMV35S启动子-Bar基因-CaMV35S polyA)。

实施例1、转3301-phyA2-ZT玉米的获得、维生素E含量和植酸酶酶活测定一、转3301-phyA2-ZT玉米的获得

1、含有外源基因的质粒载体的获得

构建流程如下：EcoRI和BstEII双切pCAMBIA3301，获得线性化的载体骨架。设计带有与载体骨架同源的序列的引物，分别以质粒pSP-ZmTMT和质粒pEU13387G3为模板，PCR扩增获得ZmTMT基因片段(含有ZmTMT基因序列和Glb1终止子序列)和13387启动子序列。然后通过无缝克隆技术将ZmTMT基因片段和13387启动子序列重组到3301载体骨架上，得到3301-13387-ZT质粒载体。

然后PmeI酶切处理3301-13387-ZT，得到线性的3301-13387-ZT。设计带有与线性的3301-13387-ZT序列同源的序列的引物，以质粒pPHP20754-phyA2和pUM3G-123387为模板，PCR扩增获得phyA2基因片段(含有信号肽SP，靶向液泡序列VTS，phyA2基因序列以及LEG1终止子)和123387启动子序列。再通过无缝克隆技术将phyA2基因片段和123387启动子序列重组到3301-13387-ZT载体上，得到3301-phyA2-ZT质粒载体。3301-phyA2-ZT质粒载体图谱如图1所示。用于玉米转化的质粒载体3301-phyA2-ZT的具体组成元件名称、位置如表1所示。

2、重组菌的获得

将步骤1获得的重组载体3301-phyA2-ZT导入农杆菌EHA105中，得到重组菌。

3、转3301-phyA2-ZT玉米的获得

采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化玉米HiII幼胚，得到T0代转3301-phyA2-ZT玉米，具体步骤如下：

(1)将步骤2获得的重组菌(含有3301-phyA2-ZT的农杆菌EHA105)在YEP固体培养基上涂布，28℃下暗培养1～3天。将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，调OD₆₀₀至0.2，制成侵染液备用；

(2)取授粉后9～12天的玉米HiII幼穗，剥去苞叶，次氯酸钠消毒30min，剥取幼胚于装有2mL重悬液的离心管中，每管100个幼胚，备用；

(3)侵染时弃尽重悬液，加入2mL侵染液，温和颠倒离心管数次混匀，室温暗处静置5min。侵染结束后，幼胚盾片朝上接种于共培养基中，20℃暗培养3天。转至恢复培养基中，28℃暗培养7天。再转至含有草铵膦的选择培养基中筛选培养，每两周继代一次；

(4)经过两个月的选择培养后，抗性愈伤组织在选择培养基上生长迅速，颜色新鲜。再将抗性愈伤组织转到再生培养基上，即可得到成熟的胚状体。将胚状体放到MS培养基上生根，即得到再生玉米幼苗。将幼苗转入培养瓶中促根壮苗。10天后将幼苗移栽入营养钵，室内温室中培养。待幼苗长出1～2片新叶后移入大花盆，转移至大型温室，以后按照常规方法进行日常管理即可。

通过农杆菌介导法获得了14个T0代转3301-phyA2-ZT玉米株系，经过PCR鉴定出阳性植株，与郑58杂交得到F1，然后郑58回交5代，再自交1代，得到BC5F2。

表1 3301-phyA2-ZT载体各元件信息表

二、转3301-phyA2-ZT玉米株系ZTAO5-1的维生素E含量和植酸酶酶活测定

对BC5F2代转3301-phyA2-ZT玉米株系ZTAO5-1中维生素E含量和植酸酶酶活进行测定。

BC5F2世代的维生素E含量测定结果显示：转基因株系ZTAO5-1中的维生素E含量显著高于对照材料郑58；郑58籽粒中维生素E的组分以γ-生育酚的含量为最高，约为2.2mg/100g。而ZTAO5-1中以α-生育酚的含量最高，相对于郑58提高了近7倍(2.8mg/100gvs.0.4mg/100g)。这表明ZmTMT基因在玉米体内能正常发挥其功能，将低活性的γ-生育酚转为了高活性的α-生育酚(表2)。

BC5F2世代的植酸酶酶活测定结果显示：对照植株郑58中植酸酶酶活极低，而转基因植株中植酸酶酶活达到了10000U/kg以上(表3)。饲料中700U/kg-1000U/kg即能满足动物的需要，本材料完全能达到生产应用的目的。

表2转基因株系ZTAO5-1中维生素E含量测定(单位：mg/100g)

编号	δ-生育酚	γ-生育酚	α-生育酚	总生育酚
					郑58	0.274±0.104	2.004±0.218	0.418±0.212a	2.696±0.257
ZTAO5-1	0.252±0.089	0.421±0.049	2.278±0.306b	2.951±0.196

表3转基因株系ZTAO5-1中植酸酶酶活测定(单位：U/kg)

编号	植酸酶酶活
		郑58	57.33±3.29a
ZTAO5-1	10878.25±12.34b

实施例2、转基因株系ZTAO5-1的侧翼序列分析及特异性PCR检测

利用重测序方法和PCR技术检测外源目的基因在玉米基因组中的整合，发现插入序列整合在玉米染色体上。利用插入序列和侧翼序列的引物对对两个世代(BC5F1和BC5F2)进行特异PCR检测(表4-表6)，表明插入序列是以整合形式存在。

通过全基因组重测序方法初步确认ZTAO5-1的外源基因插入玉米基因组的8号染色体的>chromosome:B73_RefGen_v4:8179701353位置。经特异PCR测序验证，ZTAO5-1事件的旁侧序列如下，其左旁侧序列如SEQ ID NO：1所示，其右旁侧序列如SEQ ID NO：2所示，特异性PCR检测的引物对甲由SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子组成，特异性PCR检测的引物对乙由SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子组成。

表4引物序列

表5 PCR反应体系

组分	用量
		10×PCR Buffer(with MgCl<sub>2</sub>)	1μL
dNTP(2.5mM)	0.2μL
		Left primer(10μM)	0.2μL
Right primer(10μM)	0.2μL
		Taq polymerase(5U/μL)	0.1μL
DNA(50ng/μL)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	7.3μL
TotaL	10μL

表6 PCR反应条件

	循环数	时间	温度
				变性	1	3min	94℃
变性	35	30s	94℃
				退火	35	40s	58℃
延伸	35	40s	72℃
				延伸	1	10min	72℃
保存	-	-	4℃

PCR反应结束后，制作1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物点样电泳25min，用凝胶成像系统观察结果并拍照(图2，图3)。

利用设计的特异性PCR检测引物，以转基因玉米ZTAO5-1、阴性对照为模板，进行一次扩增，3次重复PCR结果一致，结果表明该引物能特异性检测转基因玉米ZTAO5-1及其后代。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 转基因玉米ZTAO5-1外源插入旁侧序列及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 191

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 1

acgacacgac actcggcaaa ggtataaact ttttatgcgt caatttatat ttattattga 60

ttagatgata gaatgtataa atcatgtaag ccaaggtcac ccaaccattt ataaacttgt 120

tactatgtgc atgtcagcca tcgtgctgtt agttttattt gcaagtttta aaaacctcaa 180

cgtacagggg a 191

<210> 2

<211> 436

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 2

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<210> 3

<211> 10419

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 3

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gctggtgaca atcctactca tcctttgtaa tcctctacgc gtagttgatt ggttagatgt 3240

caaccccctc tctaagtggc agtagtgggc ttggttatac ctgctagtgc ctggggatgt 3300

tctatttttc ttgtagtgct tgatcaaaca ttgcatagtt tgacttggga caaactgtct 3360

gatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 3420

ttagggcaga gggagcagta agaacttatt gagaaatgta atcatttgtt aaaaaaggtt 3480

taattttgct gctttctttc gttaatgttg ttttcacatt agattttctt tgtgttatat 3540

acactgaata catacaaatt cagttgcagt agtctcttaa tccacatcag ctagtcatac 3600

tttagcaaaa gcaaattaca caaatctggt gtggctgtcg tcacattctc aataaactcg 3660

tcatgtttta ctaaaagtac cttttcgaag catcatatta atccgaaaac agttggggaa 3720

gtctccaaat ctgaccaaat gccaagtcat tgtccagctt atcaaagcat ccaactttca 3780

gttttgcatg tgccagaaat tgtttttcat ctacatggcc attgttgact gcatgctggt 3840

cacaaatttc gatggcccca cgccgcctgc tcgtcctcgc cgtcgtcgcc ctcgcggcca 3900

ccgccgccgc ggccaactcc ggcttcgcgg actcgaaccc gatccgcccc gtcaccgacc 3960

gcgcggcctc cgcgctcgag ggatcaatgc tggcagtccc cgcctcgaga aatcagtcca 4020

cttgcgatac ggtcgatcag gggtatcaat gcttctcgga gacttcgcat ctttggggcc 4080

aatacgcgcc gttcttttct ctggcaaaca aatcggccat ctcccctgat gttcccgccg 4140

gatgccaagt cactttcgct caggttctct cccgccatgg agcgcggtat ccgaccgact 4200

ccaagggcaa gaaatactcc gctctcatcg aggagatcca gcagaacgcg actaccttca 4260

aggagaaata tgccttcctg aagacataca actacagcct gggcgcggat gacctgactc 4320

cctttggaga gcaggagctg gtcaactccg gcgtcaagtt ctaccagcga tacgagtcgc 4380

tcacaagaaa cattgtcccg ttcatccgat cctcaggctc cagccgcgtg attgcctctg 4440

gcaataaatt catcgagggc taccagagca ctaagctgaa ggatcctcgt gctcagcccg 4500

gccaatcgtc gcccaagatc gacgtggtca tttcagaggc cagcacatcc aacaacactc 4560

tcgatccggg cacctgcacc gttttcgaag atagcgaatt ggccgatgac atcgaagcca 4620

atttcaccgc cacgttcgtc ccttccattc gtcaacgtct ggagaacgac ttgtctggcg 4680

tgactctcac ggacacagaa gtgacctacc tcatggacat gtgctccttc gacaccatct 4740

ccaccagcac cgtcgacacc aagctgtccc ccttctgtga cctgttcacc catgaagaat 4800

ggatcaacta cgactacctc cagtccctga acaaatacta cggccatggc gcaggtaacc 4860

cgctcggccc gacccagggc gtcggctacg ctaacgagct catcgcccgt ctcacccact 4920

cgcctgtcca cgatgacacc agctccaacc acacattgga ctccaacccg gctactttcc 4980

cgctcaactc cactctctat gcggactttt cgcatgataa cggcatcatc tctatcctct 5040

ttgctttggg tctgtacaac ggcaccaagc cgctgtcctc cacgaccgcg gagaatatca 5100

cccagaccga tgggttctca tctgcctgga cggttccttt cgcgtcgcgc atgtacgtcg 5160

agatgatgca atgccagtct gagcaggagc ctttggtccg tgtcttggtt aatgatcgcg 5220

ttgttccgct gcatggctgt ccggttgatg ctttggggag atgtacgcgg gatagcttcg 5280

tgaagggttt gagctttgcc agatctggcg gtgattgggc ggagtgtttt gcttagccta 5340

ggcccgggag atccgcacaa cctcagagtg atctgcctga ataagtactc gtagactgta 5400

ataattaaac aaagcttgct catggttaaa ctgcgtgttg attagtcttt caactacata 5460

gctctaaagt ttttgataca ccgagtgatt tgccaggaaa aaaatgagca gattgttgta 5520

agcaaaacat gtttgttatg gctaaactgc atgtctacct ggatttgtat tttttttcaa 5580

ctacctagtt catctgataa aaacaattta gttgagtaac atactaacat ttcaaatgaa 5640

aatttattcc aaggcaaaca tatccaaact atctaaaata catgtggctc tggaagatag 5700

gggagtgaaa gcatttagga gcaggtaact gagtacaata tatccatgca ccatctgaat 5760

gaactactac ctaaggttaa agcttgaact tccccatgac tgcattgaaa ctaaaggaca 5820

acagatcacc ctcatatatc tacatatcca aacctaaata aaggtcaatc ttcatctggt 5880

gtttcctcat cgtcatcatt gttgccatat ctccagccat cttcaatgtt gttgcctcca 5940

tcttcttccg tctcttcact atcatcttgg tacgtagctt tacctggcca ctggttcctg 6000

acgccaatgt cagaaggcat tgctctcgaa accttggcat tgtaggcttt ggatgagtgg 6060

accttgtgcc catgattcgt cttgctcctt ttggggtttg gtgcaatctc gccaacctcg 6120

gcatagttat actggtttaa acaaggaaca tcttaggaag tgtttttaca tgctacattt 6180

tggtggattt tatataaccg tttttacata catacaaccc tatacatata tcagagttca 6240

gtttgattcc tccgttacaa accaactaaa tgcagcagac tcctcctcga gctcgaggtc 6300

ccccatgttg aaatattaga cattttctag attaaattcc gaatataaat cacgaccgtc 6360

aaatcatatg atacatattg atcagacata ctggtagacc acgcgagccg aaagcaacag 6420

ggtcgacgat gtcgaagcag cggggccgat gaagtcgaag cagtttggtc gatgacaaga 6480

tcgcgagcag tcgcgtgatg acgctcacta aaaaccttat tcgccctctc ccgatgcaag 6540

atctcgaatg cgaaaggttc tggagacctg ctctcctgaa cgcagatgca cgtcggcgat 6600

cgggatggcg gcgcagttgt gagcagaggt gaaaacctaa tttgtgttgg gattgacgct 6660

aggcgcctta tatagggcag tgtccgcgaa ccgataacga ttcgcgatcc gatctacacg 6720

ttatctacga attgatagac tcgcgttccg ttcagatcct tatcgcgatc ggttagggct 6780

ctaaacagcg gggccgatga agtcgaagca gcagggtcga cgacaagatc gcgagcagtc 6840

gcgtgatgac gcttactaaa aaccttattc gccctctccc gatgcaagat ctcgaatgcg 6900

aagggttccg gagacctgct ctcctgaacg cagatgcacg tcggcgattg ggatggcggc 6960

gcagttgtga gcagagggcc ttatataggg ccgtgtccgc gaaccgataa cgatccgcga 7020

tccgatctac atgttatcta cgaatcgata gactcgcgtt ccgttcagat ccttatcgcg 7080

atcggttagg gctctaactt aacagccaag caaccgccct ggcccggcga ggcgagcgcg 7140

tgtggttctc cacactctct cctctcatcc atgacttgtt gagtgagtgt agcatccata 7200

tttaaactag ttccactcca cttggactag caatatggca ctatatgttc caccattccc 7260

tagccatacc atacatgggt ttttgagatt tttttagaat ttaattaaat ttctcaattg 7320

agtctagccc ataaatccaa cacgatataa gtctatctgt cgctggtaga ttgagagagg 7380

atgtgtgcat gtctgtaaat aaaaaaagtt gtttttacac ataaattgcg ctatgacttt 7440

acatgaaata aattttctaa aatttaaaac ttacataagt aaaaaaaaat ataaagaagg 7500

aaagaaacac gacatggaaa aaatctctcg ttgttttata tggatgcaac agctgcagtc 7560

cccgtgcaag cgatgctcat ccgttcccat ggcgtgcacg gcccagaaac gacacgcttc 7620

acctactttc ttccctgcca ccacacccac cgtccaccca caccacaccg cgcgccacgc 7680

gcccacggca cctcggctca gtgtcgtcgc atgtcgctca cgtactgtcg cagaactcac 7740

accgtcacac ggtgcctgct atctagctaa tgctgctagc agccatgtca caccgatata 7800

acccggccac cgcgcgccgc gccacgtcgc catgcacgcg gccacgtccc ccatcgatcg 7860

acgtcgtcct cctcatcctg gctcctccgg atccatcccc gcgctcctat aaatacctcg 7920

tctcatgctc ggccatgtac atcgacccag ccatctcctc accctcgttc accacacagt 7980

ccgccactcc tttagtagct tgtgatttgt acgtcgacga gatcactggt cgggtggcgg 8040

acgacgacac atcgcaaatt tggtcatggc tcacgcggcg ctgctccatt gctcccagtc 8100

ctccaggagc ctcgcagcct gccgccgcgg cagccactac cgcgcccctt cgcacgtccc 8160

gcgccactcc cgccgtctcc gacgcgccgt cgtcagcctg cgtccgatgg cctcgtcgac 8220

ggctcaggcc cccgcgacgg cgccgccggg tctgaaggag ggcatcgcgg ggctgtacga 8280

cgagtcgtcg gggctgtggg agaacatctg gggcgaccac atgcaccacg gcttctacga 8340

ctcgagcgag gccgcctcca tggccgatca ccgccgcgcc cagatccgca tgatcgagga 8400

ggcgctcgcc ttcgccggtg tcccagcctc agatgatcca gagaagacac caaaaacaat 8460

agtcgatgtc ggatgtggca ttggtggtag ctcaaggtac ttggcgaaga aatacggagc 8520

gcagtgcact gggatcacgt tgagccctgt tcaagccgag agaggaaatg ctctcgctgc 8580

agcgcagggg ttgtcggatc aggttactct gcaagttgct gatgctctgg agcaaccgtt 8640

tcctgacggg cagttcgatc tggtgtggtc catggagagt ggcgagcaca tgccggacaa 8700

gagaaagttt gttagtgagc tagcacgcgt ggcggctcct ggagggacaa taatcatcgt 8760

gacatggtgc cataggaacc tggatccatc cgaaacctcg ctaaagcccg atgaactgag 8820

cctcctgagg aggatatgcg acgcgtacta cctcccggac tggtgctcac cttcagacta 8880

tgtggacatt gccaagtcac tgtctctcga ggatatcaag acagctgact ggtcggagaa 8940

cgtggccccg ttttggcccg ccgtgataaa atcagcgcta acatggaagg gcttcacctc 9000

tctgctgacg accggatgga agacgatcag aggcgcgatg gtgatgccgc taatgatcca 9060

gggctacaag aagggcctca tcaaattcac catcatcacc tgtcgcaagc ctggagccgc 9120

gtagacgagc tcgccaaaac gagcaggaag caacgagagg gtggcgcgcg accgacgtgc 9180

gtacgtagca tgagcctgag tggagacgtt ggacgtgtat gtatatacct ctctgcgtgt 9240

taactatgta cgtaagcggc aggcagtgca ataagtgtgg ctctgtagta tgtacgtgcg 9300

ggtacgatgc tgtaagctac tgaggcaagt ccataaataa ataatgacac gtgcgtgttc 9360

tataatctct tcgcttcttc atttgtcccc ttgcggagtt tggcatccat tgatgccgtt 9420

acgctgagaa cagacacagc agacgaacca aaagtgagtt cttgtatgaa actatgaccc 9480

ttcatcgcta ggctcaaaca gcaccccgta cgaacacagc aaattagtca tctaactatt 9540

agcccctaca tgtttcagac gatacataaa tatagcccat ccttagcaat tagctattgg 9600

ccctgcccat cccaagcaat gatctcgaag tatttttaat atatagtatt tttaatatgt 9660

agcttttaaa attagaagat aattttgaga caaaaatctc caagtatttt tttgggtatt 9720

ttttactgcc tccgtttttc tttatttctc gtcacctagt ttaattttgt gctaatcggc 9780

tataaacgaa acagagagaa aagttactct aaaagcaact ccaacagatt agatataaat 9840

cttatatcct gcctagagct gttaaaaaga tagacaactt tagtggatta gtgtatgcaa 9900

caaactctcc aaatttaagt atcccaacta cccaacgcat atcgttccct tttcattggc 9960

gcacgaactt tcacctgcta tagccgacgt acatgttcgt tttttttggg cggcgcttac 10020

tttcttcccc gttcgttctc agcatcgcaa ctcaatttgt tatggcggag aagcccttgt 10080

atcccaggta gtaatgcaca gatatgcatt attattattc ataaaagagg tgacccagct 10140

cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg 10200

ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta 10260

acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat 10320

acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg 10380

cggtgtcatc tatgttacta gatcgggaat taaactatc 10419

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcggtctgc accatcgtc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgacacgac actcggcaaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttaagattg aatcctgttg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtgcttctt tgtgaacttt aa 22

Claims (10)

1.一种转基因玉米ZTAO5-1外源插入旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述转基因玉米ZTAO5-1外源插入旁侧序列，其特征在于，所述外源插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求2所述转基因玉米ZTAO5-1外源插入旁侧序列，其特征在于，所述外源插入片段中包括玉米ZmTMT基因、黑曲霉phyA2基因和耐草铵膦Bar基因。

4.权利要求1或2所述转基因玉米ZTAO5-1外源插入旁侧序列和外源插入片段在检测转基因玉米ZTAO5-1中的应用。

5.用于扩增权利要求1-3任一所述的DNA片段的特异性引物对。

6.用于检测转基因玉米ZTAO5-1的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4-5或SEQ ID NO：6-7所示。

7.用于检测转基因玉米ZTAO5-1的试剂盒，其他特征在于，含有权利要求5或6所述的特异性引物对。

8.权利要求5或6所述的特异性引物对在检测转基因玉米ZTAO5-1亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。

9.一种检测转基因玉米ZTAO5-1的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求书5或6所述的特异性引物对进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。

10.如权利要求9所述的检测转基因玉米ZTAO5-1的方法，其特征在于，当采用核苷酸序列如SEQ ID NO：4-5所示的特异性引物对对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为928bp，则待测样品含有ZTAO5-1来源的成分；

当采用核苷酸序列如SEQ ID NO：6-7所示的特异性引物对对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为675bp，则待测样品含有ZTAO5-1来源的成分。

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