CN113817768A - 改良水稻温敏不育系的方法及应用和重组载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了改良水稻温敏不育系的方法，包括：结合CRISPR/Cas9方法，获取到育性调控基因纯合突变的完全不育水稻植株；将野生型育性调控基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育恢复基因构建入一个表达载体中，得到四元互补载体；将四元互补载体转化入完全不育水稻植株中，得到育性恢复的转基因互补植株；转基因互补植株自交获取种子，表现外源报告基因性状的种子作为繁殖系种子，未表现出性状的种子作为不育系种子。本发明公开了改良的水稻温敏不育系在水稻杂交制种中的应用。本发明还公开了重组载体。本发明可从根本上解决两系不育系育性受环境影响而打摆子的问题，实现两系杂交水稻到第三代杂交水稻的过渡。

Description

改良水稻温敏不育系的方法及应用和重组载体

技术领域

本发明属于水稻杂交制种技术领域，涉及一种改良水稻温敏不育系的方法及其应用和重组载体。

背景技术

杂种优势利用是提高水稻产量最重要的途径，两系法杂交稻是利用光温敏不育系水稻为基本材料培育的。两系法杂交稻具有育性受核基因控制，配组不受恢保关系限制，配组自由；种子繁育程序简单，成本低；稻种资源利用率高，选育出优良组合机率高等优点。两系法杂交水稻技术将我国水稻亩产由700公斤提高到988公斤，为保障我国的粮食安全做出了巨大贡献。但是由于温敏不育系育性受外界环境条件的影响，两系法杂交稻制种存在风险。

发明内容

本发明的一个目的克服现有技术的不足，并提供至少后面将说明的优点。

本发明另一个目的是提供改良水稻温敏不育系的方法。

本发明还有一个目的提供改良的水稻温敏不育系在水稻杂交制种中的应用。

本发明再有一个目的提供重组载体。

为此，本发明提供的技术方案为：

改良水稻温敏不育系的方法，包括如下步骤：

步骤一、结合CRISPR/Cas9方法，将负载有育性调控基因靶位点序列的pCBSG打靶载体转化入温敏不育系水稻植株中，并得到育性调控基因纯合突变基因的水稻植株，该水稻植株表现为完全不育；

步骤二、将野生型育性调控基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育恢复基因构建入一个表达载体中，得到四元互补载体；

步骤三、将所述四元互补载体转化入步骤一得到的水稻植株中，得到育性恢复的转基因互补植株、可繁殖生产改良的水稻不育系；

使该育性恢复的转基因互补植株自交收获种子，其中，表现外源报告基因相应性状的种子，长成的植株可育，作为繁殖系种子，未表现出外源报告基因相应性状的种子，其长成的植株不可育，作为不育系种子，用于杂交种生产。

优选的是，所述的改良水稻温敏不育系的方法中，所述育性基因为CYP703A3、CYP704B2、EAT1基因中的任意一种，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种，所述花粉致死基因为ZmAA1基因，所述温敏不育恢复基因为TMS5基因。

优选的是，所述的改良水稻温敏不育系的方法中，步骤二中，将如SEQ ID NO：1所示的野生型育性调控基因CYP703A3表达元件、如SEQ ID NO：2所示的荧光蛋白基因表达元件、如SEQ ID NO：3所示的花粉致死基因表达元件和如SEQ ID NO：4所示的温敏不育恢复基因TMS5表达元件构建入所述四元互补载体中，

所述四元互补载体为pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-TMS5-ZmAA1。

优选的是，所述的改良水稻温敏不育系的方法中，步骤一中，所述育性调控基因为CYP703A3，

获得育性调控基因纯合突变基因的转基因植株的具体方法包括如下步骤：

1.1)分析野生型水稻染色体上CYP703A3基因的上下游序列区域，取GTTCACCTTGCCTATGGGTG编辑位点，以野生型水稻基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示的引物对进行扩增，并将扩增产物片段连接到打靶载体pCBSG上，得到pCBSG-03A3重组载体；

1.2)打靶重组载体pCBSG-03A3载体转化温敏不育系水稻，并对再生植株进行转基因检测和突变位点分析，筛选出CYP703A3基因突变杂合植株，对CYP703A3基因突变杂合植株进行低温处理，使其育性恢复，自交一代收获种子，之后在T1代对突变位点和潮霉素基因进行检测分析，获得CYP703A3基因纯合突变的不含潮霉素基因的不育系水稻植株，其中，所述低温处理为：在植株花粉母细胞减数分裂时期，利用冷水灌溉进行，并于温度23℃左右处理7-10天。

优选的是，所述的改良水稻温敏不育系的方法中，构建所述四元互补载体的具体方法包括如下步骤：

2.1)以pMD18T-DsRed原始克隆为模板，以如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对进行PCR扩增，并将扩增产物片段连接到载体pCAMBIA1300上，得到pCAMBIA1300-DsRed重组载体；

2.2)将ZmAA1基因片段连接到载体pCAMBIA1300-DsRed得到pCAMBIA1300-DsRed-ZmAA1重组载体；

2.3)以水稻品种Y58S基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对进行PCR扩增，利用同源重组方法，把育性基因CYP703A3基因全长插入载体中，获得pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1重组载体；

2.4)以水稻品种9311的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对进行PCR扩增，利用同源重组方法，把育性基因TMS5基因全长序列全长插入pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1重组载体中，获得所述四元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1。

优选的是，所述的改良水稻温敏不育系的方法中，步骤三中，利用农杆菌介导进行所述四元互补载体的遗传转化，具体包括如下步骤：

利用不育突变体幼穗诱导愈伤组织，利用农杆菌介导所述四元互补载体遗传转化，获得育性恢复的转基因植株。

优选的是，所述的改良水稻温敏不育系的方法中，所述温敏不育系水稻为隆科638S、爽1S或Y58S品系。温敏不育系不局限于这几个品种，目前生产上推广的以tms5基因为温敏基因的不育系都适用本发明。

改良的水稻温敏不育系在水稻杂交制种中的应用，所述改良的水稻温敏不育系由任一所述的方法获得。

重组载体，所述重组载体负载有野生型不育调控基因基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育基因。

本发明至少取得了如下有益效果：

本发明通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对两系不育系的育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)进行定点编辑，创制温敏不育基因tms5与育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)的双突变体；构建包含育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)、温敏不育恢复基因TMS5、花粉致死基因ZmAA1以及荧光标记基因DsRed2的四元互补载体，转化不育双突变体，创制出育性恢复的繁殖系，用于不育双突变体的批量繁殖。不育双突变体，育性稳定，可直接用于杂交水稻配组和生产。本发明可从根本上解决两系不育系育性受环境影响而打摆子的问题，实现两系杂交水稻到第三代杂交水稻的过渡。

定义

为了便于理解本发明，定义了大量术语和短语

术语“基因”是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列成为结构基因，本发明中所称的基因为结构基因。

“野生型基因”是指一种从来源中分离的基因，本发明的“野生型基因”是首先利用水稻不育突变体通过图位克隆方法得到突变基因的位置，然后从水稻野生型中获得该位置处的对应的基因的序列，即为“野生型基因”。而“突变的基因”是指一种基因，与“野生型基因”相比，其具有序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。

水稻温敏不育系表现为高温下不育，低温下可育。安农S-1是于1987年被发现的第一个籼稻温敏不育系，其温敏不育性由隐性基因tms5控制。研究发现TMS5编码一个保守的RNase ZS1。tms5一个SNP的突变导致编码蛋白提前终止，使RNase ZS1功能丧失，从而造成温敏不育性状。目前，温敏不育系在两系杂交稻育种中得到广泛利用。

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的DNA里一个称CRISPR的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，利用Cas9蛋白将病毒的DNA切断而使之失效。CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的sgRNA(guide RNA)来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。

“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用“质粒”和“载体”。

“重组载体”是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中改良水稻温敏不育系的方法的流程图。

图2为pCBSG载体的质粒图谱。

图3为本发明其中一个实施例中打靶载体pCBSG-03A3载体转化温敏不育系水稻获得的4个转基因株系的碱基突变双峰图。

图4中，A图照片展示不育双突变体植株表现为无花粉败育，B图照片为温敏不育系不育类型表现为典败。

图5为pCAMBIA1300载体的质粒图谱。

图6为pUC57-ZmAA1载体的质粒图谱。

图7为pJIT163载体的质粒图谱.

图8为本发明其中一个实施例中转基因互补植株分子鉴定凝胶电泳图；

图9为本发明的不育双突变体植株和转基因互补植株的表型图，A为转基因植株表型无花粉性败育图，B为转基因互补植株育性恢复，镜检显示一半花粉可育图，C为转基因互补植株在激发光下的荧光表现图，D为转基因互补植株育性恢复可正常结实图，E为转基因互补植株自交种子去壳后的分型图，F为转基因互补植株种子的电镜图。

图10为本发明其中一个实施例中获得的转基因互补植株的无荧光种子植株的表型分析图，其中，A图展示温敏不育系败育类型为典败，B图展示不育双突变体为无花粉型败育。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对两系不育系的育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)进行定点编辑，创制温敏不育基因tms5与育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)的双突变体；构建包含育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)、温敏不育恢复基因TMS5、花粉致死基因ZmAA1以及荧光标记基因DsRed2的四元互补载体，转化不育双突变体，创制出育性恢复的繁殖系，用于不育双突变体的批量繁殖。不育双突变体，育性稳定，可直接用于杂交水稻配组和生产。该发明可从根本上解决两系不育系育性受环境影响而打摆子的问题，实现两系杂交水稻到第三代杂交水稻的过渡。

如图1所示，本发明提供改良水稻温敏不育系的方法，包括如下步骤：

步骤一、结合CRISPR/Cas9方法，将负载有育性调控基因靶位点序列的pCBSG打靶载体转化入温敏不育系水稻植株中，并得到育性调控基因纯合突变基因的水稻植株，该水稻植株表现为完全不育；

步骤二、将野生型育性调控基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育恢复基因构建入一个表达载体中，得到四元互补载体；

步骤三、将所述四元互补载体转化入步骤一得到的水稻植株中，得到育性恢复的转基因互补植株、可繁殖生产改良的水稻不育系；

使该育性恢复的转基因互补植株自交收获种子，其中，表现外源报告基因相应性状的种子，长成的植株可育，作为繁殖系种子，未表现出外源报告基因相应性状的种子，其长成的植株不可育，作为不育系种子，用于杂交种生产。

在上述方案中，作为优选，所述育性基因为CYP703A3、CYP704B2、EAT1基因中的任意一种，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种，所述花粉致死基因为ZmAA1基因，所述温敏不育恢复基因为TMS5基因。

在上述方案中，作为优选，步骤二中，将如SEQ ID NO：1所示的野生型育性调控基因CYP703A3表达元件、如SEQ ID NO：2所示的荧光蛋白基因表达元件、如SEQ ID NO：3所示的花粉致死基因表达元件和如SEQ ID NO：4所示的温敏不育恢复基因TMS5表达元件构建入所述四元互补载体中，

所述四元互补载体为pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-TMS5-ZmAA1。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤一中，所述育性调控基因为CYP703A3，获得育性调控基因纯合突变基因的转基因植株的具体方法包括如下步骤：

1.1)分析野生型水稻染色体上CYP703A3基因的上下游序列区域，取GTTCACCTTGCCTATGGGTG编辑位点，以野生型水稻基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示的引物对进行扩增，并将扩增产物片段连接到打靶载体pCBSG上，得到pCBSG-03A3重组载体；

1.2)打靶重组载体pCBSG-03A3载体转化温敏不育系水稻，并对再生植株进行转基因检测和突变位点分析，筛选出CYP703A3基因突变杂合植株，对CYP703A3基因突变杂合植株进行低温处理，使其育性恢复，自交一代收获种子，之后在T1代对突变位点和潮霉素基因进行检测分析，获得CYP703A3基因纯合突变的不含潮霉素基因的不育系水稻植株，其中，所述低温处理为：在植株花粉母细胞减数分裂时期，利用冷水灌溉进行，并于温度23℃左右处理7-10天。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，构建所述四元互补载体的具体方法包括如下步骤：

2.1)以pMD18T-DsRed原始克隆为模板，以如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对进行PCR扩增，并将扩增产物片段连接到载体pCAMBIA1300上，得到pCAMBIA1300-DsRed重组载体；

2.2)将ZmAA1基因片段连接到载体pCAMBIA1300-DsRed得到pCAMBIA1300-DsRed-ZmAA1重组载体；

2.3)以水稻品种Y58S基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对进行PCR扩增，利用同源重组方法，把育性基因CYP703A3基因全长插入载体中，获得pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1重组载体；

2.4)以水稻品种9311的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对进行PCR扩增，利用同源重组方法，把育性基因TMS5基因全长序列全长插入pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1重组载体中，获得所述四元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤三中，利用农杆菌介导进行所述四元互补载体的遗传转化，具体包括如下步骤：

利用不育突变体幼穗诱导愈伤组织，利用农杆菌介导所述四元互补载体遗传转化，获得育性恢复的转基因植株。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述温敏不育系水稻为隆科638S、爽1S或Y58S品系。温敏不育系并不局限于这几个品种，目前生产上推广的以tms5基因为温敏基因的不育系都适用本发明。

本发明还提供了改良的水稻温敏不育系在水稻杂交制种中的应用，所述改良的水稻温敏不育系由任一所述的方法获得。

本发明还提供了重组载体，所述重组载体负载有野生型不育调控基因基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育基因。

为使本领域技术人员更好地理解本发明，现提供如下的实施例：

本发明首先利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对两系不育系材料的CYP703A3(04B2、EAT1)等育性调控基因进行定点编辑，创制温敏不育基因TMS5与CYP703A3(CYP704B2、EAT1等)等育性调控基因的双突变体；然后构建包含育性调控基因、温敏育性基因、花粉致死基因以及荧光标记基因的四元互补载体，转化不育双突变体，创制出育性恢复的繁殖系，用于不育双突变体的批量繁殖。不育双突变体，育性稳定，不受环境条件影响，主要农艺性状与原来的两系不育系一致，可直接用于杂交水稻制种生产。该发明可从根本上解决两系不育系育性受环境影响而打摆子的问题。

本发明提供一种改良水稻温敏不育系的方法，包括如下步骤：

步骤一、结合CRISPR/Cas9方法，将构建得到的负载有育性基因但不限于CYP703A3靶位点序列的打靶载体pCBSG-03A3并将其转化入温敏不育系水稻植株中，并得到CYP703A3纯合突变基因的水稻植株，该水稻植株完全不育；

步骤二、将野生型育性调控基因但不限于CYP703A3基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育基因构建入一个表达载体中，得到四元互补载体；作为优选，为将野生型育性调控基因但不限于CYP703A3基因表达元件、如SEQ ID NO：2所示的荧光蛋白基因表达元件、如SEQ ID NO：3所示的花粉致死基因表达元件和如SEQ ID NO：4所示的温敏不育恢复基因TMS5表达元件构建入所述四元互补载体中。

步骤三、将所述四元互补载体转化入所述但不限于CYP703A3基因纯合突变的水稻植株中，得到育性恢复的转基因互补植株、可繁殖生产改良的水稻不育系；

使该育性恢复的转基因互补植株自交收获种子，其中一半种子带荧光，长成的植株可育，作为繁殖系种子，另一半种子无荧光，其长成的植株不可育，作为不育系种子，用于杂交种生产。

其中，步骤一：

温敏不育系水稻(638S、爽1S、Y58S等)CYP703A3基因的定点编辑，获得CYP703A3基因纯合突变的温敏不育系水稻材料。

编辑位点设计：

编辑位点：GTTCACCTTGCCTATGGGTG(SEQ ID NO：13)

引物合成

Upper Primer:5’-TGGCGTTCACCTTGCCTATGGGTG-3’(SEQ ID NO：5)

Lower Primer:5’-AAACCACCCATAGGCAAGGTGAAC-3’(SEQ ID NO：6)

打靶载体构建：

退火和连接

a)将正向和反向引物溶于ddH₂O至10μM，各取1μL加入8μL退火缓冲液

(TE+50mM NaCl)中，用移液器混合。

b)在PCR仪上运行如下退火程序：95℃至16℃缓慢冷却，速度为0.1℃/s。

c)取1μL退火产物，与BsaI(NEB)消化的pCBSG载体进行10μL连接反应。

pCBSG载体的质粒图谱如图2所示。

连接反应体系：退火产物1μL、BsaI酶切载体1μL、10×T4 buffer 1μL和T4 ligase

0.5μL，加入H₂O至10μL，在25℃下连接2小时。

连接产物转化大肠杆菌，通过菌落PCR和测序验证载体pCBSG-03A3的连接。

打靶载体pCBSG-03A3载体转化温敏不育系水稻(638S、爽1S、Y58S等)，对再生植株进行转基因检测和突变位点分析。

突变位点分析

靶位点：GTTCACCTTGCCTATGGGTG(SEQ ID NO：13)

转基因株系1、转基因株系2、转基因株系3、转基因株系4的突变双峰分别如图3所示。

对CYP703A3基因突变杂合植株在花粉母细胞减数分裂时期，利用冷水灌溉进行23度低温处理，时间为7-10天，使其育性恢复，收获种子，在T1代利用引物GP3814-F:ATGGCCCCCTGGTCTATCTT(SEQ ID NO：14)，GP3814-R:GAAGGCCCCAAGAACCTCTC(SEQ ID NO：15)和hyg-F:ACCTGCCTGAAACCGAACTG(SEQ ID NO：16)，hyg-R:CTGCTCCATACAAGCCAACC(SEQID NO：17)分别对突变位点和潮霉素基因进行检测分析，获得CYP703A3基因纯合突变不含潮霉素的不育系水稻植株，突变体植株完全不育。镜检表型照片如图4所示。

步骤二，构建四元互补载体，包含CYP703A3、花粉致死基因ZmAA1、红色荧光蛋白基因DsRed2、温敏不育基因TMS5四个表达元件。

载体构建流程：

1、DsRED2全长扩增(1860bp)

RED-F：GAATTCAACCGTCTCTTCGTGAGAATAACC(EcoRI)(SEQ ID NO：7)

RED-R：GGTACCCTTAAGAAACACACCTAGACTAGATTTG(KpnI)(SEQ ID NO：8)

以实验室已有pMD18T-DsRed原始克隆为模板，通过PCR克隆到T载体上，测序后通过EcoRI和KpnI酶切连接到pCAMBIA1300(如图5所示)上，获得载体pCAMBIA1300-DsRed。

2、已有的ZmAA1原始克隆载体为pUC57上，基因本身5端有一个SphⅠ限制性内切酶酶切位点，如图6所示：

通过HindⅢ和SphⅠ双酶切，把ZmAA1基因连接到载体pJIT163(如图7所示)上，即pJIT163-ZmAA1。

3、ZmAA1基因通过HindⅢ和XhoⅠ部分酶切pJIT163-ZmAA1，HindⅢ和XhoⅠ酶切p1300-DsRed。(XhoⅠ和SalⅠ为同尾酶)。回收ZmAA1片段连接到pCAMBIA1300-DsRed上,获得载体pCAMBIA1300-DsRed-ZmAA1。

4、利用引物：03a3-inf-F:5-CCATGATTACgaattGGGATGGGTGTTTGACTCTG-3(SEQ IDNO：9)3a3-inf-R:5-AGAGACGGTTgaattCCTGTGCTCACTCGGAAG-3(SEQ ID NO：10)

以水稻品种Y58S基因组DNA为模板，扩增CYP703A3基因全长序列，利用EcoR1单酶切载体pCAMBIA1300-DsRed-ZmAA1，使其线性化，利用同源重组方法，把育性基因CYP703A3全长插入载体中，获得载体pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1。

5，利用引物：

TMS5-HB-F：GGTGTGTTTCTTAAGCCTGTTAACCGGTTGAGGTG(SEQ ID NO：11)

TMS5-HB-R：CCGGGTACCCTTAAGACGTCGTCAACAACGACTAC(SEQ ID NO：12)

扩增TMS5基因全长序列，利用AflⅡ单酶切载体pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1，使其线性化，利用同源重组方法，把育性基因CYP703A3全长插入载体中，获得四元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-TMS5-ZmAA1。

步骤三：CYP703A3基因纯合突变的温敏不育系水稻植株的遗传转化，由于突变体完全不育，所以必须利用幼穗诱导愈伤组织，利用农杆菌介导进行pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-TMS5-ZmAA1四元互补载体的遗传转化。转基因植株育性恢复，一半种子带荧光，为繁殖系种子；一半种子不含荧光，为不育系种子，与野生型的温敏不育系水稻种子表型一致，但是育性为完全不育，不受外界环境条件影响，可直接用于杂交种的生产。

幼穗愈伤组织诱导

各种水稻组织培养基配方

诱导培养基NB：

N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 0.1mg/L，蔗糖33.5g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。

继代培养基J3：

MS大量盐分，10倍B5微量盐分，J3铁盐FeSO₄·7H₂O 41.8mg/L，Na₂EDTA 55.9mg/L，DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100mg/L)，谷胺酰氨0.3g/L，脯氨酸0.5g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。

共培养基NBM：

N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，水解酪蛋白0.8g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，乙酰丁香酮0.1mM，调节pH5.6。

筛选培养基J3S：继代培养基J3，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素50mg/L。

预分化培养基Y：

N6大量，CuSO₄ 3mg/L，N6铁盐，B5维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 3mg/L，NAA 1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉8.5g/L，pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。

分化培养基D：

N6大量盐分，10倍B5微量盐分，D铁盐(FeSO₄·7H₂O)55.9mg/L，Na₂EDTA 74.5mg/L，DL维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.8g/L，BA 2mg/L，IAA 0.2mg/L，NAA0.2mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。

生根培养基R：

MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，琼脂粉8g/L，pH6.0。

幼穗愈伤组织诱导

在不育水稻幼穗发育的4-5期，取材幼穗(含叶鞘)后用湿润纱布包裹在4度冰箱放置一周左右，然后用体积分数为75％的乙醇在叶鞘表面灭菌，每消毒一层，剥离一层，直至露出幼穗，然后将幼穗接种到诱导培养基上(NB)，尽量让每个小花接触培养基。每皿2-3穗，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，转到继代培养基J3上，继代培养1～2次，每次20天。

遗传转化

划LB平板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan 50mg/L+CHL34mg/L+RIF 50mg/L)全皿，28℃培养48小时备用，将农杆菌洗到50mL液体的共培养基(NBM+As0.1mM)中，调OD600＝0.5；从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移至菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。无菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天；3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。如图2所示。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S；结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx，3～7天陆续有愈伤组织变绿；将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基；当分化出的绿苗高约5～8cm时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。3～4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。

转基因植株分子鉴定

水稻DNA提取

取水稻幼嫩叶片，剪碎，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mL Eppendorf管中；加入800μL的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB缓冲液在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μL)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；小心吸取上清液，加入0.7倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μL去离子水(含RNase)中，于37℃处理15min，-20℃或者-70℃下保存备用。

通过PCR技术，利用红色荧光基因特异引物

DsRed-F:ATGGCCTCCTCCGAGAACGT(SEQ ID NO：18)

DsRed-R:CTACAGGAACAGGTGGTGGC(SEQ ID NO：19)

对获得的转基因再生植株进行分子鉴定，

PCR扩增体系及程序如下：10×Buffer溶液5μL、NTP 4μL、Tap DNA聚合酶0.5μL、primer-F(10pmol)2μL、primer-R(10pmol)2μL、模板1μL、dH₂O 35.5μL，总反应体积50μL。反应程序：94℃预变性5min；PCR扩增：然后以94℃变性，40s；53℃退火，40s；72℃延伸，1min；共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。电泳检测PCR结果。

结果表明在22株再生苗中，有5株阳性植株如图8所示。

由于利用温敏不育系生产杂交种存在风险，本发明针对温敏不育系进行改良升级。发明核心为四元互补载体，包括CYP703A3基因、TMS5温敏不育基因、ZmAA1花粉致死基因以及荧光报告基因DsRed2。

CYP703A3属于细胞色素P450羟化酶，在水稻花药表皮角质层和花粉外壁的发育过程中发挥重要作用，CYP703A3基因突变会导致水稻花药表面角质层和花粉外壁发育缺陷，角质单体和蜡组分的含量明显减少，花药发育异常，不能形成成熟花粉粒，表现雄性不育，本发明中以CYP703A3基因为靶标，通过基因组编辑技术，将温敏不育系改造成普通核不育材料，并通过互补载体恢复功能。

TMS5编码一个保守的RNA酶ZS1，tms5基因中一个SNP的突变导致编码蛋白提前终止，使RNase ZS1功能丧失，从而造成温敏不育性状，该基因在水稻杂交育种中发挥着非常重要的作用，目前生产上广泛应用的温敏不育系都是由于TMS5基因天然突变创制的材料。本发明中四元互补载体上有TMS5完整表达元件，消除繁殖系的温敏不育性。

ZmAA1基因来源于玉米，编码一个α淀粉酶，在本发明中，利用花粉特异启动子PG47和信号肽序列，精准调控ZmAA1基因在水稻花粉表达，蛋白产物进入淀粉体影响花粉淀粉积累引起花粉败育，可防止转基因花粉逃逸。

红色荧光蛋白基因DsRed2在糊粉层特异启动子调控下，荧光蛋白在种子糊粉层累积，转基因种子带荧光，可通过色选机分选。

转基因表型分析

转基因阳性植株与温敏不育系在主要农艺性状上保持一致，但育性恢复如图9所示，收获种子包含两种类型，一种为不含荧光种子，植株不育，可用于杂交种生产；一种为有荧光种子，植株可育，可用于不育系种子的繁殖。

无荧光种子植株的表型分析

无荧光种子不含互补载体，为不育双突变体，与温敏不育系相比，育性败育更彻底，镜检结果显示为无花粉性败育，而温敏不育系表现为花粉典败如图10所示。不育双突变体与恢复系杂交可生产水稻杂交种，用于生产。不育双突变体与温敏不育系基本农艺性状一致，但是败育更彻底，稳定，育性不受外界环境影响，杂交制种安全。

本发明的改良水稻温敏不育系的方法，通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对两系不育系的育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)进行定点编辑，创制温敏不育基因tms5与育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)的双突变体；构建包含育性调控基因(CYP703A3、CYP704B2、EAT1)、温敏不育恢复基因TMS5、花粉致死基因ZmAA1以及荧光标记基因DsRed2的四元互补载体，转化不育双突变体，创制出育性恢复的繁殖系，用于不育双突变体的批量繁殖。不育双突变体，育性稳定，可直接用于杂交水稻配组和生产。该发明可从根本上解决两系不育系育性受环境影响而打摆子的问题，实现两系杂交水稻到第三代杂交水稻的过渡。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 改良水稻温敏不育系的方法及应用和重组载体

<130> 2020

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4434

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

gggatgggtg tttgactctg ccgttcacac ttctttggta tcgatgtatg caaaatgtgg 60

aaggttggct gaggcttatc atgttttctc aagcattagc aacccaagcc ttattgctat 120

taattctatg attacagcat ttgtgcaaca tggtttcgtt gaagatgcgc tgaaactatt 180

taccaaaatg caaaatgctg gatacaagcc taatcatgtt acatttttag gaattctgac 240

tggttgcgca cgtgctggtt ttgttcaaca aggttacaac tactttgaat caatgagacc 300

agtttatggt gtagagccaa accctgagca ctacacatgt atggttgatc ttttaggtcg 360

tgcaggcctc cttgctgaag cactggaaat gattaactca atgccccaga atgatcattc 420

tgatgcatgg gcagctttgc tcagtgctag tagtctccat tctaatctcg cttttgcaaa 480

aatagcagca cagaagcttc ttgagaagga tccttacgat gcaacggctt acacagtcct 540

gtcaaggatg ttctcctcag cagggatgga ggatgaagaa atgctaaaag ttgtacagct 600

atccaacttg gccagtaaga ggcctggtta tagccttatt atgcaggata aggccactga 660

aatataacac atactgagaa ccttctagtt gactagttct agatctctga ccgatgaaaa 720

caagaatgat catgttacat ggcactgcta aatgagaatt aggatggcat aaaaaagata 780

tcacatgact tgtacataat gcctaaaatg tggatatctg accaggtgct tggtgatatg 840

ctgttggccc agaactcgag atccattttt ctggcaggtc cttatttctt ataggattaa 900

gtttgtccat tttgatgcag ctgagttttc acccttaact atgaaatcat ctaacttgca 960

ctcttcaact accaaaatgg gcacaaataa ctccttttca ccacaaaaaa atgtcttatt 1020

tggccagaat aacactggtg gttttaaggg taggggttac actgattttg atagttaaag 1080

ggtgaacaat agatcctttc ttttctgagg gtaacaatta gatagtattg tagttcatga 1140

atttacagta tttgttattt aagacctgtc ataatcttta tattgattcc atcttctttt 1200

taaagtttag acagtaaatg gaagattgat acacggaatt catctgctac aggaaagcat 1260

tgaagaatag ttgtattgtt ggttgctgtt tgcttaaatt caagaacatt tatgcaggag 1320

attgtcttcc gatcatcaat tgatgaagaa gccagttcat gagtcatgtc tgcatgttat 1380

ttgtggtaga tgaagtagga gatgtattct aaatagctac catcaagata cagtcatgtt 1440

gacaggaaaa ggcagagcac caatcgtcaa tagtataatc ttgctcctga atgtcatcta 1500

tgcgttactt acagaaatgt gcaaaaaatg aattgcactg agcacattgc tgaataacag 1560

tatggaagag aacttttttt tgggtgagca catctgaaga gactttcttt tatattcatt 1620

ccctcttctt tttccttggc attttcagtg ctctgcatca caccatctgt catgtcaaga 1680

tcatgacgtt tattatatga tgttagttga gatgttgaac aatatagatc agcacaagaa 1740

tcatgaccag tctaattctg taaccaattc gcttcaactt tagtcacttg atttgcttta 1800

tcatagagct tgatgagatc ccataaatag gactataatt gccatctgtt tctgtaccat 1860

ggatcctttt cttctttcca tcatcttatg ctcatggatc tttgttgtag tgtcctggaa 1920

aaagctcaat tgcatgaggc gaaggcttcc acctggacct ccaaggtggc caatctttgg 1980

taaccttctc cagttgagcc ctcttcccca caaagacttc gctcgattct gcaccaagta 2040

tggccccctg gtctatcttc gtcttggaac catcgatgcc atcaccactg atgaccctga 2100

agtcatccgt gagatactca tccggcaaga tgaggtattt gcttcacggc ctcggacctt 2160

ggccgctgtt caccttgcct atgggtgcgg tgatgtggcc cttgctccgc tggggccgaa 2220

ctggaagagg atgaggaggg tttgcatgga gcacttgctg acaaccaagc ggcttgaatc 2280

ttttgctgct caccgagcac tggaggctga gcacctctgt cagtttgtgt gggctaaagc 2340

ccagtcaggg aaacctgtga atctcagaga ggttcttggg gccttctcga tgaacaacgt 2400

gacaaggatg ttgctaggga aacagtactt tggtctgcag tcagcaggcc ctggtgaagc 2460

aatggagttc atgcacatca cccatgaact gttctggctg ctgggcctga tctatcttgg 2520

ggactacttg ccagcctgga ggtggcttga tccatatggg tgtgagaaga agatgaggga 2580

ggttgagaag aaggtggacg acttccacca gaagattatt gatgagcaca ggaaggctag 2640

ggaggccaag aagagtgcat cccttgatga tgataacaaa gaagacatgg actttgttga 2700

tgtactgctt tctttgcccg gcgagaacgg aaaagagcac atggacgacg tcgagatcaa 2760

agctttgatg caggtatgtt tactgttttt gttattctag tctagttcta agttcatttg 2820

ttttttaact aagccatcac tgtgtttgtt gttatagtct attcttgaaa ttgaaatgat 2880

ttgctagctg ccattatgtt tgcaacaaat ctagccacgt taatgttatc tcctttgaga 2940

ttcaaccaat agatgacttg gttcttttaa agaaaataat aaaagggaag gtaattaaag 3000

atctgttttc acagcagagt ttttggttct tctgttgtta tgagctatgt ttgcttttcg 3060

gattgaattt atctgttact tctggcaaac catgttattt catttctagt gctacatgtt 3120

ggaaccacag tgaagtgatg gacagtacaa agtacaaact atcctttctt gtcctggaga 3180

ctacaagaaa attagaagta aagaaatgat agattttctg aaagtaaact agaagaaaac 3240

atgttgaaca acctgtatta ttcttcaaca ttatgtgcat gctagcgcta ctagtataca 3300

actgcatttt tcagtatcag aaatcttgca taagacatca aattagtcat aagcaattct 3360

gttctaagta gacaaaaaca aaactaatcc atgtacacaa cacaggacat gattgctgct 3420

gccaccgaca catcatcggt gaccaacgag tgggtgatgg cggaggtgat caagaacccc 3480

cgggtgctcc gcaagatcca ggaggagctc gacggcgtcg tcggccgcgg ccgcatggtg 3540

gcggagtcgg acctcggcca gctgacctac ctccggtgcg tcgtccgcga gtccttccgg 3600

atgcacccgg cggggccatt cctgatcccc cacgagtccc tgaagccgac gacgatcatg 3660

ggctacgaca tcccggcgcg gacgaggatc ttcatcaaca cccacgcgct cggccggaac 3720

acccgcatct gggacgacgt cgacgcgttc cggccggaga ggcacctgcc ggcatcggcg 3780

gacggcggcc gggtggagat cagccacctg ccggacttca agatcctccc cttcagcgcc 3840

ggcaagcgca agtgccccgg cgcgccgctc ggcgtcatcc tggtgctcat ggcgctcgcc 3900

aggctcttcc actgcttcga ctggtcgccg ccggacggcc tccgccccga cgacatcgac 3960

acccaggagg tgtacggcat gaccatgccc aaggccaagc cgctcgtcgc cgtcgccacg 4020

ccgcgcctgc cgccgcagat gtacggtcgc catggcaagc aagtttgagc taggcgtcgt 4080

gtggacaata atgcagacag gagaagccga tcgagctatg cagcttaacg taattaagag 4140

tgaattaatt ctacatgtat ctatcaaatc aatcacacat gtagacagtg acgatgaatg 4200

caagtgctga tgaatcaaag aaattaagca tcagctgatg aatctcactt tcttgctgaa 4260

ttccattcat ttcgttcaca cagtaggttc tttgagacta gatatcttct agtacgtgca 4320

aataatacgc atcgtgtact tcaaggttgt gataaatata tttcgtagca gaagctactt 4380

agctcgatag aattgatgat actagctata acttccgagt gagcacagga aaca 4434

<210> 2

<211> 1850

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aaccgtctct tcgtgagaat aaccgtggcc taaaaataag ccgatgagga taaataaaat 60

gtggtggtac agtacttcaa gaggtttact catcaagagg atgcttttcc gatgagctct 120

agtagtacat cggacctcac atacctccat tgtggtgaaa tattttgtgc tcatttagtg 180

atgggtaaat tttgtttatg tcactctagg ttttgacatt tcagttttgc cactcttagg 240

ttttgacaaa taatttccat tccgcggcaa aagcaaaaca attttatttt acttttacca 300

ctcttagctt tcacaatgta tcacaaatgc cactctagaa attctgttta tgccacagaa 360

tgtgaaaaaa aacactcact tatttgaagc caaggtgttc atggcatgga aatgtgacat 420

aaagtaacgt tcgtgtataa gaaaaaattg tactcctcgt aacaagagac ggaaacatca 480

tgagacaatc gcgtttggaa ggctttgcat cacctttgga tgatgcgcat gaatggagtc 540

gtctgcttgc tagccttcgc ctaccgccca ctgagtccgg gcggcaacta ccatcggcga 600

acgacccagc tgacctatac cgaccggact tgaatgcgct accttcgtca gcgacgatgg 660

ccgcgtacgc tggcgacgtg cccccgcatg catggcggca catggcgagc tcagaccgtg 720

cgtggcttgc tacaaatacg taccccgtga gtgccctagc tagaaactta cacctgcaac 780

tgcgagagcg agcgtgtgag tgtagccgag tagatccacc ggtcgccacc atggcctcct 840

ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc accgtgaacg 900

gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc cacaacaccg 960

tgaagctgaa ggtgacgaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccccc 1020

agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc gactacaaga 1080

agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg 1140

tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac aaggtgaagt 1200

tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc atgggctggg 1260

aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag acccacaagg 1320

ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc tacatggcca 1380

agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac atcacctccc 1440

acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc caccacctgt 1500

tcctgtagcg gcccatggat attcgaacgc gtagacttgt ccatcttctg gattggccaa 1560

cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca cacatagtga catgctaatc actataatgt 1620

gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt actagttatc tgaataaaag agaaagagat 1680

catccatatt tcttatccta aatgaatgtc acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag 1740

atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat ataaatatta atcatatata attaatatca 1800

attgggttag caaaacaaat ctagtctagg tgtgttttgc gaatgcggcc 1850

<210> 3

<211> 4680

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatctgcacc ggacactgtc tggtggcata 60

ccagacagtc cggtgtgcca gatcagggca cccttcggtt cctttgctcc tttgcttttg 120

aaccctaact ttgatcgttt attggtttgt gttgaacctt tatgcacctg tggaatatat 180

aatctagaac aaactagtta gtccaatcat ttgtgttggg cattcaacca ccaaaattat 240

ttataggaaa aggttaaacc ttatttccct ttcaatctcc ccctttttgg tgattgatgc 300

caacacaaac caaagaaaat atataagtgc agaattgaac tagtttgcat aaggtaagtg 360

cataggttac ttagaattaa atcaatttat acttttactt gatatgcatg gttgctttct 420

tttattttaa cattttggac cacatttgca ccacttgttt tgttttttgc aaatcttttt 480

ggaaattctt tttcaaagtc ttttgcaaat agtcaaaggt atatgaataa gattgtaaga 540

agcattttca agatttgaaa tttctccccc tgtttcaaat gcttttcctt tgactaaaca 600

aaactccccc tgaataaaat tctcctctta gctttcaaga gggttttaaa tagatatcaa 660

ttggaaatat atttagatgc taattttgaa aatataccaa ttgaaaatca acataccaat 720

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tgggcttaat atttctcccc ctttggcatt aatcgccaaa aacggagact ttgtgagcca 840

tttatacttt ctccccattg gtaaatgaaa tatgagtgaa agattatacc aaatttggac 900

agtgatgcgg agtgacggcg aaggataaac gataccgtta gagtggagtg gaagccttgt 960

cttcgccgaa gactccattt ccctttcaat ctacgactta gcatagaaat acacttgaaa 1020

acacattagt cgtagccacg aaagagatat gatcaaaggt atacaaatga gctatgtgtg 1080

taatgtttca atcaaagttt cgagaatcaa gaatatttag ctcattccta agtttgctaa 1140

aggttttatc atataatggt ttggtaaaga tatcgactaa ttgttctttg gtgctaacat 1200

aagcaatctc gatatcaccc ctttgttggt gatccctcaa aaagtgatac cgaatgtcta 1260

tgtgcttagt gcggctgtgt tcaacgggat tatccgccat gcagatagca ctctcattgt 1320

cacataggag agggactttg ctcaatttgt agccatagtc cctaaggttt tgcctcatcc 1380

aaagtaattg cacacaacaa tgtcctgcgg caatatactt ggcttcggcg gtagaaagag 1440

ctattgagtt ttgtttcttt gaagtccaag acaccaggga tctccctaga aactgacaag 1500

tccctgatgt gctcttccta tcaattttac accctgccca atcggcatct gaatatccta 1560

ttaaatcaaa ggtggatccc ttggggtacc aaagaccaaa tttaggagtg taaactaaat 1620

atctcatgat tcttttcacg gccctaaggt gaacttcctt aggatcggct tggaatcttg 1680

cacacatgca tatagaaagc atactatctg gtcgagatgc acataaatag agtaaagatc 1740

ctatcatcga ccggtatacc ttttggtcta cggatttacc tcccgtgtcg aggtcgagat 1800

gcccattagt tcccatgggt gtcctgatgg gcttggcatc cttcattcca aacttgttga 1860

gtatgtcttg aatgtacttt gtttggctga tgaaggtgcc atcttggagt tgcttgactt 1920

gaaatcctag aaaatatttc aacttcccca tcatagacat ctcgaatttc ggaatcatga 1980

tcctactaaa ctcttcacaa gtagatttgt tagtagaccc aaatataata tcatcaacat 2040

aaatttggca tacaaacaaa acttttgaaa tggttttagt aaagagagta ggatcggctt 2100

tactgactct gaagccatta gtgataagaa aatctcttag gcattcatac catgctgttg 2160

gggcttgctt gagcccataa agcgcctttg agagtttata aacatggtta gggtactcac 2220

tatcttcaaa gccgagaggt tgctcaacat agacctattc accccatttg atcacttttt 2280

tggtccttca ggatctaata gttatgtata atttagagtc tcttgtttaa tggccagata 2340

tttctaatta atctaagaat ttatgatatt ttttaatttt ttatcatgtc tgatgagaat 2400

taacataaag gctcaattgg gtcctgaatt aataatagag tgaaaattaa tccagaggct 2460

ctattagaac cttcaattag taataccaag atatatataa gatagtagag tatagtttaa 2520

atgttggcat tgttcattct ttcttttgtt atttaattta tgctttccac ggtggttagt 2580

ggttacttct gaagggtcca aataatgcat gaagagtttg aggacaagaa gtctgcccta 2640

aaaatagcga tgcaaaggca tggtgtccaa gccatacata tagcgcacta attttatcag 2700

cagaacaatg gtatttatag gtcctagtgc ccaggcaaca agagacacga ataaagcatc 2760

gatcacgaca catggcggcg acaatggcag tgacgacgat ggtgacgagg agcaaggaga 2820

gctggtcgtc attgcaggtc ccggcggtgg cattcccttg gaagccacga ggtggcaaga 2880

ccggcggcct cgagttccct cgccgggcga tgttcgccag cgtcggcctc aacgtgtgcc 2940

cgggcgtccc ggcggggcgc gacccgcggg agcccgatcc caaggtcgtc cgggcggcct 3000

gcggcctggt ccaggcacaa gtcctcttcc aggggtttaa ctgggagtcg tgcaagcagc 3060

agggaggctg gtacaacagg ctcaaggccc aggtcgacga catcgccaag gccggcgtca 3120

cgcacgtctg gctgcctcca ccctcgcact ccgtctcgcc acaaggctac atgccaggcc 3180

gcctatacga cctggacgcg tccaagtacg gcacggcggc ggagctcaag tccctgatag 3240

cggcgttcca cggcaggggc gtgcagtgcg tggcggacat cgtcatcaac caccggtgcg 3300

cggaaaagaa ggacgcgcgc ggcgtgtact gcatcttcga gggcgggact cccgacgacc 3360

gcttggactg gggccccggg atgatctgca gcgacgacac gcagtactcg gacgggacgg 3420

ggcaccgcga cacgggcgag gggttcgcgg cggcgcccga catcgaccac ctcaacccgc 3480

gcgtgcagcg ggagctctcc gcctggctca actggctcag gtccgacgcc gtggggttcg 3540

acggctggcg cctcgacttc gccaagggct actcgccggc cgtcgccaga atgtacgtgg 3600

agagcacggg gccgccgagc ttcgtcgtcg cggagatatg gaactcgctg agctacagcg 3660

gggacggcaa gccggcgccc aaccaggacc agtgccggca ggagctgctg gactggacgc 3720

gggccgtcgg cgggcccgcc atggcgttcg acttccccac caagggcctg ctgcaggcgg 3780

gcgtgcaggg ggagctgtgg cggctgcgcg acagctccgg caacgcggcc ggcctgatcg 3840

ggtgggcgcc cgagaaggcc gtcaccttcg tcgacaacca tgacaccggg tcgacgcaga 3900

agctctggcc gttcccatcc gacaaggtca tgcagggcta cgcctacatc ctcacccatc 3960

caggagtccc ctgcattttc tacgaccaca tgttcgactg gaacctgaag caggagatat 4020

ccacgctgtc tgccatcagg gcgcggaacg gcatccgcgc cgggagcaag ctgcggatcc 4080

tcgtggcgga cgcggacgcg tacgtggccg tcgtcgacga gaaggtcatg gtgaagatcg 4140

ggacaaggta cggcgtgagc agcgtggtcc cgtcggattt ccacccggcg gcgcacggca 4200

aggactactg cgtctgggag aaagcgagcc tccgcgtccc ggcggggcgc cacctctagc 4260

agctcagatt gctcagtctt gtgctgcatt gcaaacacag cagcacgaca ctgcataacg 4320

tcttttcctt gagatctgac aaagcagcat tagtccgttg atcggtggaa gaccactcgt 4380

cagtgttgag ttgaatgttt gatcaataaa atacggcaat gctgtaaggg ttgtttttta 4440

tgccattgat aatacactgt actgttcagt tgttgaactc tatttcttag ccatgccaag 4500

tgcttttctt attttgaata acattacagc aaaaagttga aagacaaaaa aaaaaacccc 4560

cgaacagagt gctttgggtc ccaagctact ttagactgtg ttcggcgttc cccctaaatt 4620

tctcccccta tatctcactc acttgtcaca tcagcgttct ctttccccta tatctccacg 4680

<210> 4

<211> 5156

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cctgttaacc ggttgaggtg gtggtgggac agccacgcgc gcgcgcgccg ggctgggccg 60

aggccttggc aaggtaggca ggcggctggt ctctctctct cgttttcatt ttgtaacaga 120

cggagattga ttcagtaatc aattcggttt taacgagagc gaattcattc gatgttaatc 180

atgtgattaa ttacgcagat tgaatccgag tgttatcctt gcgctacaat tcctctcagc 240

aacagacaga ggagtaacat ctctctatct cctagcggac tgtctacttc ctcctcgatt 300

ccccttcctt ttcctgagct gcttctggct tccccggttc tgttcacttg cgcgcacggg 360

tgatcaggac gagcaggcct ccggaactcc gtccagttgc gtacctgcat gggtaggcgg 420

gcgatcaagt ttttggggag cgctcttggg cgcgactgct cctgttcgac aacggttcta 480

cactgctaca tcttcgccaa catgtcgacg gacaacacca acactcgcac tggcactgga 540

aagcctcaac tagtacatga gcgttctcag ggtatatgtc cattccctta ccgttaatta 600

tgctgctaga agatttttct gttaatgctt atcgcaatgt tacaattgcg ttactatgtg 660

aatgttatac ttattttatg aaaagcatgc tcatgctgag caccatcact agatcaattc 720

tcattgcaaa tgtcatgttt attatcttgt tggtggacct gcagccaatt ttgggtcaag 780

aagaagagaa cgaggtagcg gagaggtttg aggtgatgtt gtgtggtgga gaaatgcgtg 840

agatgaggat tgtgtccgat atttcacttc gcaccggttg ctcgatctga agcattttcg 900

gatttgtgat tctattttga acatttgtgt tgtggtactg aaatttccga gatttcagaa 960

aaacttttta aaataattcg aactaatttt agccaaatct aaacaaattt ggaccaaatt 1020

caaaaaaaga gaaaaaattt gaaaattatg acgaaatatt ttggtgtccg gtgagggtcc 1080

gaaatttcgg gaattccgaa cgaaaattat aaacattgtg catgggagtt taattacggg 1140

gatgggaatt tatcctcatg actccctgcc tttcaatacg ctgggggaat tgggaggaaa 1200

ttcatcttca cttaaaatat aatttccttc tatactacgt aagactatcg gattgaatcc 1260

aataaacttc taaactgcct aagatatctg tccaaaatta gagataaatt agcaacacca 1320

taccaaacca accaaaatga caaattaatt ctcagtccaa aattacatgc atggacagtg 1380

cagcaacaac cggcatccat gaatccataa accgagagtg gccaaacagc tgctacttca 1440

cctgcactgc aacttcttgc gaatccttaa ccctctgaat ctgataggtt gtcaagataa 1500

tcttgcattt gtggctttga cacgacgacg atgacgaaca ctgcctgatt ctgatggagc 1560

agaagctgcc atttcccgat gggcacagca agctattcga ccgaggaatc tctaccttcg 1620

ctgccgatgc aacctcttgc accggcagca agctggtcgt cggtgccgag gagaagccct 1680

tctcaatgtt gatgttattc caatacactc ctataatcga taatattgta agctaatata 1740

ttgacgtgca attcttttac gtcttcgcga aaaaccggta atgtcgtaag gaaatgcccc 1800

caaaagctcc cacgtgttca cccttccaac ctcttacagg ctagatgttg aagaagcatc 1860

ctgggccgtt ggatatcaat ccaacgcata gcagtagtcg accgagtaga cattgacttg 1920

ggccgtgccc ggcccggccc atcgtgcttc gtgccaaaac gggccgtgcc ggaacaaccc 1980

cccaccacgg cggcggcggc ggcggcgcca tggcgaacag cggcaagtca tcgccggcgg 2040

cgacctccac caccgcgccg ccaccgggtc ggccgaaggc gaaggcgccg cccctcaccg 2100

tcgagggcta ccccgtggag ggcatctcca tcggcgggca ggagacctgc gtcatcttcc 2160

cgacgctgag cgccgccttc gacatcggcc ggtgcccgca gcgcgccgtc tcgcaggagt 2220

tcctcttcat ctcccacgcc cacctcgacc acatcggcgg cctccccatg tacgtcgcca 2280

cccggggcct ctaccggcag cgcccgccca ccatcttcat ccccgcctgc ctcagggacc 2340

ccgtggagcg cctcttcgag ctccaccgct ccatggacca gtccgagctc agccacaacc 2400

tcgtccccct cgagattggt caggagcacg agctcaggag ggacctcaag gtgaaggcct 2460

tcaagaccta ccacgccatt cccagccagg tgaagggttc atcagttctt ggttgttctg 2520

gatgaattat tcttgattga ttgatttggt cggaaatgtg tggtgaattt ggttgagatg 2580

tgatgtgatt gtaggggtat gtgatataca cggtgaagca aaagctcaag ccagagtatc 2640

ttggcctccc tgggagcgag atcaagcagc tgaagctgtc aggtgtggag gtctgttgtt 2700

gttttttttt ttttttgata ttgtggatgt ctggatgaaa tggaatacaa ttcacaattt 2760

agttatgttg ttgatgctgt gcgtggttct gtttttcaga ttacgaatac attgacggtg 2820

cctgagattg cttttaccgg agatacgatg gcagatttca ttcttgatcc tgataatgcg 2880

gatgttttga aggcgaaaat tcttgtagtg gaggtattgc ttcttatcgt ctatatggtt 2940

aatttgttgt caattgtcat tgttgctatt cagcctgaga aaaaaaaaag agggaaactg 3000

tttcttcaag cacggatatc agtatattac caagattaat tttatcaaca gaaggaaaag 3060

caacagcctt tgcttttcag gagagattga ttccaactcc atattaactg ataactgagt 3120

accatttttt caaactgaaa cctttgcgga accaattggc agcaattagt gggaactatg 3180

ttgcctgaag catgtttcag tttccatact gaatatttat tgtccttctc ctgacgaaat 3240

tttaattatc tccaaattta acttagtgaa ctgtgttctg gaaattgcag agtacttttg 3300

ttgatgactc tgttacaatt gagcatgcaa gagaatatgg gcacacccat ctgtttgagg 3360

ttattcccaa attttgctta tttcatattt ctgtggaaga aaaacatttc acctagcatt 3420

gctaattttg cccttatctt ttttttttat gtatgcagat actgaatcag tgtgacaaac 3480

ttgaaaacaa agctattctg ctaatccact tttctgctcg ttataccgca gaggtgagct 3540

atctctgttg taatccaatt ttacttatat cattttatcc tgattcaatt agtaatctgt 3600

atgctttgtt tcaactctgt ggatttattt tttgtttcaa gcaagtttca ccaatattgt 3660

tattttttaa tgccatcatt atgagcaggc aaaatgtgcc cacttttctt gtagcatcct 3720

cctttcctct taaaagtaca catgtttgtg tttcattctt tacaaataaa tacatttatc 3780

ttcaattttt ttctcaccat cattaaacat ttcatcacat ccttttcagg aaattgatat 3840

agcaatcaat aagttgccac cctctttcag aagtagagtt catgcattga aggaaggttt 3900

ctgacaaaga tgaagtgatc aatcagaaat gaagcattca accttactct cctctcgatg 3960

cactcatgta ccaagaactc tttttttttt tggggggggg gggggggtgg ggggggatcg 4020

aatccttaac tcttgagtcc tgaaacattt ctgtagcacc ccttcacaca ccgaacatta 4080

acaatatttt acattttttt ggtcattggt gatcgcaaag agcaatcgtt acatccatgc 4140

tgtattacat tatacataga gatagtacat gttgtggata atccctggcc cctcttgaaa 4200

atacgaacat accaaaattc actcaatttc aagacaaaat ggacaggaaa tttaacctgg 4260

ctacccttcc atttgtcacc cttctatgtc gtccaaatgt ttaattttct ttccccatta 4320

tatttttttt cttgatgatg atgatctccg tggtcgctca tgctgcatgc ctacgtgacg 4380

tcatctcgcc ggcggatcag cacggctcgc cgggccggca ggagagcgcg ccggcgaagc 4440

gtgtgagcct cctgacgtag gagcctggct tgggcttaac catgtcggag cccttcacct 4500

tcctgttgat ggcgccgttg gacgcctgga agtaggcgcc gttcatgaac aggtctccgt 4560

ccgagcgcca cgcccagttc ttccactccc actccggcgc atagtgcctc gtgatctgct 4620

ccatcacagc atcgactgtt tagacgatga cacggtctct aaaatatggt cgatggtttc 4680

tttttttaat atcaacatgg tctttagaat acgacggtat tgattttcgt gtatcgacac 4740

gatctacgaa acatgagact agtaggtgtt acttcctccg tttcagctta tttgttattc 4800

tagcaaattt cccataaaca agtggaaaat tacatcgtta cctcattaat tacttcctaa 4860

ttgtttccca aagcttattt ataaaccgtt gtgcacggtt gtattgataa aggttagaga 4920

tggaaagtac tctctaaaat attttgcatt ccggaaaacg gttattacta ttttgataag 4980

gaatttcaat gctagctaga atgataagta atctaaaacg aaaggagcta atagtaccag 5040

tttggcggcg atgttgggag gggcgatgta tcggttgccc tggctgagga tggtagggct 5100

catgccgccg ccgatggcgt acatgagcca gtgcgtgtag tcgttgttga cgacgt 5156

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tggcgttcac cttgcctatg ggtg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aaaccaccca taggcaaggt gaac 24

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaattcaacc gtctcttcgt gagaataacc 30

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggtaccctta agaaacacac ctagactaga tttg 34

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccatgattac gaattgggat gggtgtttga ctctg 35

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

agagacggtt gaattcctgt gctcactcgg aag 33

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtgtgtttc ttaagcctgt taaccggttg aggtg 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccgggtaccc ttaagacgtc gtcaacaacg actac 35

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttcaccttg cctatgggtg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

atggccccct ggtctatctt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

gaaggcccca agaacctctc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

acctgcctga aaccgaactg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ctgctccata caagccaacc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

atggcctcct ccgagaacgt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ctacaggaac aggtggtggc 20

Claims (9)

1.改良水稻温敏不育系的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、结合CRISPR/Cas9方法，将负载有育性调控基因靶位点序列的pCBSG打靶载体转化入温敏不育系水稻植株中，并得到育性调控基因纯合突变基因的水稻植株，该水稻植株表现为完全不育；

步骤二、将野生型育性调控基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育恢复基因构建入一个表达载体中，得到四元互补载体；

步骤三、将所述四元互补载体转化入步骤一得到的水稻植株中，得到育性恢复的转基因互补植株、可繁殖生产改良的水稻不育系；

使该育性恢复的转基因互补植株自交收获种子，其中，表现外源报告基因相应性状的种子，长成的植株可育，作为繁殖系种子，未表现出外源报告基因相应性状的种子，其长成的植株不可育，作为不育系种子，用于杂交种生产。

2.如权利要求1所述的改良水稻温敏不育系的方法，其特征在于，所述育性基因为CYP703A3、CYP704B2和EAT1基因中的任意一种，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种，所述花粉致死基因为ZmAA1基因，所述温敏不育恢复基因为TMS5基因。

3.如权利要求2所述的改良水稻温敏不育系的方法，其特征在于，步骤二中，将如SEQID NO：1所示的野生型育性调控基因CYP703A3表达元件、如SEQ ID NO：2所示的荧光蛋白基因表达元件、如SEQ ID NO：3所示的花粉致死基因表达元件和如SEQ ID NO：4所示的温敏不育恢复基因TMS5表达元件构建入所述四元互补载体中，

所述四元互补载体为pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-TMS5-ZmAA1。

4.如权利要求2所述的改良水稻温敏不育系的方法，其特征在于，步骤一中，所述育性调控基因为CYP703A3，

获得育性调控基因纯合突变基因的转基因植株的具体方法包括如下步骤：

1.1)分析野生型水稻染色体上CYP703A3基因的上下游序列区域，取GTTCACCTTGCCTATGGGTG编辑位点，以野生型水稻基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示的引物对进行扩增，并将扩增产物片段连接到打靶载体pCBSG上，得到pCBSG-03A3重组载体；

1.2)打靶重组载体pCBSG-03A3载体转化温敏不育系水稻，并对再生植株进行转基因检测和突变位点分析，筛选出CYP703A3基因突变杂合植株，对CYP703A3基因突变杂合植株进行低温处理，使其育性恢复，自交一代收获种子，之后在T1代对突变位点和潮霉素基因进行检测分析，获得CYP703A3基因纯合突变的不含潮霉素基因的不育系水稻植株，其中，所述低温处理为：在植株花粉母细胞减数分裂时期，利用冷水灌溉进行，并于温度23℃左右处理7-10天。

5.如权利要求2所述的改良水稻温敏不育系的方法，其特征在于，构建所述四元互补载体的具体方法包括如下步骤：

2.1)以pMD18T-DsRed原始克隆为模板，以如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对进行PCR扩增，并将扩增产物片段连接到载体pCAMBIA1300上，得到pCAMBIA1300-DsRed重组载体；

2.2)将ZmAA1基因片段连接到载体pCAMBIA1300-DsRed得到pCAMBIA1300-DsRed-ZmAA1重组载体；

2.3)以水稻品种Y58S基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对进行PCR扩增，利用同源重组方法，把育性基因CYP703A3基因全长插入载体中，获得pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1重组载体；

2.4)以水稻品种9311的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对进行PCR扩增，利用同源重组方法，把育性基因TMS5基因全长序列全长插入pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1重组载体中，获得所述四元互补载体pCAMBIA1300-CYP703A3-DsRed-ZmAA1。

6.如权利要求1所述的改良水稻温敏不育系的方法，其特征在于，步骤三中，利用农杆菌介导进行所述四元互补载体的遗传转化，具体包括如下步骤：

利用不育突变体幼穗诱导愈伤组织，利用农杆菌介导所述四元互补载体遗传转化，获得育性恢复的转基因植株。

7.如权利要求1所述的改良水稻温敏不育系的方法，其特征在于，所述温敏不育系水稻为隆科638S、爽1S或Y58S品系。

8.改良的水稻温敏不育系在水稻杂交制种中的应用，其特征在于，所述改良的水稻温敏不育系由如权利要求1至7任一所述的方法获得。

9.重组载体，所述重组载体负载有野生型不育调控基因、外源报告基因、花粉致死基因和温敏不育基因。

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