CN110964743A - 一种利用启动子编辑创制水稻直链淀粉含量变异的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用启动子编辑创制水稻直链淀粉含量变异的方法，包括：在启动子区域选择两个基因编辑靶标位点，将靶标序列连入双靶点基因编辑载体，通过农杆菌介导转化获得再生转基因水稻植株。利用潮霉素抗性基因分子标记筛选转基因阳性植株，再在靶标位点附近设计引物，PCR扩增后测序鉴定出在水稻LOC_Os06g04200基因的启动子区域含两个突变位点的基因编辑纯合突变单株。通过测定T1代纯合突变单株水稻籽粒直链淀粉含量，确定启动子编辑成功创制水稻直链淀粉含量变异。本发明能够调节基因表达水平而不丧失基因功能，产生的水稻直链淀粉含量变异能满足不同的育种目的和需求。

Description

一种利用启动子编辑创制水稻直链淀粉含量变异的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及创制水稻数量性状变异的方法。
背景技术
数量性状在生物全部性状中占有很大的比重。农作物中，几乎所有的产量相关性状、抗逆性相关性状以及大多数的农艺性状和经济性状均表现为连续变异，界限模糊，难以进行分类，这类性状称为数量性状(quantitative character)，可以通过创制数量遗传变异来实现育种目标。不同于质量性状，数量性状不但受为数众多的微效数量性状位点(QTL)控制，还受特定基因的表达和酶活性水平控制，遗传基础相对复杂，易受外界环境的干扰，基因型与表现型之间的对应关系较为模糊。因此，对于数量性状的遗传研究显得较为困难。
目前，农艺性状的遗传改良主要依赖传统育种方法的费时费力的选择和少量的自然突变。通常利用回交、复交等杂交手段通常需要花费5-10年的时间才能完成品种改良，在改良过程中需要对大量的杂交后代进行表型观察或利用分子标记进行鉴定。李刚等2008年构建群体改良粳稻品种武运粳8号的产量性状，直到2014年才获得每穗粒系和单株产量明显的表现稳定一致的株系。而自然突变的数量和效果有限，可能无法满足目前的育种需求。
基因编辑技术是创制遗传变异的最新手段，能识别外源DNA序列，并在外源DNA序列上的特定位点进行切割，形成双链断裂(Double strand break，DSB)，随后在非同源末端粘接(Non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)修复机制下，对靶基因造成随机多个碱基的插入或缺失，完成基因的敲除，实现基因靶向突变。
随着市场经济的发展和人民生活水平的改善，人们对水稻的需求不再仅为解决温饱问题，对水稻食味品质的要求越来越高。淀粉是稻米中的主要贮藏物质，研究表明淀粉中直链淀粉的相对含量是决定米饭质地和食味的重要因素之一。直链淀粉含量低，米饭粘软，外观油润，有光泽，冷不回生，适口性好；反之，则米饭质地硬，粘性小，蓬松干燥，光泽差。尽管世界各产稻国的优质稻米指标有差异，但大多数消费者喜欢米饭软硬适中，适口性好的稻米。水稻国家品种审定标准中规定，若品种品质达到部颁标准2级以上，不考虑其产量，完成试验后可申报国家品种。考察水稻品种品质的重要指标之一就是直链淀粉含量，籼稻品种一级品质要求直链淀粉含量为13.0％-18.0％，二级品质要求为13.0％-20.0％，粳稻品种一级品质要求直链淀粉含量为13.0％-18.0％，二级品质要求为13.0％-19.0％，许多品种因为直链淀粉略高而不能达到部颁标准2级或以上，因此不能入选优质品种。
水稻蜡质基因(Waxy，Wx)编码颗粒淀粉合成酶(granule bound starchsynthase，GBSS)，是控制直链淀粉合成的主效基因，直接影响胚乳中直链淀粉的含量。该基因的不同等位变异决定了稻米直链淀粉含量的多少，可以通过对该基因的遗传操作控制水稻胚乳中直链淀粉的合成，从而改变直链淀粉的相对含量。Wang等(Nucleic AcidsResearch,1990,18(19):5898)已经发表了Wx基因的全序列，水稻Wx基因位于第6号染色体的短臂上，包括13个内含子和14个外显子，编码由609个氨基酸组成的蛋白。目前在栽培稻中已鉴别了Wx基因的多个重要的等位变异，包括Wxa、Wxb、wx、Wxop、Wxin、Wxmq、Wxmp、Wxhp、Wxmv等，这些等位变异是造成稻米品质差异的主要原因。与Wxa相比，Wxb的变异是由第一内含子5'端剪接位点处G-T变异造成的，突变降低了前体mRNA的剪接效率从而减少了GBSSI的量进而导致了较低的直链淀粉含量。Wxin等位基因是在第六外显子上发生的A-C变异使直链淀粉含量降至中等水平(18％-20％)(Mikami等，Theor Appl Genet.2008(7)979-989)。Wxop(或者Wxhp)的变异是是由第4外显子的A-G突变造成的(Mikami等，Theor Appl Genet.2008(7)979-989)。
综上，当前Wx基因的不同等位变异，都是通过在腊质基因(Wx)编码区(尤其以外显子为多)的不同位点发生碱基的替换或敲除，进而影响Wx蛋白的活性，造成其直链淀粉含量的降低。而且，目前基因编辑还是以单靶点为主，即每次转化只在一个位点产生突变。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用启动子编辑创制水稻直链淀粉含量变异的方法，能够调节基因表达水平而不丧失基因功能，产生的水稻直链淀粉含量变异能满足不同的育种目的和需求。
一种利用启动子编辑创制水稻直链淀粉含量变异的方法，包括以下步骤：
(1)选取水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的第一编辑靶位点和第二编辑靶位点，分别确定第一编辑靶位点所对应的第一对oligo序列和第二编辑靶位点所对应的第二对oligo序列，并在每对oligo序列的5’端引入酶切位点，设计和合成相应的第一对Pro序列和第二对Pro序列；
其中，第一编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2589-2570位，第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位或者水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位；
(2)构建双靶点CRISPR/Cas9基因编辑表达载体；
(3)将所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑表达载体转入农杆菌，通过农杆菌介导转化将所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体导入受体水稻品种，得到T0代转基因再生植株；
(4)对T0代转基因再生植株进行潮霉素抗性基因检测，找到转基因阳性植株；
(5)针对第一编辑靶位点和第二编辑靶位点设计引物，利用引物对转基因阳性植株的基因组DNA进行PCR扩增，测序鉴定出在水稻LOC_Os06g04200基因的启动子区域含两个突变位点的基因编辑纯合突变单株；
(6)对T1代纯合突变单株的表型进行分析，确认获得水稻直链淀粉含量变异植株。
在本发明的一些具体实例中，步骤(1)中，
第一对oligo序列和第一对Pro序列如下所示：
Oligo F1:GCTTATTACAGCCGTGGGAG(SEQ ID NO:2)
Oligo R1:CTCCCACGGCTGTAATAAGC(SEQ ID NO:3)
Pro1-S(5’-3’):tgttGCTTATTACAGCCGTGGGAG(SEQ ID NO:4)
Pro1-C(5’-3’):aaacCTCCCACGGCTGTAATAAGC(SEQ ID NO:5)
当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，第二对oligo序列和第二对Pro序列如下所示：
Oligo F2:GCCAACTAACGCCTCGACAA(SEQ ID NO:6)
Oligo R2:TTGTCGAGGCGTTAGTTGGC(SEQ ID NO:7)
Pro2-S(5’-3’):gtgtGCCAACTAACGCCTCGACAA(SEQ ID NO:8)
Pro2-C(5’-3’):aaacTTGTCGAGGCGTTAGTTGGC(SEQ ID NO:9)。
当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，第二对oligo序列和第二对Pro序列如下所示：
Oligo F3(5’-3’):GCTCTGAGGCACTGACGTGC(SEQ ID NO:16)
Oligo R3(5’-3’):GCACGTCAGTGCCTCAGAGC(SEQ ID NO:17)。
Pro3-S(5’-3’):gtgtGCTCTGAGGCACTGACGTGC(SEQ ID NO:18)
Pro3-C(5’-3’):aaacGCACGTCAGTGCCTCAGAGC(SEQ ID NO:19)。
在本发明的一些具体实例中，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，步骤(1)中，对合成的所述第一对pro序列和第二对pro序列分别进行退火形成双链DNA，具体条件如下：
双链DNA Pro1-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro1-S(100μM)，10μl；Pro1-C(100μM)，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃；
双链DNA Pro2-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro2-S(100μM)，10μl；Pro2-C(100μM)，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
在本发明的一些具体实例中，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，步骤(2)中，所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建过程如下：
用BtgZⅠ酶切pENTER质粒，回收并纯化切开的pENTER质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro1-S/C连入pENTER质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得含有第一编辑靶位点入门载体pENTER-1；
用Bsa I酶切pENTER-1质粒，回收并纯化切开的pENTER-1质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro2-S/C连入pENTER-1质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得同时含有第一和第二编辑靶位点入门载体pENTER-1-2；
用Aat III酶切pENTER-1-2质粒，和pUbi-Cas9质粒进行Gateway重组，用Proteinase K终止Gateway反应，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体pUbi-pENTER-1。
在本发明的一些具体实例中，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，步骤(1)中，对合成的所述第一对pro序列和第二对pro序列分别进行退火形成双链DNA，具体条件如下：
双链DNA Pro1-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro1-S(100μM)，10μl；Pro1-C(100μM)，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃；
双链DNA Pro3-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro3-S(100μM)，10μl；Pro3-C(100μM)，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
在本发明的一些具体实例中，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，步骤(2)中，所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建过程如下：
用BtgZⅠ酶切pENTER质粒，回收并纯化切开的pENTER质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro1-S/C连入pENTER质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得含有第一编辑靶位点入门载体pENTER-1；
用Bsa I酶切pENTER-1质粒，回收并纯化切开的Penter-1质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro3-S/C连入pENTER-1质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得同时含有第一和第二编辑靶位点入门载体pENTER-1-3；
用Aat III酶切pENTER-1-3质粒，和pUbi-Cas9质粒进行Gateway重组，用Proteinase K终止Gateway反应，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体pUbi-pENTER-2。
在本发明的一些具体实例中，步骤(4)中，潮霉素抗性基因检测所用引物HYG-F/R的核苷酸序列如下所示：
HYG-F(5’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3’)(SEQ ID NO:10)
HYG-R(5’-GTCCTGCGGGTAAATAGC-3’)(SEQ ID NO:11)。
在本发明的一些具体实例中，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，步骤(5)中，
在第一编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro1-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro1-F(5’-TGAAGGACGGAAATTGGAT-3’)(SEQ ID NO:12)
SeqPro-1-R(5’-TCTTGCAGGTCACAGCATT-3’)(SEQ ID NO:13)
PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.0℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为292bp；
在第二编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro2-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro2-F(5’-ATGTCCTACGGAATGACGA-3’)(SEQ ID NO:14)
SeqPro2-R(5’-AAAGAACTTGGAATTACGCTAC-3’)(SEQ ID NO:15)
PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.5℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为214bp。
在本发明的一些具体实例中，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，步骤(5)中，
在第一编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro1-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro1-F(5’-TGAAGGACGGAAATTGGAT-3’)(SEQ ID NO:12)
SeqPro-1-R(5’-TCTTGCAGGTCACAGCATT-3’)(SEQ ID NO:13)
PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.0℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为292bp；
在第二编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro3-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro3-F(5’-GAAACGGCAGGCAGCATCG-3’)(SEQ ID NO:20)
SeqPro3-R(5’-TGGGTGGCTATTTGTAGCG-3’)(SEQ ID NO:21)
PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)53.5℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为341bp。
本发明方法中，利用CRISPR/Cas9系统对水稻LOC_Os06g04200基因启动子ATG上游进行双靶点编辑，包括：在启动子区域选择基因编辑靶标位点，将靶标序列连入双靶点基因编辑载体，转入农杆菌，通过农杆菌介导转化获得再生转基因水稻植株。利用潮霉素抗性基因分子标记筛选转基因阳性植株，再在靶标位点附近设计引物，PCR扩增后测序最终鉴定出在水稻LOC_Os06g04200基因的启动子区域含两个突变位点的基因编辑纯合突变单株。通过测定T1代纯合突变单株水稻籽粒直链淀粉含量，确定启动子编辑成功创制水稻直链淀粉变异。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻LOC_Os06g04200基因启动子区域进行双靶点编辑，通过改变基因的表达水平，在不丧失基因功能的情况下调节基因表达水平，通过降低水稻籽粒中的直链淀粉含量，创制不同类型数量性状变异，满足不同的育种目的和需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
本发明实施例中水稻LOC_Os06g04200基因启动子序列如SEQ ID NO:1所示。以下实施例中浓度单位μM代表μmol/L。
实施例1转基因水稻植株的获得
1、选取基因编辑靶位点并设计相应的序列。
①选取水稻LOC_Os06g04200基因启动子ATG上游2589-2570位作为第一编辑靶位点S1，确定第一编辑靶位点S1所对应的一对互为反向互补的oligo序列DNA，其核苷酸序列如下所示：
Oligo F1:GCTTATTACAGCCGTGGGAG(SEQ ID NO:2)
Oligo R1:CTCCCACGGCTGTAATAAGC(SEQ ID NO:3)
为将目标序列连入载体中，分别在Oligo F1和Oligo R1的5’端引入酶切位点，序列如下所示(序列中小写英文表示酶切位点)：
Pro1-S(5’-3’):tgttGCTTATTACAGCCGTGGGAG(SEQ ID NO:4)
Pro1-C(5’-3’):aaacCTCCCACGGCTGTAATAAGC(SEQ ID NO:5)
Pro1-S和Pro1-C由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
按照以下步骤退火形成双链DNA，即Pro1-S/C：
反应体系：Pro1-S(100μM)，10μl；Pro1-C(100μM)，10μl；10×Buffer(碧云天公司，Annealing Buffer for DNA Oligos)，20μl；无菌水60μl。
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
②选取水稻LOC_Os06g04200基因启动子ATG上游2192-2173位作为第二编辑靶位点S2，确定第二编辑靶位点S2所对应的一对互为反向互补的oligo序列DNA，其核苷酸序列如下所示：
Oligo F2:GCCAACTAACGCCTCGACAA(SEQ ID NO:6)
Oligo R2:TTGTCGAGGCGTTAGTTGGC(SEQ ID NO:7)
为将目标序列连入载体中，分别在Oligo F2和Oligo R2的5’端引入酶切位点，序列如下所示(序列中小写英文表示酶切位点)：
Pro2-S(5’-3’):gtgtGCCAACTAACGCCTCGACAA(SEQ ID NO:8)
Pro2-C(5’-3’):aaacTTGTCGAGGCGTTAGTTGGC(SEQ ID NO:9)。
Pro2-S和Pro2-C由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
按照以下步骤退火形成双链DNA，即Pro2-S/C：
反应体系：Pro2-S(100μM)，10μl；Pro2-C(100μM)，10μl；10×Buffer(碧云天公司，Annealing Buffer for DNA Oligos)，20μl；无菌水60μl。
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
2、位点S1入门载体构建
①酶切反应体系为：pENTER质粒10μl(300ng/μl，大约3μg)；10×CutSmartBuffer，5μl；限制性内切酶BtgZⅠ(NEB公司)，1μl；无菌水：34μl。其中，pENTER质粒，由美国俄克拉荷马州立大学杨兵实验室赠送，是通过对从市场购得的原始pENTER质粒(LifeTechnologies公司的pENTER质粒)进行改造得到的，改造过程如下：根据水稻品种日本晴的基因序列，合成两个水稻U6启动子，在启动子的下游添加一个BtgZI或BsaI酶切位点，启动子序列、酶切位点序列以及tracrRNA尾部序列送公司(Genscript公司)合成，最后将合成的序列克隆至市场购得的原始pENTER质粒中(具体的改造过程还可以参考以下文献：Zhou等，2014，Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes indeucedby CRISPR/Cas9 in rice；Cong等，2013，Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas system)。
②37℃过夜孵育8小时。
③回收切开的pENTER质粒，浓度调至50ng/μl。
④位点S1连接
反应体系：切开的pENTER质粒，1μl(约50ng/μl)；退火后的Pro1-S/C，1μl；T4 DNA连接酶，1μl；10×T4 DNA连接酶Buffer，1μl；无菌水61μl。
4℃孵育2小时，然后放至16℃过夜。
⑤转化感受态细胞
将上述连接产物10μl加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上放置20分钟；42℃热激(也可称为热击)90秒后立即放入冰中放置10分钟；加入1ml的SOC液体培养基(购自TAKARA公司)中振荡培养1小时；5000rpm离心2min；弃去上清；悬浮菌体，涂在固体LB培养基(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)上，37℃培养过夜直到菌落长出。
⑥挑选阳性克隆
挑取上述长出的菌落，放入LB液体培养基(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中振荡培养12小时，用质粒提取试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 250-Prep，购自Axygen公司)提取质粒。
⑦对上述提取的质粒进行测序验证，并将构建好的载体命名为pENTER-1质粒。
3、位点S2入门载体构建
①酶切反应体系为：pENTER-1质粒10μl(300ng/μl，大约3ug)；10×CutSmartBuffer，5μl；限制性内切酶Bsa I(NEB公司)，1μl；无菌水：34μl。
②37℃过夜孵育8小时。
③回收切开的pENTER-1质粒，浓度调至50ng/μl。
④位点S2连接
反应体系：切开的pENTER-1质粒，1μl(约50ng/μl)；退火后的Pro2-S/C，1μl；T4DNA连接酶，1μl；10×T4 DNA连接酶Buffer，1μl；无菌水61μl。
4℃孵育2小时，然后放至16℃过夜。
⑤转化感受态细胞
将上述连接产物10μl加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上放置20分钟；42℃热激(也可称为热击)90秒后立即放入冰中放置10分钟；加入1ml的SOC液体培养基中振荡培养1小时；5000rpm离心2min；弃去上清；悬浮菌体，涂在固体LB培养基上，37℃培养过夜直到菌落长出。
⑥挑选阳性克隆
挑取上述长出的菌落，放入LB液体培养基中振荡培养12小时，用质粒提取试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 250-Prep，购自Axygen公司)提取质粒。
⑦对上述提取的质粒进行测序验证，并将构建好的载体命名为pENTER-1-2质粒。
4、表达载体构建
①pENTER-1-2质粒酶切：反应体系为pENTER-1-2质粒10μl(300ng/μl，大约3μg)；10×CutSmart Buffer，5μl；限制性内切酶Aat III(NEB公司)，1μl；无菌水：34μl。
②37℃过夜孵育8小时。
③回收切开的pENTER-1-2质粒，浓度调至50ng/μl。
④Gateway重组：pENTER-1-2质粒，0.5μl(约150ng)；质粒pUbi-Cas90.5μl(约150ng)；TE Buffer(pH＝8)(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，7μl；LR clonaseⅡEnzyme mix(Thermo Fisher Scientific公司)，2μl；25℃下反应过夜。
其中，质粒pUbi-Cas9，由美国俄克拉荷马州立大学杨兵实验室赠送，是通过对从市场购得的载体pCAMBIA1300(CAMBIA Health Solutions公司)进行改造而得的，其改造过程如下：利用限制性内切酶BamHI和SpeI，将经密码子优化的SpCas9基因连在玉米ubiquitin 1启动子和NOS终止子中间。利用Gateway同源重组将已连好的SpCas9连入载体pCAMBIA1300(CAMBIA Health Solutions公司)，由此构建表达载体pUbi-Cas9(具体的改造过程还可以参考以下文献：Zhou等，2014，Large chromosomal deletions and heritablesmall genetic changes indeuced by CRISPR/Cas9 in rice；Jiang等，2013，Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification inArabidopsis，tobacco，sorghum and rice)。
⑤终止Gateway反应：每个反应体系中加入1μl的Proteinase K(Thermo FisherScientific公司)，37℃下反应10min。
⑥转化感受态细胞
将上述反应产物10μl加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上放置20分钟；42℃热激90秒后立即放入冰中放置10分钟；加入1ml的SOC液体培养基中振荡培养1小时；5000rpm离心2min；弃去上清；悬浮菌体，涂在固体LB培养基上，37℃培养过夜直到菌落长出。
⑦挑选阳性克隆
挑取上述长出的菌落，放入LB液体培养基中振荡培养12小时，用质粒提取试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 250-Prep，购自Axygen公司)提取质粒。
⑧对上述提取的质粒进行测序验证，并将构建好的载体命名为pUbi-pENTER-1质粒。
5、取1μg左右的pUbi-pENTER-1质粒DNA加入到200μl农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；在37℃水浴5min或42℃水浴1min,液氮中5min，可重复1-2次；接着冰浴2min，加入800μl YEB液体培养基，28℃、175rpm摇培3小时后，涂在含50μg/ml卡那霉素的YEB平板上；28℃培养到形成农杆菌单克隆。
6、农杆菌介导水稻转基因
①水稻种子(哈勃601)消毒后，将种子转移到成熟胚(NBD/N6D)诱导培养基中，28℃暗培养7-10天；用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织置入继代培养基中，继代培养1-2次，每次2周，暗培养；1-2次继代培养后，挑取愈伤组织在继代培养基上培养4-7天后用于遗传转化。
②挑取上述验证成功的农杆菌单克隆于4ml YEP(含50mg/lKan和30mg/l Rif)培养液中，28℃，250rpm振荡过夜培养。
③从含有农杆菌的YEP培养液中吸取1-2ml，转入25-50ml AB(Rif30+Kan 50+As100μmol/l)液体培养基中培养，28℃，250rpm，4小时左右OD600＝0.4-0.6。
④取培养好的菌液于离心管中，4000rmp，离心8min，弃上清。用含100μmol/l As的等体积AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.4-0.6。
⑤取出继代培养4-7天的愈伤组织，放入农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间不停摇晃，也可在摇床上100rpm，振荡培养30min。
⑥将愈伤组织置于垫有一层无菌滤纸的共培养基上，每皿加入1ml AAM培养液湿润滤纸，28℃暗培养3天。
⑦将愈伤组织取出，用0.1mol/l甘露醇清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)的无菌水清洗5-6遍。最后置于无菌滤纸上沥干30min。
⑧将晾干的愈伤转入含500mg/l羧苄青霉素和25-30mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。
⑨将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，暗培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
⑩最后在含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)和70mg/l潮霉素的培养基上进行第三轮筛选。
Figure BDA0002345464110000121
将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，28℃，暗培养7天，之后光照培养7天。
Figure BDA0002345464110000122
挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗(15-30天)，待苗长至1cm左右，放入生根培养基(1/2MS培养基)中壮苗。
Figure BDA0002345464110000123
将苗根部和茎叶分化得较完好的挑出，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，获得水稻LOC_Os06g04200基因的CRISPR靶向编辑的群体(即T0代转基因再生植株)。
7、T0代转基因再生植株鉴定，利用潮霉素抗性基因标记筛选阳性转基因植株。具体方法如下：
①DNA提取：取T0代转基因再生植株的少量叶片放入PCR板，加70ul缓冲液A(每10ml中，DW：8800ul；20％tween：1000ul；5M NaoH：200ul)；然后，PCR仪95℃加热10min；再加70ul缓冲液B(每10ml中，DW：8960ul；1M Tris-Hcl：1000ul；0.5M EDTA：40ul)，震荡、离心，所得上清为T0代转基因再生植株的基因组DNA。
②潮霉素抗性基因检测：
利用引物HYG-F/R对上述提取的基因组DNA进行扩增，扩增长度为564bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，能扩增出目标条带的植株鉴定为阳性转基因再生植株。引物HYG-F/R的核苷酸序列如下所示：
HYG-F(5’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3’)(SEQ ID NO:10)
HYG-R(5’-GTCCTGCGGGTAAATAGC-3’)(SEQ ID NO:11)。
PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)64.8℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min。
8、对筛选出的所有阳性转基因再生植株进行测序验证，确定突变类型。
①DNA提取：取筛选出的阳性转基因再生植株的少量叶片放入PCR板，加70ul缓冲液A(每10ml中，DW：8800ul；20％tween：1000ul；5M NaoH：200ul)；然后，PCR仪95℃加热10min；再加70ul缓冲液B(每10ml中，DW：8960ul；1M Tris-Hcl：1000ul；0.5M EDTA：40ul)，震荡、离心，所得上清为T0代转基因再生植株的基因组DNA。
②靶位点S1扩增：
利用引物SeqPro1-F/R对①所得基因组DNA进行扩增，扩增长度为292bp。PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.0℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min。引物SeqPro1-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro1-F(5’-TGAAGGACGGAAATTGGAT-3’)(SEQ ID NO:12)
SeqPro-1-R(5’-TCTTGCAGGTCACAGCATT-3’)(SEQ ID NO:13)。
③靶位点S2扩增：
利用引物SeqPro2-F/R对①所得基因组DNA进行扩增，扩增长度为214bp。PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.5℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min。引物SeqPro2-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro2-F(5’-ATGTCCTACGGAATGACGA-3’)(SEQ ID NO:14)
SeqPro2-R(5’-AAAGAACTTGGAATTACGCTAC-3’)(SEQ ID NO:15)。
上述②和③所得的PCR扩增产物送杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，最终鉴定出3株在启动子区域含两个突变位点的基因编辑突变单株，记为pUbi-pENTER-1-1、pUbi-pENTER-1-2、pUbi-pENTER-1-3，对应于表1中1-1、1-2、1-3。比对测序结果发现突变都为纯合突变，以缺失插入为主，具体结果见表1。
表1 实施例1中启动子突变体情况
Figure BDA0002345464110000141
实施例2
1、选取基因编辑靶位点并设计相应的序列。
①选取水稻LOC_Os06g04200基因启动子ATG上游2589-2570位作为第一编辑靶位点S1，确定第一编辑靶位点S1所对应的一对互为反向互补的oligo序列DNA，其核苷酸序列如下所示：
Oligo F1:GCTTATTACAGCCGTGGGAG(SEQ ID NO:2)
Oligo R1:CTCCCACGGCTGTAATAAGC(SEQ ID NO:3)
为将目标序列连入载体中，分别在Oligo F1和Oligo R1的5’端引入酶切位点，序列如下所示(序列中小写英文表示酶切位点)：
Pro1-S(5’-3’):tgttGCTTATTACAGCCGTGGGAG(SEQ ID NO:4)
Pro1-C(5’-3’):aaacCTCCCACGGCTGTAATAAGC(SEQ ID NO:5)
Pro1-S和Pro1-C由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
按照以下步骤退火形成双链DNA，即Pro1-S/C：
反应体系：Pro1-S(100μM)，10μl；Pro1-C(100μM)，10μl；10×Buffer(碧云天公司，Annealing Buffer for DNA Oligos)，20μl；无菌水60μl。
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
②选取水稻LOC_Os06g04200基因启动子ATG上游1474-1455位作为第二编辑靶位点S3，确定第二编辑靶位点S3所对应的一对互为反向互补的oligo序列DNA，其核苷酸序列如下所示：
Oligo F3(5’-3’):GCTCTGAGGCACTGACGTGC(SEQ ID NO:16)
Oligo R3(5’-3’):GCACGTCAGTGCCTCAGAGC(SEQ ID NO:17)。
为将目标序列连入载体中，分别在Oligo F3和Oligo R3的5’端引入酶切位点，序列如下所示(序列中小写英文表示酶切位点)：
Pro3-S(5’-3’):gtgtGCTCTGAGGCACTGACGTGC(SEQ ID NO:18)
Pro3-C(5’-3’):aaacGCACGTCAGTGCCTCAGAGC(SEQ ID NO:19)。
Pro3-S和Pro3-C由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
按照以下步骤退火形成双链DNA，即Pro3-S/C：
反应体系：Pro3-S(100μM),10μl；Pro3-C(100μM),10μl；10×Buffer,20μl；无菌水60μl。
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
2、位点S1入门载体构建，同实施例1。
3、位点S3入门载体构建
①酶切反应体系为：pENTER-1质粒10μl(300ng/μl，大约3ug)；10×CutSmartBuffer，5μl；限制性内切酶Bsa I(NEB公司)，1μl；无菌水：34μl。
②37℃过夜孵育8小时。
③回收切开的pENTER-1质粒载体，浓度调至50ng/μl。
④位点S3连接
反应体系：切开的pENTER-1质粒，1μl(约50ng/μl)；退火后的Pro3-S/C，1μl；T4DNA连接酶，1μl；10×T4 DNA连接酶Buffer，1μl；无菌水61μl。
4℃孵育2小时，然后放至16℃过夜。
⑤转化感受态细胞
将上述连接产物10μl加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上放置20分钟；42℃热激(也可称为热击)90秒后立即放入冰中放置10分钟；加入1ml的SOC液体培养基中振荡培养1小时；5000rpm离心2min；弃去上清；悬浮菌体，涂在固体LB培养基上，37℃培养过夜直到菌落长出。
⑥挑选阳性克隆
挑取上述长出的菌落，放入LB液体培养基中振荡培养12小时，用质粒取试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 250-Prep,购自Axygen公司)提取质粒。
⑦对上述提取的质粒进行测序验证，并将构建好的载体命名为pENTER-1-3质粒。
4、表达载体构建
①pENTER-1-3质粒酶切：反应体系为pENTER-1-3质粒10μl(300ng/μl，大约3μg)；10×CutSmart Buffer，5μl；限制性内切酶Aat III(NEB公司)，1μl；无菌水：34μl。
②37℃过夜孵育8小时。
③回收切开的pENTER-1-3质粒载体，浓度调至50ng/μl。
④Gateway重组：pENTER-1-3质粒，0.5μl(约150ng)；质粒pUbi-Cas9(同实施例1)，0.5μl(约150ng)；TE Buffer(pH＝8)，7μl；LR clonase Ⅱ Enzyme mix 2μl，25℃下反应过夜。
⑤终止Gateway反应：每个反应体系中加入1μl的Proteinase K，37℃下反应10min。
⑥转化感受态细胞
将上述反应产物10μl加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上放置20分钟；42℃热激90秒后立即放入冰中放置10分钟；加入1ml的SOC液体培养基中振荡培养1小时；5000rpm离心2min；弃去上清；悬浮菌体，涂在固体LB培养基上，37℃培养过夜直到菌落长出。
⑦挑选阳性克隆
挑取上述长出的菌落，放入LB液体培养基中振荡培养12小时，用质粒取试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 250-Prep，购自Axygen公司)提取质粒。
⑧对上述提取的质粒进行测序验证，并将构建好的载体命名为pUbi-pENTER-2质粒。
5、取1μg左右的pUbi-pENTER-2质粒DNA加入到200μl农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；在37℃水浴5min或42℃水浴1min，液氮中5min，可重复1-2次；接着冰浴2min，加入800μl YEB液体培养基，28℃、175rpm摇培3小时后，涂在含50μg/ml卡那霉素的YEB平板上；28℃培养到形成农杆菌单克隆。
6、农杆菌介导水稻转基因
①水稻种子(哈勃601)消毒后，将种子转移到成熟胚(NBD/N6D)诱导培养基中，28℃暗培养7-10天；用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织置入继代培养基中，继代培养1-2次，每次2周，暗培养；1-2次继代培养后，挑取愈伤组织在继代培养基上培养4-7天后用于遗传转化。
②挑取上述验证成功的农杆菌单克隆于4ml YEP(含50mg/lKan和30mg/l Rif)培养液中，28℃，250rpm振荡过夜培养。
③从含有农杆菌的YEP培养液中吸取1-2ml，转入25-50ml AB(Rif30+Kan 50+As100μmol/l)液体培养基中培养，28℃，250rpm，4小时左右OD600＝0.4-0.6。
④取培养好的菌液于离心管中，4000rmp，离心8min，弃上清。用含100μmol/l As的等体积AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.4-0.6。
⑤取出继代培养4-7天的愈伤组织，放入农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间不停摇晃，也可在摇床上100rpm，振荡培养30min。
⑥将愈伤组织置于垫有一层无菌滤纸的共培养基上，每皿加入1ml AAM培养液湿润滤纸，28℃暗培养3天。
⑦将愈伤组织取出，用0.1mol/l甘露醇清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)的无菌水清洗5-6遍。最后置于无菌滤纸上沥干30min。
⑧将晾干的愈伤转入含500mg/l羧苄青霉素和25-30mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。
⑨将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，暗培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
⑩最后在含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)和70mg/l潮霉素的培养基上进行第三轮筛选。
Figure BDA0002345464110000171
将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，28℃，暗培养7天，之后光照培养7天。
Figure BDA0002345464110000172
挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗(15-30天)，待苗长至1cm左右，放入生根培养基(1/2MS培养基)中壮苗。
Figure BDA0002345464110000173
将苗根部和茎叶分化得较完好的挑出，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，获得水稻LOC_Os06g04200基因的CRISPR靶向编辑的群体(即T0代转基因再生植株)。
7、T0代转基因再生植株鉴定，利用潮霉素抗性基因标记筛选阳性转基因植株。具体方法如下：
①DNA提取：取T0代转基因再生植株的少量叶片放入PCR板，加70ul缓冲液A(每10ml中，DW：8800ul；20％tween：1000ul；5M NaoH：200ul)；然后，PCR仪95℃加热10min；再加70ul缓冲液B(每10ml中，DW：8960ul；1M Tris-Hcl：1000ul；0.5M EDTA：40ul)，震荡、离心，所得上清为T0代转基因再生植株的基因组DNA。
②潮霉素抗性基因检测：
利用引物HYG-F/R对上述提取的基因组DNA进行扩增，扩增长度为564bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，能扩增出目标条带的植株鉴定为阳性转基因再生植株。引物HYG-F/R的核苷酸序列如下所示：
HYG-F(5’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3’)(SEQ ID NO:10)
HYG-R(5’-GTCCTGCGGGTAAATAGC-3’)(SEQ ID NO:11)。
PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)64.8℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min。
8、对筛选出的所有阳性转基因再生植株进行测序验证，确定突变类型。
①DNA提取：分别取筛选出的阳性转基因再生植株的少量叶片放入PCR板，加70ul缓冲液A(每10ml中，DW：8800ul；20％tween：1000ul；5M NaoH：200ul)；然后，PCR仪95℃加热10min；再加70ul缓冲液B(每10ml中，DW：8960ul；1M Tris-Hcl：1000ul；0.5M EDTA：40ul)，震荡、离心，所得上清为阳性转基因再生植株的基因组DNA。
②靶位点S1扩增：
利用引物SeqPro1-F/R对①所得基因组DNA进行扩增，扩增长度为292bp。PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.0℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min。引物SeqPro1-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro1-F(5’-TGAAGGACGGAAATTGGAT-3’)(SEQ ID NO:12)
SeqPro-1-R(5’-TCTTGCAGGTCACAGCATT-3’)(SEQ ID NO:13)。
③靶位点S3扩增：
利用引物SeqPro3-F/R对①所得基因组DNA进行扩增，扩增长度为341bp。PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)53.5℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min。引物SeqPro3-F/R的核苷酸序列如下所示：
SeqPro3-F(5’-GAAACGGCAGGCAGCATCG-3’)(SEQ ID NO:20)
SeqPro3-R(5’-TGGGTGGCTATTTGTAGCG-3’)(SEQ ID NO:21)。
上述②和③所得的PCR扩增产物送杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，最终鉴定出3株在启动子区域含两个突变位点的基因编辑突变单株，记为pUbi-pENTER-2-1、pUbi-pENTER-2-2、pUbi-pENTER-2-3，对应于表2中2-1、2-2、2-3。比对测序结果发现突变都为纯合突变，以缺失插入为主，具体结果见表2。
表2 实施例2中启动子突变体情况
Figure BDA0002345464110000191
实施例3创制变异结果
取T0代转基因阳性植株1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3，分别进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株T1-1-1、T1-1-2、T1-1-3、T1-2-1、T1-2-2、T1-2-3。对T1代植株按照以下方法进行直链淀粉含量测定：
稻米胚乳直链淀粉含量测定按照农业部部颁标准NY147-88的方法测定(1986)。精米粉直链淀粉含量测定方法如下：
(1)称待测样本精米粉0.01±0.0001g于10mL有盖的玻璃试管中；
(2)在每个试管中加入100μl 95％的乙醇，轻轻晃动使样品充分湿润和分散；随后加入1M的NaOH溶液900μl，盖上盖子，立即置于沸水中水浴10min；
(3)待样品冷却至室温后，加蒸馏水定容至10mL，混匀；
(4)从上述液体中吸取200μl于5mL离心管中，再加3.8mL的I2溶液(含2％的I2和2％的KI溶液1.5mL,1M的乙酸1mL,定容至100mL)；
(5)室温静置10min后，样品在620nm波长下利用分光光度仪上测定光密度，三次重复取平均值。
(6)用标准样品测得的光密度值及对应的直链淀粉含量值制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的直链淀粉含量。
T1代植株T1-1-1、T1-1-2、T1-1-3、T1-2-1、T1-2-2、T1-2-3中直链淀粉含量的测定结果，如表3所示。
表3 T1代植株中直链淀粉含量
Figure BDA0002345464110000201
由表3可见：
T1代植株T1-1-1、T1-1-2、T1-1-3的直链淀粉含量分别为14.2％，13.4％，14.7％的变异，含量都低于受体品种哈勃601的15.5％的直链淀粉含量。与哈勃601(野生型)相比，T1代植株T1-1-1、T1-1-2、T1-1-3的直链淀粉含量分别下降了8.3％、13.5％、5.2％。
T1代植株T1-2-1、T1-2-2、T1-2-3的直链淀粉含量分别为14.7％，11.6％，13.9％的变异，含量都低于受体品种哈勃601的15.5％的直链淀粉含量。与野生型哈勃601相比，T1代植株T1-2-1、T1-2-2、T1-2-3的直链淀粉含量分别下降了5.2％、25.2％、10.3％，
可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
序列表
<110> 浙江大学
嘉兴市农业科学研究院
无锡哈勃生物种业技术研究院有限公司
<120> 一种利用启动子编辑创制水稻直链淀粉含量变异的方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4299
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
ccacggctga cagaaccgtc acgtaagaca aaaccggggt aaaaaccacc taagaagctc 60
gggtaaccgg ttttgtatag ttaagagatc ccgtatatct ggttttgtgg ttcgaggatg 120
tttttttatc ccgatgataa gttgagggac cttcggtgta ctttttcctg gtacattatg 180
gaatcttcaa aggccagatt tcaattcaat ttgggcttta gtttgccctt tttttatatg 240
gaataagttt atctaaggtc ccttaacttg tcaacgaatc cgattttcgt ccttcaacaa 300
caaaaccaga tacaacggat ccctcaacta tcaaaactgg tgcagattag gtccctcggc 360
ggttttgacg gcggttttgg ctgacgtggc gcctacgtgg ctaatttgac ttagtctcga 420
tctgacgtgg tgcttacgtg gcaattcgat ctgaaaaata ataaacctca tgggacccac 480
atgtcagttt cacacataaa ttaataaaaa atggtgggcc cacgtgtcag cctccctctc 540
ccttctctct cttcttcatc ctcactcctc tcttcttcct ttcccctctc ccctctctct 600
ctcttctttc caggcggcgg acggcacggg tgggcgacgg agcaggcgag cgaggcgcgc 660
tgtccaacgt cgactacgac cgcctgctcg cccccgtcaa ggcgtcgccg cagccgctgt 720
ccagggaggg cgaggaggag gagggggaca tcgccatggt cgccgcccag agcttcgtct 780
ccacgcagga ctccgcctcc gacaccgtgg tcgactactc cggcaacgag gacgaattcc 840
acgaggtacc tgaaccccga cgacgacgtc tctgacttcc gggaggtata catcctcatt 900
tatcagtcta acactagtac attctctgct aattgcctgt gttatcaagc atgtatttga 960
caatgctatc tgttaatgca acatctcttg acacatgctc gccggagggc cgttcgacgg 1020
caccgagatg aacctggcga gggtgtttgg cacagcgctc gtcggctggc gctggaggca 1080
ccactgggtg tactagctcg gccccttcat cggcgccagc ctcgccgagc ttctctacga 1140
gtacctcgac atcccgtccg ccgacgccac cccgcacggc ggcgcgcacc agccgctggc 1200
accggaggac tactagatcc gctgccgccc cgaatcgccc gtgccaccgt cgcaggagaa 1260
gagatgtgag agagagttga agagatggga gatgagggga gaggacagga agaagagggg 1320
tgggaatgat acgtggggcc cacgtgggcc ccaccatttt ttattaattt ctgggtgaaa 1380
cttacaagtg ggtcccatga ggtttattat tttttcggat aaattgccac gtaagcgtca 1440
catcagcgcc acgtcagatc gagaccaagt caaattagcc acgtaggcgc cacgtcagcc 1500
aaaaccgccg tcaaaaccgc cgagggacct aatctgcacc ggttttaata gttgagagac 1560
ccgttgtatc tggttttgcg gttgaaggac ggaaattgga tttattgaca agtcaaggga 1620
ccttagatga acttattcct ttttatattt gcacaggcct aatttcaagt ccagcccagc 1680
tttcttcagc ctgtttgata attctctcta gcttattaca gccgtgggag aggagatata 1740
cagctacaag attacaagtc gatgtataca gcaaacccat gagctgattg cctgattaga 1800
cggtaagaat gcatccctga gaagcaaatg catcaccaaa tttgtagctt agataaatgc 1860
tgtgacctgc aagaaaataa aattaaaatc aaaataaaag aaaagcgcag gtaattgaca 1920
ccccacgcat ataagtgtag atacataaca cgttcatcta atcatcttaa ttagacttag 1980
gtaaaactac aatgaggttt atgtcctacg gaatgacgac aagctagcag cacagaggca 2040
cagatcatat cgtctccaga ctcaagtgca cgttgatcgt tcgctcactg cttcatcgat 2100
catccctttg tcgaggcgtt agttggcagg cactaatagc tacagtaaag taaagagcaa 2160
cgtgccaacg tacgcacgct aacgtgagtc atgtagcgta attccaagtt cttttttttt 2220
tgtcagcacg tacaagcagc cgctagcctc gccctgcatg agaagctcgc ggcgcgccac 2280
caaactggca ggcactcagc tcgctgctgg tcccgcacgt cgccacacga tcgacgtacg 2340
cacgcgagcg agatccaccg atggtttacg cgtacgccga cggctcacac atcccccggt 2400
gcccaacaga aaccacacac cacccgcacg aaaaaaaccg aaccgcacgt gcgcgcgcgc 2460
tccacgcaca ccccaaacag acggcacggc gggagcgcgc gcgcgcacgc gagccgagga 2520
gaaaacaaac gggggaaaca agctggaaaa gcaaaagggg aaaagaacgg agcggaggct 2580
tcacccacgg ccaccgcgac gcgccaccag cgtgcggtgc aatgcaacgt acgccaagcc 2640
gaaacggcag gcagcatcgc gcacgcacgc acacacaggc cacagcacac gcgagcgacg 2700
tacgcgagtg catgcagatg catgcgcggg gctcgcgcga gaccggccga tgggttcgct 2760
tctcttctct ctcccgtccc gttgcgtcgt catagacaaa agtcggtttt gcttttggtt 2820
ttttggctct gaggcactga cgtgcgggcc agcgtacgcc tgcgtgcccc gcatgtcatc 2880
gtcgacaccg gccggggacc gggtaaaatg tgttgcggga gggagagggg gagagagaga 2940
tcgcgcgggc ttcacgcaac ggcgctacaa atagccaccc acaccaccac cccctctctc 3000
accattcctt cagttctttg tctatctcaa gacacaaata actgcagtct ctctctctct 3060
ctctctctct ctctctctct ctctgcttca cttctctgct tgtgttgttc tgttgttcat 3120
caggaagaac atctgcaagt tatacatata tgtttataat tctttgtttc ccctcttatt 3180
cagatcgatc acatgcatct ttcattgctc gtttttcctt acaagtagtc tcatacatgc 3240
taatttctgt aaggtgttgg gctggaaatt aattaattaa ttaattgact tgccaagatc 3300
catatatatg tcctgatatt aaatcttcgt tcgttatgtt tggttaggct gatcaatgtt 3360
attctagagt ctagagaaac acacccaggg gttttccaac tagctccaca agatggtggg 3420
ctagctgacc tagatttgaa gtctcactcc ttataattat tttatattag atcattttct 3480
aatattcgtg tcttttttta ttctagagtc tagatcttgt gttcaactct cgttaaatca 3540
tgtctctcgc cactggagaa acagatcagg agggtttatt ttgggtatag gtcaaagcta 3600
agattgaaat tcacaaatag taaaatcaga atccaaccaa ttttagtagc cgagttggtc 3660
aaaggaaaat gtatatagct agatttattg ttttggcaaa aaaaaatctg aatatgcaaa 3720
atacttgtat atctttgtat taagaagatg aaaataagta gcagaaaatt aaaaaatgga 3780
ttatatttcc tgggctaaaa gaattgttga tttggcacaa ttaaattcag tgtcaaggtt 3840
ttgtgcaaga attcagtgtg aaggaataga ttctcttcaa aacaatttaa tcattcatct 3900
gatctgctca aagctctgtg catctccggg tgcaacggcc aggatattta ttgtgcagta 3960
aaaaaatgtc atatccccta gccacccaag aaactgctcc ttaagtcctt ataagcacat 4020
atggcattgt aatatatatg tttgagtttt agcgacaatt tttttaaaaa cttttggtcc 4080
tttttatgaa cgttttaagt ttcactgtct ttttttttcg aattttaaat gtagcttcaa 4140
attctaatcc ccaatccaaa ttgtaataaa cttcaattct cctaattaac atcttaattc 4200
atttatttga aaaccagttc aaattctttt aggctcacca aaccttaaac aattcaattc 4260
agtgcagaga tcttccacag caacagctag acaaccacc 4299
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttattaca gccgtgggag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcccacggc tgtaataagc 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgttgcttat tacagccgtg ggag 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaacctccca cggctgtaat aagc 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaactaac gcctcgacaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgtcgaggc gttagttggc 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgtgccaac taacgcctcg acaa 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacttgtcg aggcgttagt tggc 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agaagaagat gttggcgacc t 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcctgcggg taaatagc 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaaggacgg aaattggat 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcttgcaggt cacagcatt 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgtcctacg gaatgacga 19
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaagaacttg gaattacgct ac 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctctgaggc actgacgtgc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcacgtcagt gcctcagagc 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgtgctctg aggcactgac gtgc 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaacgcacgt cagtgcctca gagc 24
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaacggcag gcagcatcg 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgggtggcta tttgtagcg 19

Claims (10)

1.一种利用启动子编辑创制水稻直链淀粉含量变异的方法，包括以下步骤：
(1)选取水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的第一编辑靶位点和第二编辑靶位点，分别确定第一编辑靶位点所对应的第一对oligo序列和第二编辑靶位点所对应的第二对oligo序列，并在每对oligo序列的5’端引入酶切位点，设计和合成相应的第一对Pro序列和第二对Pro序列；
其中，第一编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2589-2570位，第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位或者水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位；
(2)构建双靶点CRISPR/Cas9基因编辑表达载体；
(3)将所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑表达载体转入农杆菌，通过农杆菌介导转化将所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体导入受体水稻品种，得到T0代转基因再生植株；
(4)对所述T0代转基因再生植株进行潮霉素抗性基因检测，找到转基因阳性植株；
(5)针对第一编辑靶位点和第二编辑靶位点设计引物，利用引物对所述转基因阳性植株的基因组DNA进行PCR扩增，测序鉴定出在水稻LOC_Os06g04200基因的启动子区域含两个突变位点的基因编辑纯合突变单株；
(6)对T1代纯合突变单株的表型进行分析，确认获得水稻直链淀粉含量变异植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，
第一对oligo序列中，Oligo F1序列如SEQ ID NO:2所示，Oligo R1序列如SEQ ID NO:3所示；第一对Pro序列中，Pro1-S序列如SEQ ID NO:4所示，Pro1-C序列如SEQ ID NO:5所示；
当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，第二对oligo序列中，Oligo F2序列如SEQ ID NO:6所示，Oligo R2序列如SEQ ID NO:7所示；第二对Pro序列中，Pro2-S序列如SEQ ID NO:8所示，Pro2-C序列如SEQ ID NO:9所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，
第一对oligo序列中，Oligo F1序列如SEQ ID NO:2所示，Oligo R1序列如SEQ ID NO:3所示；第一对Pro序列中，Pro1-S序列如SEQ ID NO:4所示，Pro1-C序列如SEQ ID NO:5所示；
当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，第二对oligo序列中，Oligo F3序列如SEQ ID NO:16所示，Oligo R3序列如SEQ ID NO:17所示；第二对Pro序列中，Pro3-S序列如SEQ ID NO:18所示，Pro3-C序列如SEQ ID NO:19所示。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，步骤(1)中，对合成的所述第一对pro序列和第二对pro序列分别进行退火形成双链DNA，具体条件如下：
双链DNA Pro1-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro1-S，100μM，10μl；Pro1-C，100μM，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃；
双链DNA Pro2-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro2-S，100μM，10μl；Pro2-C，100μM，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，步骤(1)中，对合成的所述第一对pro序列和第二对pro序列分别进行退火形成双链DNA，具体条件如下：
双链DNA Pro1-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro1-S，100μM，10μl；Pro1-C，100μM，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃；
双链DNA Pro3-S/C通过以下步骤合成：
反应体系：Pro3-S，100μM，10μl；Pro3-C，100μM，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水60μl；反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到25℃。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，步骤(2)中，所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建过程如下：
用BtgZⅠ酶切pENTER质粒，回收并纯化切开的pENTER质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro1-S/C连入pENTER质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得含有第一编辑靶位点入门载体pENTER-1；
用Bsa I酶切pENTER-1质粒，回收并纯化切开的pENTER-1质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro2-S/C连入pENTER-1质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得同时含有第一和第二编辑靶位点入门载体pENTER-1-2；
用Aat III酶切pENTER-1-2质粒，和pUbi-Cas9质粒进行Gateway重组，用Proteinase K终止Gateway反应，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体pUbi-pENTER-1。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，步骤(2)中，所述双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建过程如下：
用BtgZⅠ酶切pENTER质粒，回收并纯化切开的pENTER质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro1-S/C连入pENTER质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得含有第一编辑靶位点入门载体pENTER-1；
用Bsa I酶切pENTER-1质粒，回收并纯化切开的Penter-1质粒，利用T4DNA连接酶将退火后的引物Pro3-S/C连入pENTER-1质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得同时含有第一和第二编辑靶位点入门载体pENTER-1-3；
用Aat III酶切pENTER-1-3质粒，和pUbi-Cas9质粒进行Gateway重组，用Proteinase K终止Gateway反应，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，获得双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体pUbi-pENTER-2。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，潮霉素抗性基因检测所用引物对中，HYG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，HYG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，
在第一编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，SeqPro1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.0℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为292bp；
当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的2192-2173位，在第二编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，SeqPro2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.5℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为214bp。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，
在第一编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，SeqPro1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)52.0℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为292bp；
当第二编辑靶位点为水稻LOC_Os06g04200基因的启动子ATG上游的1474-1455位，在第二编辑靶位点PCR扩增所用引物SeqPro3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，SeqPro3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；PCR反应程序为：(1)94℃5min；(2)94℃30s；(3)53.5℃30s；(4)72℃30s；步骤(2)-步骤(4)重复35个循环；(5)72℃5min，扩增长度为341bp。
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