CN113584199A - 水稻冷不回生性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种水稻冷不回生性状相关的分子标记。该分子标记为靠近水稻6号染色体6718941‑6799600区间位置的核苷酸序列。发明人发现靠近所定位的冷不回生基因区段的核苷酸序列表现为插入/缺失长度多态性。发明人将靠近水稻6号染色体6718941‑6799600区间位置的核苷酸序列作为确定水稻冷不回生性状相关的分子标记。

Description

水稻冷不回生性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记及其应用。具体地，本发明涉及水稻冷不回生性状相关的分子标记，用于检测前述分子标记的引物对和试剂盒，前述分子标记、引物对、试剂盒在水稻选育中的用途，以及检测水稻冷不回生性状的方法。

背景技术

随着水稻育种技术发展，人们生活水平提高，水稻生产模式和消费要求也在提高。同时，伴随经济贸易的全球化，大米市场面临的国际竞争也在增强。因此，对于水稻品质改良即优质水稻品种的培育，是目前水稻育种中一个重要的研究方向。

优质稻米中，软米是国际上公认的优质稻米类型，在我国云南、东南亚、日本等国家和地区均有种植，它是从野生稻中经多代选择培育出的一种优质稻，部分品种具有香味，米质优良，软米因其蒸煮米饭柔软，冷不回生，食用时冷热皆宜而得名。

冷不回生性状是指煮熟糊化的大米在放冷之后回生变硬，市场上大部分大米均有回生现象。目前研究发现，有一种看法认为回生的原因是在比较低的温度下，已经完全糊化的淀粉，会因干燥脱水使原来因加热糊化而被破坏的淀粉分子之间的氢键重新发生聚合，导致一部分无固定形态的淀粉分子有序的重新排列，从而结晶形成凝胶体的现象。这从化学方面解释了回生的原因，但是对于冷不回生的分子遗传机制的研究仍然是空白。

目前研究中以直链淀粉含量来划分软米品种，其主要指标为直链淀粉含量在10％左右的低直链淀粉水稻品种，这些品种稻米蒸煮后米饭柔软、外观油润光泽、而且具备冷不回生的特点。相对应的研究中，其研究指标主要是针对胚乳淀粉中直链淀粉的含量。直链淀粉含量高，米饭表现为口感硬、粘性小、光泽差；如果含量低，则表现为米饭口感软粘，光泽好。

正因为直链淀粉含量对于稻米食味品质的影响，所以通过降低直链淀粉含量来改善稻米食味品质是水稻品质改良育种的一个主要途径。培育优质低直链淀粉水稻品种，不仅可以满足中国国内多样化的消费需求，还有助于开拓国际稻米市场。

针对直链淀粉含量的研究，目前已发现了14个控制水稻低直链淀粉含量的基因，主要分布在第6,9,10和12染色体上。

通过对水稻直链淀粉含量的改良，现有研究最早可以从日本1996年诱变水稻品种“越光”得到软米品种“Milky Queen”，再从中研究发现突变基因Wx^mq开始⁽⁶⁾，通过利用这一基因后续选育了“关东194"、"New Hikari"、“南粳46"、“南粳5055"、“南粳9108”和“沪软12-12”等一系列品质优良的软米品种。这一研究案例表明，研究发现软米品种的相关基因，可以推动选育出一系列的软米新品种。

常规杂交育种：是育种工作中常用的传统育种技术方法。是将父母本杂交，形成具备不同的遗传多样性的杂交后代，再根据育种的目的要求，通过对杂交后代的筛选，最终获得具有父母本优良性状，且不带有父母本中不良性状的新品种的育种方法。一般针对育种目的，挑选具备改良性状的父母本，通过两者杂交构建群体后，再从群体中根据需求挑选符合需要的单株，再进行回交或自交等途径来纯化遗传背景，稳定基因组遗传背景，最终得到新品种。育种进程中一般通过形态学、化学等性状做为判断，用于挑选单株进行下一代的选育。

而常规杂交育种缺点是过程缓慢，过程复杂。对于冷不回生性状，必须等到植株完全成熟，收种再测种子的直链淀粉含量来选育，育种进程长，表型调查效率低下，且易挑选杂合后代导致后代分离影响品种纯度。

而利用分子标记尤其是功能性分子标记来辅助选育，其选育过程在苗期即可对植株的直链淀粉含量进行基因型检测，不需要等到结实后，再对稻米进行直链淀粉含量表型检测，检测手段简便和快速，可以大幅度提高了育种效率。

而这一技术在软米品种选育上目前已得到广泛应用，且取得一系列成果。例如，刘巧泉等利用开发的功能性分子标记PCR-Acc I将Wxb基因导入籼稻品种“特青”，成功改善了“特青”的蒸煮食用品质。Wang等利用开发的CAPS标记成功选育出了“南粳46”。张士陆等借助分子标记辅助选择技术成功降低了三系籼稻恢复系057的直链淀粉含量。

我国具有丰富的低直链淀粉基因资源，云南软米是我国特有的优质籼型低直链淀粉自然变异。其中云南德宏自治州出产的地方优质米，其直链淀粉含量、蛋白质含量、糊化温度、胶稠度、精密率、长宽比、粒长等指标达到了国家优质米标准，又因其特有的冷不回生优质性状，大大提升了德宏米的食味性特性，使的德宏米在众多优质米品种中独树一帜，受到广大消费者的青睐。被誉为“贡米”，1956年，国务院有关部门把遮放米定为接待外宾国宴专用米之一。

因此，利用分子标记尤其是功能性分子标记来辅助选育，日趋称为水稻选育的优良方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本研究利用云南遮放地方优质品种毫枇以及高产大穗型籼稻品系1128作为亲本，通过单粒传的方法构建高代重组自交系群体(RIL群体)，利用高通量测序技术对双亲和RIL群体进行重测序，开发覆盖全基因组的分子标记，构建高密度遗传图谱，结合群体冷不回生性状表型，对冷不回生性状进行基因定位，找到与该优良性状相关的基因位点。

本研究利用基因组测序技术研究稻米冷不回生优质性状的调控基因和遗传机理，不仅填补了水稻冷不回生性状研究的空白，而且研究中开发的覆盖全基因组的分子标记和水稻高密度的遗传图谱也为水稻分子研究打下了基础，同时，冷不回生性状的基因定位，也将推动相关优质米的分子标记辅助育种的发展，有助于优质米品种的快速、精准选育，满足多样化的市场需求、开拓国内外优质米市场。因此，此项研究不仅具有很大的科研价值，也具有很重要的现实意义，其研究结果为以后培育冷不回生性状的水稻新品种奠定理论基础，应用前景和商业潜力都非常巨大。本研究不仅能加速水稻品质育种工作的进展，还能更有效的利用云南省独特的软米资源。

因此，通过对云南软米种质资源的研究，发掘其软米品质基因的变异位点及其等位基因，针对这些变异位点，开发分子标记用于基因筛选和水稻分子育种。分子标记辅助选择不但可以快速准确筛选种质资源，还可以加速新种质资源的创制，通过与基因紧密连锁的分子标记辅助选择，不但可以提高育种的准确性，还可以缩短育种年限，加速育种进程。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种水稻冷不回生性状相关的分子标记。根据本发明的实施例，所述分子标记为靠近水稻6号染色体6718941-6799600区间位置的核苷酸序列。发明人通过水稻RIL群体的表型数据，结合群体基因型以及遗传连锁图，通过相关软件进行QTL定位，发现水稻冷不回生性状为单基因控制性状，基因定位区间为6号染色体的6718941-6799600区间，长度约为81Kb。进而发明人根据测序结果，比对测序读段，选择靠近所定位冷不回生基因区段的标记作为分子标记，发现靠近所定位的冷不回生基因区段的核苷酸序列表现为插入/缺失长度多态性。进而，发明人将靠近水稻6号染色体6718941-6799600区间位置的核苷酸序列作为确定水稻冷不回生性状相关的分子标记。

根据本发明的实施例，上述分子标记还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述分子标记具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

TAGGGGTGAAAACGGTAACGGTAATTACCGGCCGACCGGCGTTCGTTTTCGACTTTCTACCGGCCGAGCCATATGGAAATGGTAATCGACCGAAACAAAAATGGAAATGGTAAAAAATATGGAAATGAAAACGGAAATGGTTTTGCTGTTATACCGATCGTTTCCATATTTACCGTATTCTTGCGGAAATTACCGTTTCTTATAATATGGTAATTACCGTATTCTAAATATGTCGATATTATAGGACATGTTTATACTTGACCCACAGCTTATAGATTAAATGACTCTTCAATAAAATCTCTAACTTTTGTACATGGCTAAAATGAAGTTAATTTATAATTTATATAGTATAAGCTTGAATTTATGTATATATATAACATACTTATGTAAAGTTAAATATATGTTTTTATAGTTTAATGTTTCCGTATTTGTTACCGGTTTCCGATCTGTACCGACATGTTTCCGTCTGTATTGTTCCGTTTCCGGTTTTCCGATATTTCCGATATCGTTTTCGTTTCCGACTTTACCGTTTCCGATTTCGTTTCCGAGAAAAATATGGTTACGGAAATGGTTGAGGCTGTTTTCCGATCGTTTCCGACCGTTTTCATCCCTA(SEQ ID NO:1)。

根据本发明的实施例，所述6号染色体的两条同源染色体均插入有所述分子标记，所述水稻具有冷不回生性状；所述6号染色体的两条同源染色体均缺失所述分子标记，所述水稻不具有冷不回生性状。发明人发现，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的分子标记在水稻中表现为插入/缺失长度多态性。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于检测前面所述的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列，用于检测所述分子标记。

GAGCTAGCTAGGAACTGATT(SEQ ID NO:2)。

ACGCAATGCCATGCATACTT(SEQ ID NO:3)。

根据本发明的实施例，利用本发明的引物对能够有效地对待测水稻的冷不回生性状相关的分子标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对这种分子标记的检测，确定待测水稻该种分子标记位点的插入/缺失长度多态性，进而能够有效预测待测水稻的冷不回生性状。具体地，水稻6号染色体的两条同源染色体均插入有所述分子标记，所述水稻具有冷不回生性状；水稻6号染色体的两条同源染色体均缺失所述分子标记，所述水稻不具有冷不回生性状。由此，用于检测前面所述的本发明的分子标记的引物对，能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。

在本发明第三方面，本发明提出了一种用于检测前面所述的分子标记的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含：前面所述的引物对，即本发明的试剂盒中包含具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测水稻的冷不回生性状相关的分子标记的插入/缺失多态性检测，确定待测水稻该分子标记位点是否存在，进而能够有效预测待测水稻的冷不回生性状。具体地，该分子标记在两条同源染色体均插入，水稻具有冷不回生性状，该分子标记在两条同源染色体均缺失，水稻不具有冷不回生性状。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的分子标记的试剂盒，能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。

在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的分子标记、前面所述的引物对或前面所述的试剂盒，在水稻选育中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与水稻冷不回生性状相关的分子标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待测水稻的上述分子标记的插入/缺失多态性，进而基于获得的多态性能够有效预测待测水稻的冷不回生性状，从而能够有效辅助水稻选育。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种检测水稻冷不回生性状的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括通过对待测水稻进行前面所述的分子标记的检测，预测所述待测水稻冷不回生性状。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与水稻冷不回生性状相关的分子标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测水稻进行PCR扩增、测序，以便检测确定待测水稻的上述分子标记的插入/缺失多态性，进而基于获得的多态性能够有效预测待测水稻的冷不回生性状。其中，如前所述，该分子标记在两条同源染色体均插入，水稻具有冷不回生性状，该分子标记在两条同源染色体均缺失，水稻不具有冷不回生性状。从而，例如所述该分子标记在水稻6号染色体的两条同源染色体均缺失时，水稻极可能不具有冷不回生性状。由此，本发明的检测水稻冷不回生性状的方法，能够快速、高效、准确地检测水稻冷不回生性状，进而能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，通过对待测水稻进行前面所述的分子标记的检测，预测所述待测水稻的冷不回生性状，进一步包括：提取待测水稻的基因组DNA；利用SEQ ID NO:2～3所述的引物对，将所述待测水稻的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测水稻的6号染色体的两条同源染色体是否同时插入或缺失所述分子标记；以及基于所述待测水稻的所述6号染色体的两条同源染色体是否同时插入或缺失所述分子标记，预测所述待测水稻的冷不回生性状。

根据本发明的实施例，所述待测水稻的6号染色体的两条同源染色体均插入有所述分子标记，所述待测水稻具有冷不回生性状；所述待测水稻的6号染色体的两条同源染色体均缺失所述分子标记，所述待测水稻不具有冷不回生性状。具体地，例如所述分子标记位点的缺失时，则能够预测待测水稻很大可能不具有冷不回生性状。进而本发明的方法能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。

根据本发明的实施例，对待测水稻进行分子标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现分子标记的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在分子标记的两侧设计一对引物，扩增约1000bp的产物，再通过测序即可直接检测分子标记的多态性。因而，本发明采用测序的方法进行分子标记检测。根据本发明的一些具体示例，通过对待测水稻进行前面所述分子标记的检测，预测所述待测水稻的冷不回生性状，进一步包括：提取待测水稻的基因组DNA；利用前面所述的引物对，将所述待测水稻的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测水稻的所述分子标记的插入/缺失多态性；以及基于所述待测水稻的所述分子标记的基因型，预测所述待测水稻的冷不回生性状。由此，能够有效提高检测水稻冷不回生性状的效率。

根据本发明的实施例，提取待测水稻的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用常规酚-氯仿方法抽提待测水稻的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。

根据本发明的实施例，将所述待测水稻的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，该PCR扩增的扩增体系以25μl计为：25-50ng/μl的模板DNA 1μl，10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3所示的引物各0.5μl，25mmol/L的dNTP mix 0.15μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.15μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为无菌水；该PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的分子标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。

根据本发明的实施例，对所述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得PCR扩增产物即分子标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序方法的至少一种对所述PCR扩增产物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。

根据本发明的实施例，基于测序结果，通过比对水稻参考基因组序列，能够有效确定待测水稻的分子标记是缺失还是插入。

需要说明的是，本发明的与水稻冷不回生性状相关的分子标记及其应用具有如下优点：

(1)本发明提供的分子标记不受水稻的雌雄、年龄等限制，可用于水稻的早期选育，可显著促进水稻的育种进程；

(2)检测本发明的水稻分子标记位点的方法，准确可靠，操作方便；

(3)本发明的水稻分子标记的检出，为水稻冷不回生性状的标记辅助选择提供了科学依据。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的水稻冷不回生性状的QTL定位结果；

图2是根据本发明实施例的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1水稻RIL分离群体的构建

本项目以云南遮放地方优质冷不回生籼稻品种毫秕以及高产大穗型冷回生籼稻品系1128为亲本，首先杂交得到F1代,然后经过多代自交、并采用单粒传的方式自交到F6代，完成构建高代重组自交系(RIL群体)。

1、选取父母本杂交，其父本为高产大穗型籼稻品系1128，其米质不具备冷不回生特性，母本为云南地方香软米品种毫秕，其米质具备冷不回生特性，经过杂交得到F1代，种植F1后取样进行PCR鉴定确定阳性F1，自交得到F2代种子。

2、RIL群体构建：从F2代开始，每代种植采用单粒传方式，即每一个单株，收种后只选取一粒健康饱满的种子用于下一代种植，从而构建高代重组自交系(RIL群体)。

3、表型数据调查：单株收种后，用LTJM-160精米机脱粒打米，采用德玛仕KZ-125蒸米柜，以米饭：水＝1:1的蒸煮方式，每单株进行3个重复进行蒸煮50分钟，每份米饭先品尝一半确定米质软硬，后留样一半放于海尔4度冰柜降温4小时或于16度环境温度放置12小时后，再拿出进行品尝，确定是否回生。

表型数据显示：在167个F6后代中，本次F6代调查中有10株染病未结实，有效调查数据为157株，其中77个个体植株，具有冷不回生性状；另外80个个体植株不具有冷不回生性状。经卡方检测可知，F6中冷不回生性状分离比为1:1，符合单基因控制性状的孟德尔遗传规律。

表1：水稻RIL群体冷不回生分离比例

实施例2父母本以及群体个体基因组DNA的提取

用改良的CTAB法分别提取父母本以及群体个体的基因组DNA，具体方法如下：

1)取样：取幼嫩的叶片1g左右，置于2ml离心管中。

2)样品冷冻抽干：取好的样品加研磨珠，打开管盖放入LABCONCO真空冷冻抽干机，-50℃条件下持续冷冻抽干12小时以上(一般冷冻抽干过夜)。

3)样品研磨：将冷冻抽干的样品置于宁波新芝高通量机械研磨仪中，启动程序研磨，将样品粉碎。机械研磨仪程序设定为每秒20次的振荡频率，运行5分钟，通量为96份样品/5分钟。

4)样品研磨充分后，在管内加入800μL提前65℃预热1h的CTAB提取液，混匀，65℃水浴40分钟，期间每隔5分钟颠倒混匀一次。

5)将水浴后的样品从水浴锅内拿出，冷却至室温后，加入与CTAB等体积的氯仿(三氯甲烷/异戊醇按照24:1比例混合)，轻轻混匀10分钟，至下层液体变为深绿色。(本步骤需在通风橱内操作)

6)混匀后将离心管转入高速离心机内离心，转速12000rpm，离心15分钟。离心后样品上层为澄清液体。

7)抽取500μL的上清液于1.5ml离心管中，并加等体积的异丙醇，轻轻混匀(此时可以看到有絮状沉淀析出)，然后将样品置于-20℃的冰柜30分钟，以沉淀DNA。

8)样品冷冻30分钟后转移至高速离心机内离心，转速12000rmp，离心10分钟。

9)弃掉上清液，DNA沉淀用75％乙醇洗涤2次，洗涤后将乙醇倒掉，敞开管口放置于通风橱内晾干。

10)待乙醇完全挥发后，加入50μLTE缓冲液(加RNA酶)溶解DNA，并于-20℃保存。

实施例3遗传图谱构建和基因定位

(1)遗传图谱构建

用基于RAD-seq的基因分型技术对RIL群体的个体进行基因分型，获得RIL群体的基因型数据。

用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0，SLincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。

(2)基因定位

根据步骤1获得的RIL群体的表型数据，结合群体基因型以及遗传连锁图，通过WinQTLCart 2.5软件进行QTL定位。结果显示水稻冷不回生性状为单基因控制性状，定位区间为chr06 6718941-6799600区间，长度约为81Kb。结果如图1所示。

实施例4分子标记开发

根据RAD-seq的测序结果，利用华大自主开发的SOAP软件比对测序读段(reads)，然后用SOAPsv寻找片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。选择靠近所定位冷不回生基因区段的标记(在本申请中命名为R060676)作为候选。所述分子标记表现为SEQID NO：1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。根据本发明的实施例，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列如下(613bp):

TAGGGGTGAAAACGGTAACGGTAATTACCGGCCGACCGGCGTTCGTTTTCGACTTTCTACCGGCCGAGCCATATGGAAATGGTAATCGACCGAAACAAAAATGGAAATGGTAAAAAATATGGAAATGAAAACGGAAATGGTTTTGCTGTTATACCGATCGTTTCCATATTTACCGTATTCTTGCGGAAATTACCGTTTCTTATAATATGGTAATTACCGTATTCTAAATATGTCGATATTATAGGACATGTTTATACTTGACCCACAGCTTATAGATTAAATGACTCTTCAATAAAATCTCTAACTTTTGTACATGGCTAAAATGAAGTTAATTTATAATTTATATAGTATAAGCTTGAATTTATGTATATATATAACATACTTATGTAAAGTTAAATATATGTTTTTATAGTTTAATGTTTCCGTATTTGTTACCGGTTTCCGATCTGTACCGACATGTTTCCGTCTGTATTGTTCCGTTTCCGGTTTTCCGATATTTCCGATATCGTTTTCGTTTCCGACTTTACCGTTTCCGATTTCGTTTCCGAGAAAAATATGGTTACGGAAATGGTTGAGGCTGTTTTCCGATCGTTTCCGACCGTTTTCATCCCTA(SEQ ID NO:1)。

然后分别设计引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选具有多态性，扩增稳定的标记。

实施例5分子标记的制备

经上述扩增过程得到分子标记，优选扩增后将扩增产物进行纯化操作。纯化后进行测序，结果如标记特征序列SEQ ID NO:1所示。

R060676引物序列如下：

R060676-F：GAGCTAGCTAGGAACTGATT(SEQ ID NO:2)。

R060676-R：ACGCAATGCCATGCATACTT(SEQ ID NO:3)。

进一步验证这一通过F6群体基因定位，结全表型数据开发的分子标记，以F2群体的留存的基因组模板和种子，用这一标记验证，看标记结果和表型是否吻合。

以提取的父母本、群体后代的基因组DNA为模板，以分子标记扩增引物对模板进行PCR扩增。

PCR反应体系如表2所示。

表2：

无菌水	20.2μl
		10*Buffer(含Mg2+)	2.5μl
dNTPs(25mM)	0.15μl
		Taq酶(5U/μl)	0.15μl
正向引物	0.5μl
		反向引物	0.5μl
模板	1.0μl
		总体积	25μl

PCR反应程序如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

经上述扩增过程得到分子标记，然后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到多态性电泳条带，结果如附图2所示。

如图2所示，以DL2000的marker为指示，其中第1胶孔为父本1128，扩增片段约为350bp(靠近marker 350bp)，第2胶孔为母本毫秕，扩增片段约为1000bp(靠近marker1000bp)，杂交F2代则出现分离，有3种带型，1是与父本相同，2是与母本相同，3是同时含有这两个扩增片段。在F2群体用此标记进行筛选，其表型数据对比引物扩增结果，凡是扩增条带约为1000bp的个体，其植株具有冷不回生特性；凡扩增条带为350bp的个体，其植株不具有冷不回生特性。由此证明该分子标记R060676(SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)在父母本之间具有多态性，并与冷不回生性状紧密连锁。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

深圳市华大农业应用研究院

<120> 水稻冷不回生性状相关的分子标记及其应用

<130> PIDC3200213

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 613

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子标记的核苷酸序列

<400> 1

taggggtgaa aacggtaacg gtaattaccg gccgaccggc gttcgttttc gactttctac 60

cggccgagcc atatggaaat ggtaatcgac cgaaacaaaa atggaaatgg taaaaaatat 120

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ttgcggaaat taccgtttct tataatatgg taattaccgt attctaaata tgtcgatatt 240

ataggacatg tttatacttg acccacagct tatagattaa atgactcttc aataaaatct 300

ctaacttttg tacatggcta aaatgaagtt aatttataat ttatatagta taagcttgaa 360

tttatgtata tatataacat acttatgtaa agttaaatat atgtttttat agtttaatgt 420

ttccgtattt gttaccggtt tccgatctgt accgacatgt ttccgtctgt attgttccgt 480

ttccggtttt ccgatatttc cgatatcgtt ttcgtttccg actttaccgt ttccgatttc 540

gtttccgaga aaaatatggt tacggaaatg gttgaggctg ttttccgatc gtttccgacc 600

gttttcatcc cta 613

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物对的核苷酸序列

<400> 2

gagctagcta ggaactgatt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物对的核苷酸序列

<400> 3

acgcaatgcc atgcatactt 20

Claims (9)

1.一种水稻冷不回生性状相关的分子标记，其特征在于，

所述分子标记为靠近水稻6号染色体6718941-6799600区间位置的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述6号染色体的两条同源染色体均插入有所述分子标记，所述水稻具有冷不回生性状；

所述6号染色体的两条同源染色体均缺失所述分子标记，所述水稻不具有冷不回生性状。

4.一种用于检测权利要求1～3任一项所述的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列，用于检测所述分子标记。

5.一种用于检测权利要求1～3任一项所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，包含：

权利要求4所述的引物对。

6.权利要求1～3任一项所述的分子标记、权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒，在水稻选育中的用途。

7.一种检测水稻冷不回生性状的方法，其特征在于，通过对待测水稻进行权利要求1～3任一项所述的分子标记的检测，预测所述待测水稻冷不回生性状。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过对待测水稻进行权利要求1～3任一项所述的分子标记的检测，预测所述待测水稻的冷不回生性状，进一步包括：

提取待测水稻的基因组DNA；

利用权利要求4所述的引物对，将所述待测水稻的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

基于所述测序结果，确定所述待测水稻的6号染色体的两条同源染色体是否同时插入或缺失所述分子标记；以及

基于所述待测水稻的所述6号染色体的两条同源染色体是否同时插入或缺失所述分子标记，预测所述待测水稻的冷不回生性状。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测水稻的6号染色体的两条同源染色体均插入有所述分子标记，所述待测水稻具有冷不回生性状；

所述待测水稻的6号染色体的两条同源染色体均缺失所述分子标记，所述待测水稻不具有冷不回生性状。

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