CN113717980A - 一个控制桃外果皮颜色基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
一个控制桃外果皮颜色基因及其应用，序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用果皮颜色“缺陷型”的遗传资源‘中桃白玉’，构建杂交群体，对控制果皮颜色缺陷的基因进行精细定位，确定候选基因，阐明桃外果皮颜色“缺陷型”的遗传机制。该研究结果为明确桃果皮颜色“缺陷型”的遗传和调控机制奠定基础，同时为分子标记辅助创制新品种和纯色果实外观品质的改良奠定的基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一个控制桃外果皮颜色“花青苷缺陷”型基因及其应用。
背景技术
桃[Prunus persica(L.)Batsch]属于蔷薇科，李属，桃亚属果树植物，是我国重要的落叶果树之一。据不完全统计，2017年我国桃栽培面积近1400万亩，占世界栽培总量的50％以上(FAO)。桃起源于中国，我们有着丰富的花、果皮和果肉遗传资源，色泽作为最重要的果实品质性状之一，对水果商品性起着重要的决定作用。桃果肉颜色(中果皮)主要有黄肉、白肉、红肉和绿肉等几种，目前主栽品种均为黄肉和白肉类型。桃果实色泽由外果皮和中果皮二者共同决定了果品的色泽。因此，外果皮颜色决定了果实的外观品质和商品性。
近年来，“纯黄”和“纯白”特异类型桃深受亚洲消费者的喜爱，具有较高的商品价值。由于桃主栽品种为黄肉和白肉类型，生产者主要通过套袋获得“纯色”类型的果品来提高果品的商品价值。套袋措施不但增加了用工成本还降低了果实的品质，据我们统计桃果实套袋降低可溶性固形物约1.5％，增加用工成本约450元/亩。因此，研究桃外果皮颜色形成的遗传机制具有重要的科学价值和产业意义。
决定果实色泽的主要物质有叶绿素、类胡萝卜素、花色苷等。花色苷(Anthocyanin)属于黄酮类物质，是决定植物茎、叶、花、果实和种子等颜色的重要色素之一(Tanaka等，2008； Winkel-Shirley,2001；Grotewold,2006)。花青素的积累是由结构基因和调控基因协调控制，此外，还受外界环境的影响，如光照和温度等(LoPiero等，2005；Wang等，2018)。目前，尽管开展了一系列的相关研究，还未见桃外果皮“花青苷缺陷”类型形成的遗传证据。基于此，本发明利用果皮颜色“缺陷型”的遗传资源‘中桃白玉’，构建了杂交群体，精细定位了控制果皮颜色缺陷的基因并确定了候选基因，明确了控制桃外果皮颜色基因启动子区的变异与表型有关，建立了分子标记辅助选种体系，为纯色(纯黄和纯白)品种的选育和改良奠定了的基础。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一个控制桃外果皮颜色“花青苷缺陷”型的基因及应用。
技术方案：一个控制桃外果皮颜色基因，序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1所示的基因在控制桃外果皮颜色中的应用。
一种判别桃外果皮颜色的试剂盒，含有SEQ ID NO.1所示的基因。
一种判别桃外果皮颜色的试剂盒，含有检测SEQ ID NO.1所示基因的引物。
试剂盒引物为：5’-GTGGTTCACGTATCACAGCTG-3’；5’-ATGGTGTTTGTGGAGGAGGG-3’。
利用外果皮颜色“缺陷型”的遗传资源‘中桃白玉’为亲本，构建回交群体，通过对控制果皮颜色性状的基因进行精细定位，再结合定位区间基因的转录组数据和基因组重测序数据确定候选基因，分析候选基因编码区和启动子区的序列差异，明确表型差异的遗传机制。再通过瞬时超表达和病毒诱导基因沉默(VIGS)验证基因的功能。最后再启动子变异区开发分子标记在其他品种(系)等自然群体验证连锁关系，为采用分子标记辅助创制新种质和进行纯色 (纯黄和纯白)品种的遗传改良。
主要通过如下方法得到：
(1)基于BSA-seq目标性状的初定为和位点验证
在明确‘中桃白玉’来源的基因型为隐性单基因控制后(图1)，分别取外果皮“花青苷缺陷型”(白皮)和红皮各15个单株、亲本进行基因组DNA提取，经浓度测定后，进行白皮池和红皮池BSA混样，每个单株取等量的DNA。再利用BSA-seq进行二代测序，以桃参考基因组(Version 2.0)获得SNPs和indel基因型。根据基因分型的结果，筛选亲本中杂合的标记，共挑选出635,268个多态性标记，过滤后得到617,335个多态性标记位点，通过计算△(SNP-index)，经开发标记再群体中验证将目标基因初步定位在Pp03的17.6～19.5Mb 之间(图2)。
(2)基于SNP和Indel分子标记和大群体目标性状的精细定位
在初定位区域内，基于亲本重测序开发基因型和表型一致的SNP或Indel标记，或者利用已开发753对荧光标记的SSR引物，在176个结果的BC1代中进行基因分型(图4)。完成了目标性状的精细定位，在引物Pp03-SSR-18095989(FAM标记)和Pp03-SNP-18854098 之间，物理区间距离为758.1Kb，包括64个转录本(图3)。
(3)基于RNA-seq和重测序分析目标基因的确定
根据精细定位区间，结合RNA-seq数据、亲本重测序数据分析了精细定位区基因的表达量、结构变异，确定了候选基因Pp3G163100，该基因在不同类型的基因结构(SNP和Indel) 和破色期基因的表达水平上存在差异，在不着色的白皮类型中该基因fmpk表达量接近0，在红皮类型中fpkm表达量为16.7，后者是前者的97倍多(图4)。
(4)目标基因编码区和启动子变异位点的确定
利用双亲RNA-seq测序数据(Bam文件)进一步分析了精细定位区差异表达基因的基因结构、启动子区、编码区基因的结构变异，包括SNP和Indel以及SV序列(图4)。设计引物对该基因变异位点进行RT-PCR验证，表明该基因在红皮(RS)中表达，在白皮(WS)中不表达进一步确定Pp3G163100是候选基因(图5)。
(5)基于双亲重测序数据(Bam文件)和已重测序品种(20个)比较Pp3G163100的基因结构，发现基因编码区有3个SNP，内含子区有1个145bp的Indel。3个SNP和145bp 的Indel与表型无关。进一步对基因的DNA进行Sanger测序、拼接发现在起始位点ATG上游约900bp处有个26bp和8bp的特异位点插入(图6)，是‘中桃白玉’来源的材料的特有标记。
(6)在确定候选基因的基础上，构建了超表达载体(pCAMBIA3301、TRV1 和2)，并进行了PCR扩增、酶切、质粒测序验证，确认目标基因(750bp左右) 连接成功后，转入农杆菌中，分别侵染白皮和红皮类型，以观察表型验证和确定候选基因的功能。同时，以Actin为内参基因，分析目标基因的表达量。结果表明：经VIGS注射果实后未处理和对照果面颜色着红色，注射点与其他区域差异不大，但TRV：：MYB处理后注射点花青苷含量减少，部分区域表现为花青苷缺陷，同时基因表达量约为对照的1/3；经3301载体注射果实后未处理和对照果面颜色为白色，注射点与其他区域差异不大，但3301：：MYB处理后注射点花青苷含量增加，部分区域表现为果皮红色，同时基因表达量约为对照的1/3300 倍。
简要说明
(1)根据BC1群体的果实的外果皮颜色进行区分，根据表型外果皮颜色分为红和白色两种；
(2)提取BC1亲本和子代基因组DNA，分别对白皮和红皮类型各15个个体等量混合DNA后进行BSA-seq基因分型，根据两个混样池中SNP-index的差值将候选基因精细定位在约1.9Mb物理距离区间内；
(3)基因组DNA的提取采用改良CTAB高通量法，略作修改；
(4)使用‘中桃白玉’和‘09-bei8-25’基因组重测序数据，并用Primer3(可在http://primer3.ut.ee获得)设计引物。PCR扩增以40μL反应体积进行Sanger测序，以15μ L反应体积进行indel分析，进行精细定位。
(5)在精细定位区(758.109kb)，结合基因的表达量(RNA-seq)、重测序数据基因的变异(Bam软件)分析候选区基因的编码区和启动子区，确定候选基因；利用双亲RNA-seq测序数据(Bam文件)进一步分析了精细定位区差异表达基因的基因结构、启动子区、编码区基因的结构变异，包括SNP和Indel以及SV序列(图4)。设计引物对该基因变异位点进行 RT-PCR验证，表明该基因在红皮(RS)中表达，在白皮(WS)中不表达，进一步确定Pp3G163100 是候选基因(图5)。
(6)采用同源重组方法构建瞬时超表达载体(pCAMBIA3301)和病毒诱导TRV1和2的VIGS载体，转入农杆菌感受态细胞中进行果肉注射，侵染3～4天后观察表型；
(7)根据MYB75基因的序列设计引qPCR引物，以actin为内参基因，测定侵染后基因的表达量；
(8)根据启动子变异区的特点，采用Primer3(可在http://primer3.ut.ee获得)设计引物，开发分子标记，采用Sanger测序方法在79个自然群体中验证连锁性，用于分子标记辅助选种。
MYB75基因mRNA序列全长(720bp)如SEQ ID NO.1所示；
ATGGAGGGCTATAACTTGGGTGTGAGAAAAGGAGCTTGGACTAGAGAGGAAGATGATCTTTTGAGGCAGTGCATTGAGAATCATGGAGAAGGAAAGTGGCACCAAGTTCCTAACAAAGCAGGGTTGAACAGGT GCAGGAAGAGCTGTAGACTAAGGTGGATGAACTATTTGAAGCCAAATATCAAGAGAGGAGAGTTTGC AGAGGATGAAGTAGATCTAATCATTAGGCTTCACAAGCTTTTAGGAAACAGGTGGTCATTGATTGCTG GAAGGCTTCCAGGAAGGACAGCGAATGATGTGAAAAATTATTGGAACACTCGACTGCGGACGGATTC TCGCCTGAAAAAGGTGAAAGATAAACCCCAAGAAACAATAAAGACCATCGTAATAAGACCTCAACCC CGAAGCTTCATCAAGAGTTCAAATTGTTTGAGCAGTAAAGAACCAATTTTGGATCATATTCAAACAGT CGAGAATTTTAGTACGCCGTCACAAACATCACCATCAACAAAGAATGGAAATGATTGGTGGGAAACC TTTTTAGATGACGAGGATGTTTTTGAAAGAGCTACATGCTATGGTCTAGCATTAGAGGAAGAAGAGTT CACAAGTTTTTGGGTTGATGATATGCCACAATCGAAAAGACAGTGTACCAATGTTTCAGAAGAAGGA CTAGGTAGAGGTGATTTCTCTTTTAACGTGGACTTTTGGAATCATTAA
基于VIGS干扰目标基因片段的序列(282bp)如SEQ ID NO.2所示；
GGTGTGAGAAAAGGAGCTTGGACTAGAGAGGAAGATGATCTTTTGAGGCAGTGCATTGAGAATCATGGAGAAGGAAAGTGGCACCAAGTTCCTAACAAAGCAGGGTTGAACAGGTGCAGGAAGAGCTGTAGA CTAAGGTGGATGAACTATTTGAAGCCAAATATCAAGAGAGGAGAGTTTGCAGAGGATGAAGTAGATCT AATCATTAGGCTTCACAAGCTTTTAGGAAACAGGTGGTCATTGATTGCTGGAAGGCTTCCAGGAAGG ACAGCGAATGATGTG
瞬时超表达目标基因序列全长(720bp)如SEQ ID NO.3所示。
ATGGAGGGCTATAACTTGGGTGTGAGAAAAGGAGCTTGGACTAGAGAGGAAGATGATCTTTTGA GGCAGTGCATTGAGAATCATGGAGAAGGAAAGTGGCACCAAGTTCCTAACAAAGCAGGGTTGAACA GGTGCAGGAAGAGCTGTAGACTAAGGTGGATGAACTATTTGAAGCCAAATATCAAGAGAGGAGAGTT TGCAGAGGATGAAGTAGATCTAATCATTAGGCTTCACAAGCTTTTAGGAAACAGGTGGTCATTGATTG CTGGAAGGCTTCCAGGAAGGACAGCGAATGATGTGAAAAATTATTGGAACACTCGACTGCGGACGGA TTCTCGCCTGAAAAAGGTGAAAGATAAACCCCAAGAAACAATAAAGACCATCGTAATAAGACCTCAA CCCCGAAGCTTCATCAAGAGTTCAAATTGTTTGAGCAGTAAAGAACCAATTTTGGATCATATTCAAAC AGTCGAGAATTTTAGTACGCCGTCACAAACATCACCATCAACAAAGAATGGAAATGATTGGTGGGAA ACCTTTTTAGATGACGAGGATGTTTTTGAAAGAGCTACATGCTATGGTCTAGCATTAGAGGAAGAAGA GTTCACAAGTTTTTGGGTTGATGATATGCCACAATCGAAAAGACAGTGTACCAATGTTTCAGAAGAAG GACTAGGTAGAGGTGATTTCTCTTTTAACGTGGACTTTTGGAATCATTAA
判别不同外果皮颜色的两对引物序列：
控制目标基因表达量变异区的序列
引物1(扩增片段长度424bp)：
5-GTGGTTCACGTATCACAGCTG-3
5-ATGGTGTTTGTGGAGGAGGG-3
引物2(扩增片段长度1111bp)：
5-GTGGTTCACGTATCACAGCTG-3
5-AGGTCAAGTACGTACGCAGG-3
有益效果：本发明利用果皮颜色“缺陷型”的遗传资源‘中桃白玉’，构建杂交群体，对控制果皮颜色缺陷的基因进行精细定位，确定候选基因，阐明桃外果皮颜色“缺陷型”的遗传机制。该研究结果为明确桃果皮颜色“缺陷型”的遗传和调控机制奠定基础，同时为分子标记辅助创制新品种和纯色果实外观品质的改良奠定的基础。
附图说明
图1白皮类型(花青苷缺陷型)和红皮类型桃的表型图；
图2基于BSA-seq分析控制桃白皮型和红皮型基因的初定位(纵坐标为Delta SNP-index，即白皮池的SNP-index与红皮池的SNP-index差值，接近0.667的为目标区域。方框为初步定位候选区域；
图3基于181个BC1单株目标基因的精细定位；
图4基于重测序数据和RNA-seq数据目标基因的变异和表达水平分析；
图5基于VIGS导致MYB75基因沉默后的表型和基因表达水平；
图6基于瞬时超表达MYB75基因表型和基因表达水平。
具体实施方式
实施例1
(一)、植物材料
‘中桃白玉’是我们选育的一个外果皮全白(外果皮花青苷缺陷)的毛桃，仅在果皮上出现花青素缺陷；03-33-7为全红的油桃，2009年杂交获得F1代杂交单株。于2014年选择F1代的一个单株‘09-bei8-25’为母本继续与‘中桃白玉’，回交，获得BC1代，对181个单株进行表型评价，结果表明其中88个表现为果皮红色，92个单株果皮表现为红色，其中1 株没有结果，红、白皮二者比例接近1:1。
(二)、基因组DNA的提取
采用CTAB法提取桃叶片基因组DNA，略作修改，具体如下：(1)取桃幼嫩叶片约30mg，放入1.2mL八联排离心管，每孔各加入1个5mm钢珠，放入96孔底座，液氮充分冷冻；(2)手动摇晃数次，保证钢珠充分打碎样品，DNA自动研磨仪(上海领成生物科技有限公司)进行研磨，频率30Hz，时间90s；(3)用300mL量程8通道移液器加入配制好的CTAB液600 μL，放入60℃电热恒温鼓风干燥箱加热30min，其间约每10min轻摇匀；(4)放入冷冻离心机(Eppendorf5810 R)4℃条件下，4000rpm瞬时离心；加入氯仿和异戊醇混合液，体积比为24：1，直至1.2mL的八联排离心管满载线，后缓慢颠倒混匀5min，放入冷冻离心机(Eppendorf5810 R)4℃条件下，4000rpm，离心10分钟；(5)分别吸取上清液150μL于两个96孔PCR板中，其中一板加入等体积的无水乙醇，于-20℃冰箱1小时，之后，4℃条件下，4000rpm，离心10min，弃上清液；另一板放入4℃冰箱，保存备用；(6)在带有沉淀的96孔PCR板中加入150μL的70％的乙醇，4000rpm瞬时离心，洗涤沉淀2次，加入无水乙醇洗涤沉淀一次，用100μL的8通道移液器(Eppendorf)吸除离心管底部剩余无水乙醇，后自然晾干；(7)在室温下自然风干沉淀后，加入150μL体积的0.1×TE溶解沉淀DNA，同时加入0.5μL的RNase，37℃放置1h，祛除RNA污染(长期保存在-20℃冰箱，常用则存于 4℃冰箱)，以用于后续研究。用于亲本重测序基因组DNA的提取采用CTAB法，挑取絮状 DNA，洗净后用于二代测序。
(三)、BSA-seq基因的初定位
根据表型调查数据各取BC1群体(中桃白玉×09-北8-25)的两类表型的20个单株的叶片基因组DNA等量混匀，构建BSA混合池。基因组DNA检测合格建库后进行NGS测序，测序平台为Hiseq2000。每个BSA混合池测序深度为100X，亲本测序深度为100X，数据下机后去掉接头，质控后进行数据分析。根据每个BSA混合池的表型，计算每个基因混合池的 SNP-index，其中选取纯白型“缺陷型”基因池SNP-index为1的SNPs，红皮池中SNP-index为 0.5的SNPs。定位候选区Delta(SNP-index)纯白型“缺陷型”基因池(SNP-index)-红皮池中(SNP-index)的差值为0.5(具体请见Abe等2013，The Plant Journal)。
(四)、基于RNA-seq分析候选区基因的表达量分析
采用总RNA提取试剂盒Plant Total RNA Isolation Kit(上海生工生物工程股份有限公司)，经凝胶、Agilent 2100 Bioanalyzer和Agilent RNA6000 Nano Kit检测、ligo(dT)富集mRNA 后使其短片段化，以短片段mRNA合成双链cDNA，纯化后进行末端修复、加碱基A、加测序接头处理，最后进行PCR扩增完成测序文库制备，三个生物学重复在IlluminaHiSeq X Ten 进行二代测序。将Raw reads去掉通用接头，采用Tophat(V2.0.12)软件将reads与桃参考基因组(Version 2.0)比对后，分析基因的表达量、结构变异、Go途径等分析。基因表达分析采用HTSeq、差异表达基因分析采用DGE R package和DESeq2(Loveet等，2014)，差异表达阈值参数设为>2或者<0.5(P<0.05)，表达量FPKM值小于1的过滤掉；基因表达水平分析采用HTSeq软件，使用的模型为union；GO富集分析采用的软件方法为GOseq(Young 等，2010)；KEGG Pathway分析使用KOBAS(2.0)进行富集分析；SNP分析采用GATK2。
(五)、SNP开发的引物设计
参考桃基因组(Version 2.0)序列，采用Primer3Input(version4.0)(http://primer3.ut.ee/) 设计引物，引物参数为退火温度在60-62℃之间，引物长度20-25bp，开发基于Sanger测序的SNP标记，选择约每1Mb设计1对引物，扩增片段长度约为700-1600bp。
(六)、PCR反应体系以及SNP标记的获得
PCR扩增体系总体积为40μL，具体组分如下：
混匀后，在离心机(5810R，Eppendorf)离心，并在PCR仪(Eppendorf)上进行扩增。PCR扩增程序为95℃3min；95℃30s，56.5℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。
PCR扩增成功后，产物送上海生工生物工程有限公司进行Sanger测序，将测序结果在 Contig软件中打开，序列对齐后寻找与目标性状连锁的多态性SNP标记。
(七)瞬时超表达和病毒诱导基因沉默(VIGS)目标基因的功能验证
采用总RNA提取试剂盒Plant Total RNA Isolation Kit(上海生工生物工程股份有限公司) 提取两种果皮总RNA，采用SuperScriptTMDouble-Stranded cDNA SynthesisKit试剂盒 (Invitrogen，上海)进行cDNA合成，作为扩增模板，具体参照相关的说明书进行。根据 PpMYB113的mRNA序列设计引物，加上酶切接头(BamH1和Xho1)以cDNA为模板采用高保真酶Phusion扩增，连接至T-easy载体上挑10个单克隆进行Sanger测序(Invitrogen，上海)，以确保插入片段的序列正确。然后对质粒进行酶切(BamH1和Xho1)，经DNA回收试剂盒(Promega)纯化后用T4连接酶(NEB)连接至相同酶切的VIGS载体和瞬时表达载体pCAMBIA3301上，分别进行超量表达和瞬时表达验证目标基因功能。将3301-MYB、TRV1、TRV2和TRV2-MYB75分别转移至农杆菌GV3101中，在LB培养基中加入10mmol·L-1MES 和100μmol·L-1As 28℃下进行培养，以使OD600达到0.8-1.0。离心后，沉淀物重悬于农杆菌浸润缓冲液(10mmol L-1MgCl2,10mmol·L-1MES和400μmol L-1acetosyringone,pH 5.6) 中，OD600为0.8至1.0。然后将pTRV1与pTRV2或pTRV2-MYB75载体以1:1的比例混合。静置三小时后，用注射器将混合物注入桃果实中，处理30多个果实，6-7天观察表型。
(八)、基因表达水平总RNA提取、cDNA双链的合成采用与以上相同的试剂和步骤。Real-time qPCR反应在
480II(Roche，瑞士)上进行。采用Primer 3.0软件(http:// primer3.ut.ee/)设计PCR引物，其退火温度设定在60～63℃之间，目的片段在编码区5’端，长度约250bp跨2个以上外显子。转基因与对照材料的花青苷成分差异分析同上。
(九)、根据亲本重测序数据，分析基因编码区和启动子区的结构变异，设计约700bp的引物在79个单株中进行验证，确定启动子变异区与目标性状的连锁关系与标记的特异性。
表1
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一个控制桃外果皮颜色基因及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gtggttcacg tatcacagct g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
atggtgtttg tggaggaggg 20
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
atggagggct ataacttggg tgtgagaaaa ggagcttgga ctagagagga agatgatctt 60
ttgaggcagt gcattgagaa tcatggagaa ggaaagtggc accaagttcc taacaaagca 120
gggttgaaca ggtgcaggaa gagctgtaga ctaaggtgga tgaactattt gaagccaaat 180
atcaagagag gagagtttgc agaggatgaa gtagatctaa tcattaggct tcacaagctt 240
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aaaaattatt ggaacactcg actgcggacg gattctcgcc tgaaaaaggt gaaagataaa 360
ccccaagaaa caataaagac catcgtaata agacctcaac cccgaagctt catcaagagt 420
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agtacgccgt cacaaacatc accatcaaca aagaatggaa atgattggtg ggaaaccttt 540
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tcagaagaag gactaggtag aggtgatttc tcttttaacg tggacttttg gaatcattaa 720
<210> 4
<211> 282
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ggtgtgagaa aaggagcttg gactagagag gaagatgatc ttttgaggca gtgcattgag 60
aatcatggag aaggaaagtg gcaccaagtt cctaacaaag cagggttgaa caggtgcagg 120
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ttgattgctg gaaggcttcc aggaaggaca gcgaatgatg tg 282
<210> 5
<211> 720
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
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tcagaagaag gactaggtag aggtgatttc tcttttaacg tggacttttg gaatcattaa 720
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
gtggttcacg tatcacagct g 21
<210> 7
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
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<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
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<210> 9
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
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<210> 11
<211> 20
<212> DNA
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<400> 11
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<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
atcgttttga tacactcttt tgagg 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
ctactcgtaa tccactagct ctgct 25
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
ggcttgccaa gttctttagc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
tgcttagtgg tttgggttgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
agtggcaatc atcctgaacc 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
cagcgtccat ttttcttatg g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
ttggatcgaa gaaggaaacg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
cttatgccgt catgctaggg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
aattggatca gtcggtttgg 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 21
ggcgtttgac acatgtaatc c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 22
tttcatgagg gaagtctcca a 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 23
gcgtgtaagg atcgccatag 20
Claims (5)
1.一个控制桃外果皮颜色基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1所示。
2.SEQ ID NO.1所示的基因在控制桃外果皮颜色中的应用。
3.一种判别桃外果皮颜色的试剂盒，其特征在于含有SEQ ID NO.1所示的基因。
4.一种判别桃外果皮颜色的试剂盒，其特征在于含有检测SEQ ID NO.1所示基因的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于引物为：
5’-GTGGTTCACGTATCACAGCTG-3’；
5’-ATGGTGTTTGTGGAGGAGGG-3’。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117248073A (zh) * | 2023-11-04 | 2023-12-19 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 一种桃果皮纯色基因相关的kasp标记及其应用 |
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