CN113528698B - 一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用。本发明在甘蓝C09染色体的WUSCHEL(WUS)基因的第二个外显子上筛选到一个InDel位点。在该InDel位点，结球甘蓝、球茎甘蓝和芥兰序列与野生甘蓝保持一致，而青花菜、花椰菜中存在12bp的缺失，缺失序列为TCATGTAGCCAT。在该InDel位点上下游200bp内用Primer 5设计了一对InDel标记引物，开发了InDel分子标记。本发明的分子标记及其引物对可为青花菜、花椰菜种质资源和品种鉴定提供依据。

Description

一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用。
背景技术
甘蓝类蔬菜属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)，包括花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)、青花菜(Brassica oleracea var.italica)、结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)、球茎甘蓝(Brassica oleracea var.gongylodes)及芥兰(Brassica oleracea var.alboglabra)等，它们都有肥厚而呈蓝绿色的外叶，具明显的蜡粉和波状的叶缘，形态结构差异显著，由共同的祖先野生甘蓝(Brassica oleraceavar.oleracea)通过人工栽培而来。甘蓝类蔬菜栽培历史长、种植面积大且在世界各地广泛种植，是重要蔬菜来源之一。其中青花菜和花椰菜以花球为产品，以其味道鲜美，营养丰富，倍受青睐。青花菜富含多种矿物质和维生素，富含萝卜硫苷，具有天然防癌和抗癌的功效，是一种极好的保健蔬菜。花椰菜富含蛋白质和多种矿物质，经常食用可清热解渴、利尿通便，同时含有“索弗拉芬”，对预防多种癌症起着积极作用。我国是青花菜和花椰菜生产大国，但优良的主栽品种大多从日本等地引进，种子价格昂贵。这也反映我国青花菜、西兰花的种业处于弱势地位，要积极加速推进我国优良品种选育的进程，使国产优良品种取代国外品种。市面上一些种子以次充好、以劣掺优，假种冒充真种的现象给我国青花菜、西兰花的种业发展造成了极大的不便。
品种鉴定是种质资源研究和利用的前提，能有效防止假冒伪劣产品流入市场，在遗传育种、农业生产上显得极为重要。甘蓝类物种常规鉴定主要采用植株形态鉴定和同工酶鉴定等方法。植株形态鉴定费时费力，周期长，且易受环境季节和鉴定者主观因素的影响。同工酶分析进行品种鉴定虽然已有许多成功的应用，但易受环境和所取材料部位的影响。分子标记辅助鉴定品种由于其高效、快捷、易操作且准确度高的特点被广泛应用。
刘广利用多态性引物RAPD(Random amplified polymorphic DNA)17个、ISSR(Inter-simple sequence repeat)20个、SRAP(Sequence-related amplifiedpolymorphism)15对对33个甘蓝主栽品种及1个青花菜、1个花椰菜进行了品种鉴定，利用其中两个引物NAURPl068和me7-1/emll-1可将35个品种完全鉴别，三类标记聚类图谱均显示青花菜、花椰菜与甘蓝品种遗传关系较远(刘广，2007)；褚云霞利用筛选的36对SSR(Simplesequence repeats)引物对青花菜和花椰菜共计173份进行品种鉴定，结果显示该引物组合能将青花菜和花椰菜很好地区分开来，能鉴定绝大部分品种，其中有三个品种相似性为1，无法区分(褚云霞，2020)。王黎瑾利用17对SSR引物对29个青花菜品种进行品种鉴定，结果显示29个青花菜品种的SSR指纹图谱均具有唯一性(王黎瑾，2021)。虽然已有分子标记应用于甘蓝类蔬菜品种鉴定中，但前期要设计筛选的的引物对较多，且多是针对一类品种进行鉴定。因此在甘蓝类蔬菜中开发更多用于品种筛选早期鉴定且简单高效的分子标记迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
WUSCHEL(WUS)为WUSCHEL-related homeobox(WOX)家族成员，主要在茎尖分生组织和花分生组织中表达，它的存在使周围细胞具有干细胞的特征。本申请在甘蓝C09染色体的WUSCHEL(WUS)基因的第二个外显子上筛选到一个InDel位点，在InDel上下游200bp内设计的一对标记引物，为青花菜、花椰菜的品种鉴定、辅助分子育种提供依据。
本发明是这样实现的，一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记，所述InDel位于C09染色体的WUSCHEL基因的第二个外显子上，核苷酸序列为TCATGTAGCCAT。具体位置：野生甘蓝013基因组C09染色体上11,151,186bp处。
本发明还提供了检测如上述的InDel分子标记的引物组，包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。
本发明还提供了一种试剂盒，包含检测如上述的InDel分子标记的引物组。
进一步地，所述引物组包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。
进一步地，还包含Green Taq Mix。
本发明还提供了如上述的InDel分子标记、或引物组、或试剂盒在鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜中的应用。
本发明还提供了一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的方法，对上述的InDel分子标记进行检测，缺失所示核苷酸序列的InDel分子标记的样品为青花菜或花椰菜。
进一步地，包含所示核苷酸序列的InDel分子标记的样品为结球甘蓝、或球茎甘蓝、或芥兰、或野生甘蓝。
进一步地，以蔬菜样品基因组DNA为模板，利用上述的引物组进行扩增，根据扩增结果判断样品类型。
进一步地，扩增结果出现约196bp条带时为青花菜或花椰菜；出现约208bp条带时为结球甘蓝、或球茎甘蓝、或芥兰、或野生甘蓝。
进一步地，PCR扩增反应体系包括：9.5μl ddH2O、12.5μl Green Taq Mix、1μl 10μM的正向引物、1μl 10μM的反向引物和1μl全基因组DNA组成。
进一步地，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸7min。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明在野生甘蓝C09染色体的WUSCHEL(WUS)基因的第二个外显子上筛选到一个InDel位点。在该InDel位点，结球甘蓝、球茎甘蓝和芥兰序列与野生甘蓝保持一致，而青花菜、花椰菜中存在12bp的缺失，缺失序列为TCATGTAGCCAT。
进一步开发了InDel分子标记，对48份野生甘蓝、84份花椰菜、168份青花菜、105份结球甘蓝、6份球茎甘蓝及10份芥兰这六类甘蓝类物种(共计421份)进行了鉴定，该分子标记能将结球甘蓝、球茎甘蓝、芥兰和野生甘蓝分为一个类群，将青花菜和花椰菜分为另一类群，可高通量鉴定青花菜、花椰菜种子准确性、真实性。本发明提供的分子标记能为青花菜、花椰菜、结球甘蓝、球茎甘蓝、芥兰、或野生甘蓝的种质资源和品种鉴定及区分提供依据，为辅助甘蓝类蔬菜分子育种开发了新的分子标记。
附图说明
图1是InDel位点信息图；
图2是PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。“M”代表DNA ladder marker，“w”、“i”和“b”分别代表野生甘蓝、青花菜、花椰菜，“c”、“a”和“g”分别代表结球甘蓝、芥兰、球茎甘蓝。“u”表示无法辨别的样品；
图3是PCR产物琼脂糖凝胶电泳图及sanger测序结果图。“Marker”、“Wild”等从左到右依次为DNA ladder marker、野生甘蓝、花椰菜、结球甘蓝、青花菜、球茎甘蓝和芥兰。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本发明披露了一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1多态性位点鉴定及InDel分子标记的开发
1、材料处理
本申请本实施例中，对48份野生甘蓝、84份花椰菜、168份青花菜、105份结球甘蓝、6份球茎甘蓝及10份芥兰这六类甘蓝类物种(共计421份)进行了鉴定。
对这421份材料在武汉市蔬菜科学研究所试验基地进行正常播种种植。在苗期进行叶片组织取样，并将样品迅速置于-20℃保存。
采用CTAB方法提取每份材料的叶片全基因组DNA。具体方法为：
1)将0.1-0.2g叶片放入装有一粒钢株的2ml离心管中，加入700μl 2％CTAB，使用研磨仪60HZ充分研磨5min。
2)65℃水浴1h(每20min摇匀一次)；60-65℃水浴45min-1h均可。
3)加等体积的氯仿－异戊醇(体积比24：1)，或加入苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀。
4)12000rpm离心15min，取上清于新管中。
5)重复3，4步骤一次(如用幼嫩的叶片提取，色素较少时该步骤可略去)。
6)向上清中加入2倍体积的无水乙醇(或2/3体积的异丙醇)沉淀DNA，-20℃放置20min或更长时间，或过夜(加入无水乙醇后如有较多DNA析出，不必长时间沉淀)。
7)用枪头挑出絮状DNA或离心去上清。
8)加75％的乙醇或76％+NH4AC(10mmol/L)清洗DNA，洗3次，去上清；室温下晾干。
9)风干后加入100-300ul的1：100的RNA酶：ddH2O的混合液溶解DNA。
DNA质量检测方法为：采用琼脂糖凝胶电泳(1％)及Thermo的NanoDropOne确定DNA样品浓度、质量及完整性。确保所有DNA样品浓度、质量均可用于后续试验。
2、多态性位点鉴定及InDel分子标记的开发
如图1，在野生甘蓝C09染色体的WUSCHEL(WUS)基因的第二个外显子上筛选到一个InDel位点。在该InDel位点，结球甘蓝、球茎甘蓝和芥兰序列与野生甘蓝保持一致，而青花菜、花椰菜中存在12bp的缺失，缺失序列为TCATGTAGCCAT。
根据引物设计原则，本申请在所述InDel位点上下游200bp内用Primer 5设计了一对InDel标记引物，包括一条正向引物序列和一条反向引物，引物序列为：
F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT；
R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。
实施例2InDel标记引物的应用验证
以样品全基因组DNA为模板，利用开发的InDel标记引物PCR扩增反应体系及扩增程序进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯凝胶电泳，即可检测分辨不同的等位变异。对48份野生甘蓝、84份花椰菜、168份青花菜、105份结球甘蓝、6份球茎甘蓝及10份芥兰这六类甘蓝类物种(共计421份)进行了验证。PCR扩增反应体系总体积为25μl，由9.5μl ddH2O、12.5μlGreen Taq Mix、1μl 10μM的正向引物、1μl 10μM的反向引物和1μl全基因组DNA组成。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸7min。
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2所示：“M”代表DNA ladder marker，“w”、“i”和“b”分别代表野生甘蓝、青花菜、花椰菜，“c”、“a”和“g”分别代表结球甘蓝、芥兰、球茎甘蓝。除了“u”无法辨别，这六类甘蓝类物种预期的基因型和电泳结果均相符，即在青花菜和花椰菜中存在12bp的序列缺失，其它4类甘蓝类物种中没有发现该位点存在缺失现象。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果和预期基因型相符率为93.1％。结果表明结球甘蓝、球茎甘蓝、芥兰和野生甘蓝为一个类群，青花菜和花椰菜为另一类群。
此外，对这六类甘蓝类物种每类随机挑选四个品种的PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳及sanger测序，结果如图3所示：“Marker”、“Wild”等从左到右依次为DNA laddermarker、野生甘蓝、花椰菜、结球甘蓝、青花菜、球茎甘蓝和芥兰。电泳和sanger测序结果表明青花菜和花椰菜存在12bp的缺失，缺失序列为TCATGTAGCCAT，其它4类在该位点没有存在缺失现象。进一步证明该InDel分子标记能将结球甘蓝、球茎甘蓝、芥兰和野生甘蓝分为一个类群，青花菜和花椰菜归为另一类群。
综上，该InDel分子标记可高通量鉴定青花菜、花椰菜种子准确性、真实性。为青花菜、花椰菜和其它甘蓝类物种如结球甘蓝、球茎甘蓝、芥兰及野生甘蓝的品种鉴定提供依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 甘蓝(Brassica oleracea L.)
<400> 1
tcatgtagcc at 12
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtccatcctc cacttacgtt gt 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgctct taatgcttct tct 23

Claims (10)

1.一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记，其特征在于：所述InDel位于野生甘蓝013基因组C09染色体11,151,186bp处，核苷酸序列为TCATGTAGCCAT。
2.检测如权利要求1所述的InDel分子标记的引物组，其特征在于，包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。
3.一种试剂盒，其特征在于：包含检测如权利要求1所述的InDel分子标记的引物组。
4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于：所述引物组包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。
5.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于：还包含Green Taq Mix。
6.如权利要求1所述的InDel分子标记、或权利要求2所述的引物组、或权利要求3所述的试剂盒在鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜中的应用。
7.一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的方法，其特征在于：对权利要求1中所述的InDel分子标记进行检测，缺失所示核苷酸序列的InDel分子标记的样品为青花菜或花椰菜。
8.根据权利要求7所述的一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的方法，其特征在于：包含所示核苷酸序列的InDel分子标记的样品为结球甘蓝、或球茎甘蓝、或芥兰、或野生甘蓝。
9.根据权利要求7所述的一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的方法，其特征在于：以蔬菜样品基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物组进行扩增，根据扩增结果判断样品类型。
10.根据权利要求7所述的一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的方法，其特征在于：扩增结果出现196bp条带时为青花菜或花椰菜；出现208bp条带时为结球甘蓝、或球茎甘蓝、或芥兰、或野生甘蓝。
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