CN114540533B - 一种早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，属于分子生物学技术领域。本发明基于PpBBX24‑like基因第三个外显子上的单核苷酸多态性与花青苷积累显著相关，利用该位点对红巴梨杂交后代进行分型，所述单核苷酸多态性位点为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第553位存在的C→T的多态性。利用PCR技术或测序技术可以有效检测所述单核苷酸多态性，该方法准确性好，且苗期的植株各器官均可作为检测样品，无需等到结果期，实现着色与非着色后代个体的早期筛选，加速选育进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的分子标记及其应用。
背景技术
巴梨(Bartlett，又名Williams)是一个栽培历史悠久，极具栽培价值的西洋梨品种，为西洋梨的主要栽培品种。巴梨原产于英国，系自然实生品种，其风味独特，品质极佳，单果重200克左右，充分成熟后，果皮呈黄色，阳面有红晕，皮薄，肉乳白色，质细软而易溶，汁极多，含有极少的石细胞，含糖量高达15％，味浓香甜，是鲜食、制罐兼可的优良品种。
红巴梨(Max Red Bartlett)是巴梨的红色自然突变，具有红色嫩枝和果实，生长适应性强，树势强旺，萌芽力、成枝力均强，坐果数多，采收前落果率低，产量高，果实为罕见的红色粗颈葫芦形，果点少而疏，阳面紫红色，极为鲜艳美观。果肉白色，后熟果果肉软，肉质细腻，香甜多汁，风味好。由于其鲜红色果皮具有很强的遗传力，常被用作亲本培育新品种，是良好的红梨育种亲本。
探讨红梨着色的分子生物学机制，寻找梨果皮着色相关遗传分子标记用于育种后代中红梨品种的早期筛选，加快选育进程对于梨育种事业具有重要意义。
研究表明，红梨色泽形成源于果皮中花青苷的积累，花青苷是一种类黄酮化合物，可以使植物器官可以展现出红色等颜色，吸引昆虫和小动物传播花粉与种子；还具有防御病虫、减少紫外伤害、清除活性氧等多种生物学功能。花青苷由苯丙烷途径合成，相关结构基因会受到一系列转录因子的调控，其中主要会受到MYB、bHLH和WDR类蛋白形成的MBW复合体的调控，作用机制在植物中十分保守。除MBW复合体以外，HY5也是调控花青苷合成中重要的转录因子。HY5可与BBX等蛋白结合，动态调节红梨的花青苷积累。
在前人研究中，‘早酥’梨的红皮芽变‘红早酥’品种中PpBBX24-like编码区14bp碱基的缺失造成氨基酸移码突变，是红皮芽变形成的关键基因，说明PpBBX24-like对花青苷的合成有关键性作用(Ou,C.,Zhang,X.,Wang,F.et al.A 14nucleotide deletionmutation in the coding region of the PpBBX24 gene is associated with the redskin of“Zaosu Red”pear(Pyrus pyrifolia White Pear Group):a deletion in thePpBBX24 gene is associated with the red skin of pear.Hortic Res 7,39(2020))。
目前针对红巴梨的PpBBX24-like基因尚未有相关研究报道，其果皮着色的分子机制尚不明确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴别红巴梨杂交后代果皮着色的相关遗传分子标记，为育种后代中着色个体的早期筛选提供检测方法，以加快选育进程。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明参考翠冠梨的基因组序列，对红巴梨杂交后代的着色和非着色个体的PpBBX24-like基因进行克隆，测序比对后得出PpBBX24-like基因(CDS区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)第三个外显子的一个位点存在单核苷酸多态性(SNP)，即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第553位存在C→T的多态性。该SNP与红巴梨杂交后代的花青苷积累显著相关，因此可以作为红巴梨杂交后代的着色个体早期鉴别的分子标记。所述着色个体是指植株表型具有红色嫩枝和果实，果实果皮着红色。
本发明提供了单核苷酸多态性位点作为检测靶点在鉴别红巴梨杂交后代中着色个体中的应用，所述单核苷酸多态性位点为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第553位的C→T的多态性。
当第553位的碱基为C时红巴梨杂交后代无花青苷积累，表现为不着色；当第553位的碱基为T时红巴梨杂交后代具有明显的花青苷积累，表现为着红色。
作为上述分子标记的应用，本发明提供了一种用于鉴别红巴梨杂交后代是否着色的检测试剂盒，所述试剂盒包括：特异性扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第553位的C→T的多态性的引物对。
所述引物对为两对，针对上述位点的单核苷酸多态性，设计两条特异性的上游引物和一条特异性的下游引物，每一条特异性上游引物分别对应含有碱基C和碱基T的序列，分别与所述下游引物组成引物对。根据相应配对引物扩增得出的阳性结果判断待测样本的基因型。
所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、DNA聚合酶和PCR缓冲液。PCR反应液中各组分之间的用量关系为常规PCR条件下的比例，对所属领域技术人员是常规知识。
本发明还提供了一种早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测红巴梨杂交后代样本的基因组DNA，作为模板，进行PCR扩增得到PCR扩增产物，其中PCR扩增采用的引物根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行设计，其扩增产物包含所述核苷酸序列第553位的单核苷酸多态性；
(2)对PCR扩增产物进行测序，基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列对测序结果比对，当第553位的碱基存在T碱基，则判断该红巴梨杂交后代为着色个体；反之则判断为非着色个体；
或者，步骤(1)中引物采用特异性扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第553位的C→T的多态性的引物对；步骤(2)中，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判断待测红巴梨杂交后代是否为着色个体。
其中位点编号是基于SEQ ID NO.1所示的序列。着色个体为果皮着红色，非着色个体为果皮不着红色。
作为优选，所述待测红巴梨杂交后代样本为苗期的枝条或叶片。本发明通过基因水平的检测实现了对杂交后代着色表型的早期预判，有利于加快选育进程。
上述方法中根据不同设计的引物选择对应的扩增产物测定方法，方法一，克隆包含上述SNP位点的基因片段，通过测序测定SNP位点的碱基；方法二，针对上述SNP位点设计两组特异性引物对，特异性克隆包含相应碱基的序列，根据是否能克隆出相应目标片段来判断待测样本的基因型。
上述SNP位点位于PpBBX24-like基因第三个外显子，作为优选，方法一中，以PpBBX24-like基因第三个外显子中SNP位点附近的序列作为克隆对象。具体的，根据SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第504位-第720位之间的序列进行引物设计。
作为优选，所述引物的上游引物：5’-AGAGCTCGAATGGATAGCAG-3’；下游引物：5’-AGTTGATACATGTCTAAAATCTG-3’。
作为优选，所述PCR反应体系组成包括：以总体积25μL计，I-5TM2×High-FidelityMaster Mix 12.5μL，9.5μLddH2O，10μmol·L-1的上下游引物各1μL，DNA模板1μL。
作为优选，PCR扩增程序：第一步：98℃预变性2min；第二步：98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸20s，循环35次；第三步：72℃延伸5分钟；最后4℃保存。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供了一种用于鉴别红巴梨杂交后代果皮是否着色的分子标记，PpBBX24-like基因第三个外显子上的单核苷酸多态性(即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第553位的C→T的多态性)与花青苷积累显著相关，可以通过该位点对红巴梨杂交后代进行分型。
(2)利用PCR技术或测序技术可以有效检测所述单核苷酸多态性，该方法准确性好，且苗期的植株各器官均可作为检测样品，无需等到结果期，实现着色与非着色后代个体的早期筛选，加速选育进程。
附图说明
图1为巴梨杂交后代群体中两种表型，其中A组表现为枝干和叶子呈现绿色，B组表现为枝干和叶子呈明显的红褐色。
图2为18个巴梨杂交后代花青苷含量。
图3为杂交后代中两种基因型的峰图，其中A为嫩枝表型为绿色的测序图谱，B为嫩枝表型为红褐色的测序图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、研究对象
红巴梨杂交后代群体来自红巴梨自然开放授粉的群体。随机选取18个红巴梨杂交后代生长期的枝条，分别编号为1、2、3……18，进行表型鉴定，结果表明，红巴梨杂交后代存在两种表型，其中编号为1、3、7、8、9、10、11、15、16的枝干和叶子呈现绿色，如图1(A)所示；编号为2、4、5、6、12、13、14、17、18的枝干和叶子呈明显的红褐色，如图1(B)所示。
所有枝条剪成块放入液氮中速冻，随后研磨，将其用药匙刮到15ml离心管中，-80℃冰箱保存。
2、红巴梨杂交后代枝条样品中花青苷含量检测
1.5mL离心管中加入500μL花青苷提取液(V盐酸:V甲醇＝1:99)，随后称取近0.1g样品粉末，颠倒混匀。黑暗条件，4℃静置24h。使用分光光度计(EppendorfBioSpectrometer Basic，German)测定测量530nm、520nm、650nm下的吸光值，即OD530、OD620、OD650。花青苷含量采用标准化OD530表示：Normolized OD530＝(OD530-OD650)-0.2*(OD650-OD620)。
通过盐酸-甲醇溶液提取花青苷测量，结果如表1所示。为了更清晰地体现花青苷含量差异，将Nomolized OD530用柱形图表示，如图2所示。可以明显看到编号为2、4、5、6、12、13、14、17、18的9个样品存在明显的花青苷积累，其余9个样品无花青苷积累。
表1红巴梨杂交后代基因型及花青苷测定结果
3、红巴梨后代基因型检测
3.1DNA提取
65℃预热CTAB，取800μL后加入0.1g样品粉末，65℃孵育20min，期间每五分钟颠倒混匀。13000rpm离心5min，将上清转入新的2mL离心管中，加600μL氯仿&异戊醇(24:1)，涡旋。13000rpm离心5min，将上清转入新的1.5mL离心管中，加入等体积(600μL)异丙醇，颠倒混匀。13000rpm离心5min，弃上清，得白色沉淀，加500μL 70％乙醇重悬沉淀。13000rpm离心5min，倒掉上清，用100μL移液枪吸走残留的上清。室温下将离心管倒置在吸水纸上5-10min。用30μL dd H2O溶解沉淀，测OD600，凝胶电泳检测质量和浓度。之后放于-40℃冰箱保存直至进行后续PCR检测。
3.2PCR引物及其反应体系
本研究以翠冠梨PpBBX24-like基因中第3个外显子序列为参考序列设计引物，引物序列见表2，其中下游引物对应第三个外显子后面的3’UTR区。以3.1提取的18个红巴梨杂交后代的DNA为模板，用I-5TM2×High-Fidelity Master Mix(Tsingke，China)高保真酶进行基因克隆。
表2 PpBBX24-like检测上下游引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| PpBBX24-like F | AGAGCTCGAATGGATAGCAG |
| PpBBX24-like R | AGTTGATACATGTCTAAAATCTG |
PCR扩增体系(25μL)：12.5μL I-5TM2×High-Fidelity Master Mix，9.5μLddH2O，各1μL(10μmol·L-1)上下游引物、1μL DNA模板。
PCR扩增程序：98℃预变性2min，35个循环(98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸5分钟，最后4℃保存。
取9μL PCR产物与1μL的10×loading buffer加入1.0％琼脂糖凝胶(含有溴化乙锭)电泳分离，120V电压电泳15min，紫外灯下观测条带。结果显示，1-18号样品均能扩增出230bp左右的目标片段。
3.3测序及结果分析
取16μL PCR产物送浙江尚亚生物技术有限公司进行测序。测序结果用SnapGeneViewer软件进行分析。
测序结果显示，在18个杂交后代中，存在两种基因型，如图3B所示，与花青苷含量结果相对应，有明显花青苷积累的2、4、5、6、12、13、14、17、18号的峰图存在双峰，即存在G→A转换突变，即编码链为C→T转换，其基因型为T/C；而没有花青苷积累的其他9个样品峰图如图3A，其基因型为C/C。
进一步的，对两种基因型杂交后代的PpBBX24-like基因进行测序，其CDS区如SEQID NO.1所示，其中第553位(即图3B的双峰位置)存在单核苷酸多态性：C→T，即该位点碱基存在C和T两种情况。红巴梨杂交后代的PpBBX24-like基因编码链存在C→T转换，使得转录过程中原本的CAG密码子(图3A)变成UAG终止密码子(图3B)，提前终止翻译，导致蛋白结构不完整，其功能受到影响。
综上，红巴梨杂交后代中PpBBX24-like的C→T转换突变，导致翻译提前终止，合成不完整的蛋白序列，而这样的突变正好使得其具有促进花青苷合成的功能。因此，对红巴梨杂交后代中通过该位点进行分型，作为分子标记早期筛选出着色与非着色的后代个体。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 红巴梨(Max Red Bartlett)
<220>
<221> variation
<222> (553)..(553)
<223> n is t or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (553)..(553)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
atgaagattc agtgtgatgt gtgcgagaag gcgccggcga cggtgatttg ttgcgccgac 60
gaggcggctc tgtgcgccaa atgcgacgtt gaagtacacg cagcgaataa gcttgcaagc 120
aaacaccaga ggctgctcct tcagagcctc tccaacaagc ttcctaaatg cgacatttgc 180
caagataaga cagcttttat attctgcgta gaagacagag ccctcttttg tcaggattgt 240
gatgaaccaa ttcattcagc caatagcctc tctgcaaacc accagaggtt ccttgccact 300
ggaatccgag tggctttggc ctccagtagt actaaggaag ctgaaacgag tggcttagag 360
ccacccaatc aaggtgcaca gaagatttca acaaaagtct cagcaccaca ggcttctggc 420
atctcatcac catggggtgt tgatgacttg ctgcaattat cagattttga atcttctgac 480
aagaaggatt cgcttgagtt tggagagctc gaatggatag cagacatggg tattttcggt 540
gatcagtttc ctnaggaggc accggcagca gctgaagttc cgcagctccc agtaccacag 600
tcgagcaatc ttacctccta cagaccccct aaatcaagca gtccgcccaa gaagcctagg 660
attgaaatcc cagatgacga tgatgagtat ttcactgttc ctgaccttgg cagattttag 720
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagctcgaa tggatagcag 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttgataca tgtctaaaat ctg 23
Claims (7)
1.单核苷酸多态性位点作为检测靶点在鉴别红巴梨杂交后代中着色个体中的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性位点为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第553位存在的C→T的多态性；
所述着色个体是指植株表型具有红色嫩枝和果实，果实果皮着红色；当第553位的碱基为C时红巴梨杂交后代无花青苷积累，表现为不着色；当第553位的碱基为T时红巴梨杂交后代具有花青苷积累，表现为着红色。
2.一种早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测红巴梨杂交后代样本的基因组DNA，作为模板，进行PCR扩增得到PCR扩增产物，其中PCR扩增采用的引物根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行设计，其扩增产物包含所述核苷酸序列第553位的单核苷酸多态性；
(2)对PCR扩增产物进行测序，基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列对测序结果比对，当第553位的碱基存在T碱基，则判断该红巴梨杂交后代为着色个体；反之则判断为非着色个体；
或者，步骤(1)中引物采用特异性扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第553位的C→T的多态性的引物对；步骤(2)中，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判断待测红巴梨杂交后代是否为着色个体；
所述着色个体是指植株表型具有红色嫩枝和果实，果实果皮着红色。
3.如权利要求2所述的早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，其特征在于，所述待测红巴梨杂交后代样本为苗期的枝条或叶片。
4.如权利要求2所述的早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第504位-第720位之间的序列进行引物设计。
5.如权利要求2所述的早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，其特征在于，所述引物的上游引物：5’-AGAGCTCGAATGGATAGCAG-3’；下游引物：5’-AGTTGATACATGTCTAAAATCTG-3’。
6.如权利要求2所述的早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，其特征在于，所述PCR反应体系组成包括：以总体积25μL计，
下游引物各1μL，DNA模板1μL。
7.如权利要求2所述的早期鉴别红巴梨杂交后代中着色个体的方法，其特征在于，PCR扩增程序：第一步：98℃预变性2min；第二步：98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸20s，循环35次；第三步：72℃延伸5分钟；最后4℃保存。
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| CN102242186A (zh) * | 2010-05-11 | 2011-11-16 | 山东省果树研究所 | 苹果MdMYB1基因中与着色相关的两处突变及其检测方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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| A 14 nucleotide deletion mutation in the coding region of the PpBBX24 gene is associated with the red skin of "Zaosu Red" pear (Pyrus pyrifolia White Pear Group): a deletion in the PpBBX24 gene is associated with the red skin of pear;Horticulture Research;第7卷(第1期);摘要，材料和方法，讨论 * |
| 水稻含有B-box锌指结构域的OsBBX25蛋白参与植物对非生物胁迫的响应;刘焱;邢立静;李俊华;戴绍军;;植物学报(第04期);全文 * |
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