KR102108750B1

KR102108750B1 - 사과 과육색 판별용 마커

Info

Publication number: KR102108750B1
Application number: KR1020180161468A
Authority: KR
Inventors: 김세희; 박서준; 조강희; 이한찬; 김명수; 이정우; 최인명
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-05-08

Abstract

본 발명은 사과의 과육색을 판별하기 위한 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 사과 과육색 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 사과 과육색 판별 방법 및 이를 포함하는 사과 과육색 판별용 키트에 관한 것이다.

Description

사과 과육색 판별용 마커{Marker for the identification of apple flesh color}

본원은 사과의 과육색을 판별하기 위한 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 사과 과육색 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 사과 과육색 판별 방법 및 이를 포함하는 사과 과육색 판별용 키트에 관한 것이다.

사과나무(Malus domestica Borkh)는 장미과(Rosaceae) 배나무아과(Maloideae) 사과나무속(Malus)에 속하는 목본성 영년생 원예작물로 온대 지역에서 주로 재배하고 있으며, 일년생 작물에 비해 과실의 형질을 확인하기까지의 유년기간이 길고, 수형이 커서 육종을 위해서는 많은 포장 면적과 경비가 소요되어 육종 효율이 낮은 작물이다. 또한 사과나무속은 자가불화합성으로 인해 근연종은 물론이고, 품종간에도 교배 불친화성이 존재하며 유전적으로 이형접합이다(Sassa et al. 1994). 따라서 육종 효율을 높이기 위하여 유묘기에 목표형질을 가진 개체를 선발할 수 있는 조기선발 분자표지의 개발이 필요하다. 사과에서는 검은별무늬병 저항성, 흰가루병, 과피색과 관련한 분자표지 개발 연구가 보고되었으며, MdMYB1 유전자를 활용한 적색 과피를 구분할 수 있는 SNP 분자표지에 관한 연구가 보고되었다(Yanmin et al. 2011).

사과 품종 육성 초기에는 대과, 고당도 품종 개발이 육종 목표였으나 최근 붉은색 과육, 항산화 기능이 높은 품종 개발 목표가 추가되었다. 사과 유전자원을 수확기의 과육색으로 분류하면 백색 과육과 적색 과육으로 나뉘어진다. 한국에서는 수확했을 때 과육색이 백색인 품종을 주로 재배하고 있지만, 소비자들의 요구는 기능성 성분 함량이 높은 품종으로 변화하고 있다. 사과의 기능성 성분 함량은 백색 과육보다는 적색 과육에 더 많이 함유되어 있어, 기능성 물질의 섭취를 위해 적색 과육 사과 품종의 육성이 필요하다. 전 세계적으로 과육까지 붉은 사과 품종은 '레드필드', '오카나간', '퍼플 웨이브' 등 여러 품종이 육성되었으나 대체로 산도가 높아 식미는 불량한 편이다. 적육계 사과의 식미를 개량하기 위해서 여러 조합과 세대를 진전시켜야 하며, 조기선발 분자표지 개발 등 육종연한 단축을 위한 연구가 필요하다. 과수에서 색소를 나타내는 플라보노이드는 식물의 꽃, 과실, 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등 식물체 전체 부위에 존재하며 생장과 발육, 미생물과 해충에 대한 방어, 약리적 효과, 강력한 항산화 활성을 가지고 있다(Forkmann and Martens 2001). 사과에서 꽃, 과실, 잎 등이 적색으로 발현하는 데에는 MdMYB 전사 인자가 관여하는 것으로 보고되었으며(Espley et al. 2007), MdMYB1 유전자는 사과의 과피색을 적색으로 하는데 있어 key regulator로 알려져 있어서(Ban et al. 2007), 국내에서는 이 유전자에서 유래한 SNP 분자표지를 개발하여 사과의 과피색을 조기에 구분하는데 활용하고 있다(Kim et al. 2011). MdMYB10 유전자는 사과의 과육색을 적색으로 하는데 있어 중요한 역할을 하며 이 유전자에서 유래한 SNP 분자표지를 이용하여 사과의 과육색을 판별한 연구결과가 보고되어 있다(Chagne et al. 2007).

현재 염기서열 분석법의 발달과 비용의 절감으로 식물의 염기서열 분석이 빠르게 진행되고 있다. 박과 식물의 경우 최근 오이(2009년), 멜론(2012년), 수박(2013년)의 전장 염기서열이 공개되었으며, 최근 게놈의 서열분석을 통한 게놈서열기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 특히 단일염기다양성(single nucleotide 다형성; SNP) 정보의 확보로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 분자마커로서의 활용도가 증가되고 있다. 한편, 한국공개특허 제2011-0074204호는 사과의 품종 판별용 SCAR 표지 및 이의 용도를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1291609호는 김 종 구분용 엽록체 CAPS 마커를 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 과육색 판별용 마커 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명의 목적은 사과의 기능성 성분 함량이 기존의 백색 과육보다는 적색 과육에 더 많이 함유되어 있어, 기능성 물질의 섭취를 위해 적색 과육 품종의 육성이 필요함에 따라 사과 적색 과육 품종을 만들기 위해서는 여러 조합과 세대를 진전시켜야 하기 때문에 조기선발 마커를 개발하고자 하는데 그 목적이 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다. 명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서, 용어 "프라이머(primer)"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는, 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 제 1항의 프라이머를 포함하는, 사과 과육색 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트의 프라이머는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트;를 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 사과 과육색은 적색 과피 또는 적색 과육 사과 품종, 및 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 적색 과피 또는 적색 과육 사과 품종은 크림슨 글로리(Crimson Glory), 제이 달링(Jay Darling), 엠. 퍼밀라 로얄티(M. pumila Royalty), 마카밀크(Makamilk), 메이 폴(May Pole), 오카나간(Okanagan), 핑크 우드(Pink Wood), 퍼플 웨이브(Purple Wave), 레드 플레쉬(Red Flesh), 레드필드(Redfield)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 백색 과육 사과 품종은 아메르(Amere), 불머 노만(Bulmer Norman), 코트 펜두(Court Pendu), 엔드 블루 그린(End Blue Green), 그라니 스미스, 킨세이(Kinsei), 로디(Lodi), 무츠(Mutsu), 노스웨스트 그리닝(Northwest Greening), 프리아모스(Priam), 투만지(Tumange)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 시료로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 유전체 DNA를 제 1항의 프라이머로 증폭하는 단계; 및, (c) 유전체 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 사과 과육색의 판별 방법을 제공한다.

이 때, 상기의 프라이머는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행되는 것이다.

구체적으로는, 상기 a) 단계에서 사과의 유전체 DNA를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, CTAB (CetylTrimethylAmmonium Bromide) 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

구체적으로는, 상기 (b) 단계에서 프라이머 세트는, 표 3에 표시된 103 쌍의 사과 과육색을 구별할 수 있는, 핵산 서열을 각각 가지는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것이다. 상기 사과 과육색 판별용 마커인 프라이머는 1 세트 이상이 사용될 수 있고, 다수의 분자 마커가 동시에 사용되면 더 정확하게 과육색을 구별할 수 있다.

SNP ID MDC000453.153, 또는 MDC005247.512로 정의되는 SNP를 확인하여 사과 과육색을 판별하는 방법을 제공한다.

상기 프라이머 세트는 가장 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 사과 과육색은 적색 과피 또는 적색 과육 사과 품종, 및 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 적색 과피 또는 적색 과육 사과 품종은 크림슨 글로리(Crimson Glory), 제이 달링(Jay Darling), 엠. 퍼밀라 로얄티(M. pumila Royalty), 마카밀크(Makamilk), 메이 폴(May Pole), 오카나간(Okanagan), 핑크 우드(Pink Wood), 퍼플 웨이브(Purple Wave), 레드 플레쉬(Red Flesh), 레드필드(Redfield)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 백색 과육 사과 품종은 아메르(Amere), 불머 노만(Bulmer Norman), 코트 펜두(Court Pendu), 엔드 블루 그린(End Blue Green), 그라니 스미스, 킨세이(Kinsei), 로디(Lodi), 무츠(Mutsu), 노스웨스트 그리닝(Northwest Greening), 프리아모스(Priam), 투만지(Tumange)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서 유전체 DNA의 증폭은 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해 수행될 수 있다. PCR은 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하거나 상업적으로 이용 가능한 사과를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 사과에서 추출된 유전체 DNA와 본원의 SCAR 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 예를 들어, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성 동위원소가 증폭 산물에 혼입되어 방사성으로 표지될 수 있다. 또는, 증폭 산물은 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.

구체적으로는, 상기 (c) 단계에서 증폭된 DNA 산물의 분석은 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의한 것이면 가능하며, 예를 들면 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 증폭 산물을 검출하기 위해 모세관 전기영동을 수행할 수 있으며, ABi Sequencer를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 예를 들어, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 예를 들어, 1 내지 5%, 바람직하게는 1.4% 아가로즈 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

증폭된 DNA 산물을 겔 전기영동을 사용하여 분석하는 경우, 아가로오스 겔 또는 아크릴 아마이드 겔 상에서 증폭 산물을 전기영동하고, 에티디움 브로마이드(EtBr), 실버 염색(silver staining) 등에 의해 밴드를 확인할 수 있다.

본원은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본원의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

사과의 기능성 성분 함량이 기존의 백색 과육보다는 적색 과육에 더 많이 함유되어 있어, 기능성 물질의 섭취를 위해 적색 과육 품종의 육성이 필요함에 따라 사과 적색 과육 품종을 만들기 위해서는, 본원에 따른 사과 과육색 판별용 마커를 이용하면 21 종 이상의 사과의 과육색을 정확히 판별할 수 있다.

도 1은 사과 적색 과육 품종 판별용 SNP 마커 1종(MDC000453.153)의 HRM 분석에서 정규화된 그래프이다. 연두색은 백색 과육 11품종을 나타내고, 파란색은 적색 과육 10품종을 나타낸다.
도 2는 사과 적색 과육 품종 판별용 SNP 마커 2종(MDC005247.512)의 HRM 분석에서 정규화된 그래프이다. 연두색은 백색 과육 11품종을 나타내고, 파란색은 적색 과육 10품종을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

실물재료 및 RNA 추출

본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에 재식되어 있는 적색 과피, 적색 과육 사과 품종, '레드필드(레드필드)'와 녹색 과피, 백색 과육 사과 품종인 '그라니 스미스(그라니 스미스)' 과실을 시기별로 채취하여 액체질소를 사용하여 분쇄하였다. 만개 후 7주에 과실을 수확하였고, RNA 분리 방법은 Pine Tees Methods (Shujun et al. 1993)에 따라서 다음과 같이 수행하였다. 분쇄한 3g의 시료에 15㎖의 추출용액(2% CTAB, 2% PVP, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.05% 스페르미딘, 2% β-머캅토에탄올 사용 직전에 첨가)을 첨가하였다. 동량의 클로로폼:아이소아밀 알코올 (24:1)을 첨가하여 15000rpm에서 25분 동안 원심분리하였다. 상등액에 1/4 volume의 10M LiCl를 첨가한 후 4℃에서 7시간 이상 보관 후, 15000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 500μL의 SSTE에 녹이고 동량의 클로로폼:아이소아밀 알코올 (24:1)을 첨가하였다. 15000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 분리한 후 2배의 에탄올 첨가 후에 -70℃에서 40분 동안 저장 후 DEPC 처리한 멸균수에 녹였다. Total RNA로부터 mRNA를 분리하기 위해 poly A Tract mRNA isolation kit (Promega. USA)를 사용하였다. 다당류를 제거하기 위해 올리고 (dT) 컬럼을 사용하는 대신에 비오틴화된 올리고 (dT)와 상자성 입자(paramagnetic particles)를 사용하였다. 1mg의 Total RNA의 최종 부피를 500μL로 맞춘 후 65℃에서 10분간 저장 후 3μL의 비오틴화된 올리고 (dT) 프로브와 13μL의 20ⅹSSC를 첨가 후 상온에 저장하였다. SA-PMP(streptavidin paramagnetic particles)이 튜브 안에서 완전하게 섞이도록 한 후에 자성 스탠드(magnetic stand)에 세워서 입자를 분리하고, total RNA와 혼합하여 10분 동안 저장 후에 자성 스탠드에서 0.3㎖의 0.1ⅹSSC로 4번 세척한 후 0.1㎖의 DEPC 처리한 멸균수를 첨가하였다.

'레드필드' 및 '그라니 스미스'의 SNP 및 In/Del 분석

'레드필드'와 '그라니 스미스' 전사체 분석 결과에서 찾은 SNP를 매트릭스로 만들어 변이 과정을 거친 후 동형(homozygous) SNP와 이형(heterozygous) SNP로 나누었고, SNP 선발 조건은 3 이상으로 하였다. '레드필드'와 '그라니 스미스'의 SNP 비교분석은 동일한 SNP 위치에서 두 시료 간에 서로 동형 SNP인 경우만을 선발하였고, 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개가 선발되었다. GO분석은 TAIR10_ID을 이용하여 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp)에서 제공하는 Gene Ontology Annotation Tool을 사용하였다. 참조한 제놈의 유전자는 선택적인 스플라이싱 형태를 포함하고 있기 때문에 한 개의 SNP 위치는 한 개 이상의 전사체에 포함될 수 있으며 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개를 포함하는 전사체수는 323개이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개이다. 이후 GO 분석 및 SNP 프라이머 디자인은 다형성을 나타내는 SNP 554개만을 사용하여 분석을 진행하여 103개의 프라이머를 제작하였다.

HRM 분석

HRM 분석(Wittwer et al. 2003)에 필요한 프라이머 제작을 위해 참조한 제놈과 주석 정보는 JGI Phytozome에서 사과(Malus domestica) 제놈 데이터를 받았고 7500 Fast Real-time PCR machine (Applied BioSystems)을 사용하여 수행하였다. HRM 분석을 위한 gDNA 추출은 표 1에 나타낸 바와 같이 적색 과피, 적색 과육 사과 10개의 품종, 및 표 2에 나타낸 바와 같이 백색 과육 사과 11개의 품종에서 잎을 채취하여 DNeasy Plant kit (Qiagen)을 사용하여 gDNA를 분리하였다. 적색 과피, 적색 과육 사과 10개의 품종으로는 크림슨 글로리(Crimson Glory), 제이 달링(Jay Darling), 엠. 퍼밀라 로얄티(M. pumila Royalty), 마카밀크(Makamilk), 메이 폴(May Pole), 오카나간(Okanagan), 핑크 우드(Pink Wood), 퍼플 웨이브(Purple Wave), 레드 플레쉬(Red Flesh), 및 레드필드(Redfield)를 들 수 있다. 또한, 백색 과육 사과 11개의 품종으로는 아메르(Amere), 불머 노만(Bulmer Norman), 코트 펜두(Court Pendu), 엔드 블루 그린(End Blue Green), 그라니 스미스, 킨세이(Kinsei), 로디(Lodi), 무츠(Mutsu), 노스웨스트 그리닝(Northwest Greening), 프리아모스(Priam), 및 투만지(Tumange)를 들 수 있다.

번호	사과 적색 과육 품종
1	크림슨 글로리
2	제이 달링
3	엠. 퍼밀라 로얄티
4	마카밀크
5	메이 폴
6	오카나간
7	핑크 우드
8	퍼플 웨이브
9	레드 플레쉬
10	레드필드

번호	사과 백색 과육 품종
1	아메르
2	불머 노만
3	코트 펜두
4	엔드 블루 그린
5	그라니 스미스
6	킨세이
7	로디
8	무츠
9	노스웨스트 그리닝
10	프리아모스
11	투만지

추출한 DNA는 NanoDrop® ND-1000 (Nanodrop Technologies, USA)를 이용하여 정량하고 최종 농도가 20ng이 되도록 희석하였다. PCR 반응액은 gDNA 20ng에 각 SNP 분자표지에 해당하는 한 쌍의 프라이머(표 3)를 넣고 PCR 반응은 95℃에서 초기 변성을 수행한 후, 95℃에서 15초간 변성과 60℃에서 60초간 복원하는 과정을 40회 반복하였다. 마지막으로 95℃에서 10초간 변성 반응을 시킨 후, 60℃에서 95℃까지 0.2℃씩 올리면서 각 온도에서 5초간 유지하는 동안 형광을 측정하여 HRM melting 그래프를 그렸다.

결과 및 고찰

사과 RNA-Seq data를 이용한 SNP 분석

본 연구의 목적인 적색 과육 사과 품종과 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하기 위해서 사과 NGS 데이터를 참조 제놈에 매핑하여 genome wide SNP를 찾고, 적색 과육 품종인 '레드필드'와 백색 과육 품종인 '그라니 스미스'에서 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP를 선발하였다. 참조 제놈과 주석 정보는 JGI Phytozome에서 사과(Malus domestica) 제놈을 사용하였고, 사용한 염기서열은 881,278,625 bp이고 전사체 수는 63,517개, 전사체의 총 염기서열은 71,132,322 bp이다. '레드필드'의 총 read 수는 353,980이며 총 염기서열 길이는 213,441,953이고, read의 평균 염기서열 길이는 602.98 bp로 전사체 대비 범위가 3×이고, raw reads 대비 확보된 수치가 44.89%로 총 95,811,160 bp를 분석에 사용하였다. '그라니 스미스'의 총 read 수는 214,679이며 총 염기서열 길이는 129,247,804이고, read의 평균 염기서열 길이는 602.05 bp로 전사체 대비 범위가 1.82×이고, raw reads 대비 44.54%를 확보하여 57,564,661 bp를 분석에 사용하였다. 참조 제놈 대비, 배열 결과 '레드필드'는 정리된 read 중에서 73.52%의 read가 매핑되었고, '그라니 스미스'는 71.71%의 read가 매핑되었다. '레드필드'와 '그라니 스미스'에서 찾은 SNP를 매트릭스로 만들어 변이 과정을 거친 후, 동형 SNP와 이형 SNP로 나누어 정리하였고(표 4) SNP 선발 조건은 3 이상으로 하였다. '레드필드'와 '그라니 스미스'의 SNP 비교분석은 동일한 SNP 위치에서 두 품종간에 서로 동형 SNP인 경우만을 선발하였고, 그 결과 다형성을 나타내는 SNP 554개가 선발되었다. '레드필드'와 '그라니 스미스' 간에 탐색되는 SNP 554개의 주석(JGI Phytozome)을 찾은 결과 전사체 수는 323개이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개이다. SNP 수와 전사체 수가 다른 이유는 참조 제놈의 유전자는 한 개의 SNP 위치가 한 개 이상의 전사체에 포함될 수 있기 때문이다.

Sample	Total SNP	Homozygous SNP	Heterozygous SNP	Polymorphism SNP	HRM primer
레드필드	2,236	1,164	1,072	554	103
그라니 스미스	1,373	717	656	554	103

안토시아닌 생합성 관련 유전자 탐색 및 HRM 분석

'레드필드'와 '그라니 스미스' 간에 탐색되는 다형성 SNP 554개 중에서 103개의 프라이머 조합을 이용하여 HRM 분석을 하였다(표 3). 103개의 SNP 분자표지의 유전자 정보를 분석하여 탐색한 색소 생성과 관련된 유전자는 카로티노이드 분해 2산화효소 1로 C40 카로티노이드의 이중결합을 분해하여 다양한 아포카로티노이드를 생성하는 기능을 가지고 있다. 이 유전자로부터 유래한 SNP 분자표지는 사과 적색 과육 품종 10개와 백색 과육 11품종이 구분되지 않았다. 과육 색에 따른 21품종의 사과를 적색과 백색 2군으로 구분할 수 있는 SNP 분자표지는 2종이었다(표 5, 도 1 및 도 2). SNP ID, MDC000453.153의 유래는 알라닌-2-옥소글루타레이트 아미노전이효소 2로 식물의 잎에서 퍼옥시좀에 위치하며 광호흡에서 글리콜산 경로에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 유전자의 기능은 색소 생성과는 직접적으로 관계가 없지만 '레드필드'에서는 G 염기서열이 '그라니 스미스'에서 A로 바뀌어서 적색 과육 사과 10품종과 백색 과육 사과 11품종을 구분할 수 있었다(도 1). SNP ID, MDC005247.512의 유래는 리보솜 단백질 S4 (RPS4A) 패밀리 단백질로 리보솜 RNA에 결합하는 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있으며, '레드필드'에서는 G 염기서열이 '그라니 스미스'에서 A로 바뀌어서 21품종의 사과를 적색과 백색 2군으로 구분할 수 있었다(도 2).

번호	SNP ID	변이	프라이머 염기서열(5'→3')	서열번호	증폭산물 크기(bp)
1	MDC000453.153	G/A	F: ACCATGGAAAAGCAGAACAGC	서열번호 1	143
			R: ATGGTCA ACCCTCCCAAACC	서열번호 2
2	MDC005247.512	G/A	F: CAAGCCTTCGTCTGGACCTC	서열번호 3	149
			R: CGGTCCTC ACTTTCCCATCA	서열번호 4

본 연구에서는 기존에 알려진 안토시아닌 경로에 관여하는 유전자뿐만 아니라 다른 기작에 의해서도 사과 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 개발하고자 RNA-Seq 데이타를 사용하였다. 본 연구에서 개발한 2개의 SNP 분자표지가 적육계 사과 품종과 백육계 사과 품종을 구분할 수 있는 정확한 기작에 대해서는 앞으로 연구를 계속 진행해야 할 것이다. 또한 더 많은 유전자원과 교배집단에 적용하여 분자표지로서의 가능성이 있는지 확인할 필요가 있다. HRM 분석 방법에 의한 SNP 분자표지 개발은 재현성 실험 결과가 확보되어야 하고, 구분하고자 하는 개체수가 많을수록 정확성이 높다고 볼 수 있다. 고부가 기능성 사과 품종을 육성하는데 있어 전통육종방법은 적색과육과 같은 특정형질만 발현시키는 데 오랜 시간과 노력이 필요하다. 과수분야에서 특정 유전자를 발현시키는 분자육종은 국내에서도 사과, 포도, 키위 등에서 연구가 되고 있다. 또한, 비교적 일차 대사율이 낮은 종자나 과실 등의 조직에서는 특이적으로 플라보노이드 생합성을 유도하는 것이 프로모터의 개발을 통해 가능한 결과지만, 현실적으로 과수 형질전환체의 개발과 보급은 단시간 내에 이루어질 수 있는 연구가 아니기 때문에 전통육종방법을 활용하여 식미가 좋은 적육계 계통의 사과를 육성하는 것이 시급하다. 사과는 재식 후 2~3년이 경과되어야 과실의 특성을 볼 수 있기 때문에 적육계 계통 선발을 위한 교배 집단에서 분자표지의 개발은 육종 연한을 단축시킬 수 있는 중요한 수단이다. 본 발명에서는 고부가 기능성 품종으로 사과 적육계 계통을 육성하기 위해 전사체 분석방법으로 적육계와 백육계에서 차등으로 발현되는 유전자들을 분석하였고, HRM 방법을 이용한 SNP 분자표지를 개발하여 사과 유전자원 21품종에 적용함으로써 과육색을 구분할 수 있는 분자표지의 가능성을 검토하였다. 앞으로 안토시아닌의 내재 생합성 조절 기작에 대한 연구를 통해 기존에 보고되지 않은 새로운 유색관련 분자표지를 개발하고 이를 다양한 유전자원과 교배집단에 적용하여 육종연한을 단축할 수 있는 방향을 제시하고자 한다.

과육색이 다르게 발현되는 사과(Malus domestica L.) 품종의 유전자 발현을 비교하기 위해 2개의 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 붉은 색 과육 품종인 '레드필드'와 백색 과육 품종인 '그라니 스미스'의 유전자 발현 차이를 보기 위해 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 사용하였고 두 품종으로부터 얻은 EST의 염기서열을 결정하고 기존에 보고된 유전자와의 상동성을 분석하였다. HRM 기술은 붉은 색 과육 품종 사과와 백색 과육 품종 사과의 짧은 PCR 증폭산물에서 한 개의 서로 다른 염기서열을 구분하여 분리해낼 수 있다. '레드필드'와 '그라니 스미스'의 EST 데이타베이스로부터 103쌍의 단일염기다형성(SNP) 분자표지를 선발하였고, 붉은 색 과육 품종 10개와 백색 과육 품종 11개를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 HRM 방법으로 분석하였다. 본 연구에서는 사과 EST 데이타베이스를 기반으로 HRM 분석 방법을 이용하여 사과 품종의 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 효율적인 SNP 분자표지를 개발하였다. 이러한 SNP 분자표지는 사과육종에 유용하게 사용할 수 있으며 사과 품종의 다양한 색 변화에 관한 분자 기작 연구에 좋은 참고자료가 될 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Marker for the identification of apple flesh color <130> 0 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 accatggaaa agcagaacag c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 atggtcaacc ctcccaaacc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 caagccttcg tctggacctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 cggtcctcac tttcccatca 20

Claims

서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트; 및
서열번호 3으로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트 중 어느 하나 이상인, 사과 과육색 판별용 프라이머 세트.
제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 사과 과육색 판별용 키트.
제 2항에 있어서,
상기 프라이머 세트는,
서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트; 또는
서열번호 3으로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트;를 포함하는 것인, 사과 과육색 판별용 키트.
제 2항에 있어서,
상기 사과 과육색은 적색 과육 사과 품종, 및 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있는, 사과 과육색 판별용 키트.
제 4항에 있어서,
상기 적색 과육 사과 품종은 크림슨 글로리(Crimson Glory), 제이 달링(Jay Darling), 엠. 퍼밀라 로얄티(M. pumila Royalty), 마카밀크(Makamilk), 메이 폴(May Pole), 오카나간(Okanagan), 핑크 우드(Pink Wood), 퍼플 웨이브(Purple Wave), 레드 플레쉬(Red Flesh), 레드필드(Redfield)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 사과 과육색 판별용 키트.
제 4항에 있어서,
상기 백색 과육 사과 품종은 아메르(Amere), 불머 노만(Bulmer Norman), 코트 펜두(Court Pendu), 엔드 블루 그린(End Blue Green), 그라니 스미스, 킨세이(Kinsei), 로디(Lodi), 무츠(Mutsu), 노스웨스트 그리닝(Northwest Greening), 프리아모스(Priam), 투만지(Tumange)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 사과 과육색 판별용 키트.
(a) 시료로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 유전체 DNA를 제 1항의 프라이머 세트로 증폭하는 단계; 및,
(c) 유전체 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계;를 포함하는, 사과 과육색의 판별 방법.
제 7항에 있어서,
상기 프라이머 세트는,
서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트; 또는
서열번호 3으로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트;인, 사과 과육색의 판별 방법.
제 7항에 있어서,
상기 프라이머 세트는,
서열번호 1로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트; 및
서열번호 3으로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트;인, 사과 과육색의 판별 방법.
제 7항에 있어서,
상기 사과 과육색은 적색 과육 사과 품종, 및 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있는, 사과 과육색의 판별 방법.
제 10항에 있어서,
상기 적색 과육 사과 품종은 크림슨 글로리(Crimson Glory), 제이 달링(Jay Darling), 엠. 퍼밀라 로얄티(M. pumila Royalty), 마카밀크(Makamilk), 메이 폴(May Pole), 오카나간(Okanagan), 핑크 우드(Pink Wood), 퍼플 웨이브(Purple Wave), 레드 플레쉬(Red Flesh), 레드필드(Redfield)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 사과 과육색의 판별 방법.
제 10항에 있어서,
상기 백색 과육 사과 품종은 아메르(Amere), 불머 노만(Bulmer Norman), 코트 펜두(Court Pendu), 엔드 블루 그린(End Blue Green), 그라니 스미스, 킨세이(Kinsei), 로디(Lodi), 무츠(Mutsu), 노스웨스트 그리닝(Northwest Greening), 프리아모스(Priam), 투만지(Tumange)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 사과 과육색의 판별 방법.