KR102066594B1 - 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' (Euonymus hamiltonianus 'Korea Gold') 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것으로, 참빗살나무 신품종 코리아 골드는 다른 참빗살나무 잎이 녹색인 것과 달리 잎 가운데 흰색 무늬가 들어 관상가치가 매우 높은 품종으로 정원이나 공원 등 조경수로 이용하거나 가로수로 이용하여도 좋은 품종으로 판단된다.
Description
본 발명은 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것이다.
참빗살나무(Euonymus hamiltonianus)는 산기슭에 자라는 낙엽 떨기나무이다. 줄기는 높이 8m쯤이며, 잎은 마주나며 잎자루가 있다. 잎몸은 타원형 또는 난상 타원형으로 가장자리에 둔한 잔 톱니가 있다. 꽃은 5~6월에 피며, 4수성이고, 연한 녹색으로 지난해 가지의 잎겨드랑이에 취산꽃라례로 3~12개씩 달린다. 열매는 삭과이며 지름 0.8~1cm이고 붉게 익는다. 우리나라 전역에 자생하며, 러시아, 인도, 일본, 중국 등에 분포한다. 관상수로 이용하며 목재는 기구재로도 사용된다. 산기슭, 산 중턱, 하천 유역에 자라며 양지와 음지 모두에서 잘 자라고, 내한성이 강하며 수분이 적당한 사질양토를 좋아한다. 염기에 강하여 해안지방에서도 잘 자란다.
참빗살나무는 둥근 수형과 가을 단풍, 나무를 덮는 붉은 열매가 특징으로 조경수나 관상용으로 식재한다. 목재는 기구재나 도장재, 신탄재, 세공재로 쓰인다. 가지와 나무껍질을 구충, 진통, 진해 등의 약으로 쓰이거나 암 치료제로 민간에서 많이 사용된다.
참빗살나무의 번식은 실생과 삽목으로 한다. 실생으로 번식시킬 경우, 10월에 종자를 채취하여 과육을 제거한 후 노천매장하였다가 이듬해 봄에 파종한다. 종자 번식의 경우 발아하는데 2~3년이 소모된다. 삽목으로 번식시킬 경우, 2~4월에 가지삽목을 하며, 발근율이 보통이다.
한편, 최근 분자 생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기 서열의 다형성을 탐색하고 이를 분자마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용 가능하게 되었다. 특히, 유전적 분자마커 기술 개발은 작물 육성에서 이용가치가 증가되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1715745호에는 '솔비나무 특이적 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 솔비나무의 판별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1762029호에는 '매자나무와 매발톱나무를 구분하는 엽록체 유전체 유래 유전자 마커'가 개시되어 있으나, 본 발명의 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 참빗살나무의 자연교잡종을 유도하고 실생묘를 획득해 무성번식을 통해 계통 육성한 참빗살나무가 일반 참빗살나무와 달리 잎 가운데에 무늬가 들어있는 형태적 특성을 가지고 있음을 확인하고, 이를 참빗살나무 신품종 '코리아 골드'로 명명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18688P이며, 잎 가장자리는 녹색이고 잎 가운데에 무늬가 들어있는 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' (Euonymus hamiltonianus 'Korea Gold') 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18688P인 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 상기 프라이머 세트를 이용한 기탁번호가 KCTC18688P인 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 참빗살나무 신품종 '코리아 골드'는 다른 참빗살나무 잎이 녹색인 것과 달리 잎 가운데 흰색 무늬가 들어 관상가치가 매우 높은 품종으로 정원이나 공원 등 조경수로 이용하거나 가로수로 이용하여도 좋은 품종으로 판단된다.
도 1은 본 발명의 출원품종과 대조품종(참빗살나무)의 전초를 비교한 사진이다.
도 2는 본 발명의 출원품종과 대조품종의 엽색을 비교한 사진이다.
도 3은 NGS 데이터를 이용한 단순서열반복 변이지역 분석 전략이다.
도 4는 분자마커를 이용한 PCR 결과로, N은 참빗살나무, V는 출원품종인 코리아 골드를 의미한다.
도 2는 본 발명의 출원품종과 대조품종의 엽색을 비교한 사진이다.
도 3은 NGS 데이터를 이용한 단순서열반복 변이지역 분석 전략이다.
도 4는 분자마커를 이용한 PCR 결과로, N은 참빗살나무, V는 출원품종인 코리아 골드를 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18688P이며, 잎 가장자리는 녹색이고 잎 가운데에 무늬가 들어있는 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' (Euonymus hamiltonianus 'Korea Gold') 식물체를 제공한다.
본 발명의 참빗살나무 신품종 '코리아 골드'는 표 1에 기재된 것과 같은 형태학적 특징을 가지며, 일반 참빗살나무 식물체와 비교하여 잎 가운데에 무늬, 바람직하게는 흰색 무늬가 들어가 있는 식물체이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 참빗살나무 신품종 '코리아 골드'는 참빗살나무의 자연교잡종을 유도하고 실생묘를 획득해 무성번식을 통해 계통 육성하였다.
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCTC18688P이며, 잎 가장자리는 녹색이고 잎 가운데에 무늬가 들어있는 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체의 '부분체'는 이에 한정하지 않으나, 참빗살나무 신품종 '코리아 골드'의 화분, 뿌리, 가지, 잎, 꽃 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 자손 식물체는 참빗살나무 신품종 '코리아 골드'의 무성생식을 통해 유래된 자손 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18688P인 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이서 세트에 있어서, 상기 6개의 프라이머 세트는 단순서열반복(simple sequence repeat) 변이지역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다(표 3).
상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 및 서열번호 13 및 14 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 및 서열번호 13 및 14의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 1, 3, 7, 9, 11 및 13으로 나타낸 염기서열은 정방향 프라이머를 나타내며, 서열번호 2, 4, 8, 10, 12 및 14로 나타낸 염기서열은 역방향 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 따른 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 판별용 프라이머 세트는 상기 6개 프라이머 세트 중, 1개의 프라이머 세트, 2개의 프라이머 세트 조합, 3개의 프라이머 세트 조합, 4개의 프라이머 세트 조합, 5개의 프라이머 세트 조합 및 6개의 프라이머 세트의 조합이 가능하며, 상기 6개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면, 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 판별이 보다 정확하게 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
참빗살나무 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18688P인 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 참빗살나무 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 참빗살나무 신품종 코리아 골드의 육성과정 및 수집
본 품종은 1980년도에 서울 종로 5가에 위치한 종묘사에서 구입한 참빗살나무(Euonymus hamiltonianus)들을 한택식물원(용인 소재) 내에 자연 교잡이 가능하도록 서로 가까운 거리에 식재하였으며 1981년 개화 후 종자를 채종하여 바로 파종하여 자연선발을 위하여 대량번식하였으며 1983년 발아한 많은 유묘 중에 잎에 무늬가 들어 있는 1 개체를 선발하였다.
상기 선발된 1 개체를 1983년부터 1985년까지 지속적으로 육묘하면서 관찰하여본 결과, 잎의 무늬가 해마다 동일하게 발현되어 1985년부터 번식을 위하여 삽수를 잘라 삽목번식하였다. 1985년부터 지속적으로 삽목번식을 하였으나 발근율이 낮아 현재 33년생 1주와 30년생 3주, 12년생 4주 및 2년생 1주로 총 9주를 보유하고 있다.
본 품종의 잎 가장자리는 녹색이고 잎 가운데에 무늬가 들어있는 품종으로 봄에 새잎이 나올 때는 황색으로 무늬가 나오며 잎이 성장하면서 점점 백색으로 변하는 품종으로, 본 품종은 다른 참빗살나무 잎이 녹색인 것과 달리 잎 가운데 흰색 무늬가 들어 관상가치가 매우 높은 것으로 판단된다.
본 발명의 참빗살나무 신품종을 '코리아 골드'로 명명하고, 캘러스를 유기하여 2018년 06월 15일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18688P로 기탁하였다.
실시예 2. 참빗살나무 신품종 코리아 골드의 형태적 변이 분석
상기 실시예 1에서 선별된 신품종 코리아 골드와 대조품종인 참빗살나무의 형태적인 특성을 실험 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 1 및 도 2에 나타내었다.
실시예 3. 참빗살나무 신품종 코리아 골드의 판별을 위한 분자마커 개발
3-1. DNA 추출
신품종 코리아 골드(무늬참빗살나무)와 대조구인 참빗살나무의 잎은 한택식물원 내 식물체로부터 채취하였으며, 사용전까지 -70℃에서 보관하였다.
건조한 시료 0.2g을 막사 사발에 넣고 액체 질소를 사용하여 미세분말 상태가 되도록 분쇄하고 2㎖ 튜브에 옮겨담았다. 1.2㎖의 추출 버퍼(1.4M NaCl, 100mM Tris (pH 8.0), 20mM EDTA (pH 8.0), 2% CTAB, 0.2% β-mercaptoethanol)를 튜브에 첨가하고 5초간 볼텍싱하였다. 65℃ 항온기에서 30~60분 반응 시키고(10분에 한번씩 섞어줌), 13,500xg로 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 800㎕의 Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1)을 넣고 상온에서 20분간 인버팅(inverting) 한 후 13,500xg로 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 -20℃에 보관했던 차가운 isopropanol 800㎕를 넣고 5분간 인버팅하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠릿만 남긴다. 200~250㎕의 TE 버퍼를 넣어 펠릿을 녹이고, 2.5㎕의 RNase(10mg/㎖)를 넣어 30~60분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 3M NaAc 25㎕를 넣고 잘 섞어준 다음, 600㎕의 차가운(-20℃) 100% 에탄올을 튜브에 넣고 잘 섞어주고 -20℃에서 20분간 반응시킨다. 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 차가운(-20℃) 70% 에탄올 500㎕를 넣는다. 탭핑 또는 1~2초의 볼텍싱으로 펠릿을 튜브 벽에서 분리시키고, 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 다음, DNA 펠릿을 적어도 1시간 이상 건조시켰다. 건조된 DNA를 20~30㎕의 TE 버퍼에 완전히 녹인다.
3-2. 염기서열 분석 및 엽록체 게놈과 핵 내 45S rDNA 서열 조립
추출된 약 2㎍의 게놈 DNA는 랩지노믹스(www.labgenomics.co.kr)에서 제조 업체가 제공하는 paired-end 표준 프로토콜에 따라 500bp 삽입 크기(insert size)의 게놈 라이브러리로 제작되었다. 시퀀싱은 일루미나사의 MiSeq 플래폼을 이용하여 진행하였다.
차세대유전체분석기술(Next-generation sequencing, NGS)로 생산된 대량의 염기서열은 식물체 유전체 크기의 0.5~1X의 low coverage(엽록체 게놈 크기의 300~400X)에 해당하며, 엽록체 게놈과 45S rDNA 서열은 이 소량의 데이터를 이용하여 dnaLCW(de novo assembly of low-coverage whole genome shotgun sequencing) 방법(한국등록특허 제1447593호)을 통해 완성하였다. 본 분석의 경우 각 2.70Gbp에 해당하는 원시데이터를 이용하여 엽록체 게놈 및 45S rDNA를 완성하였다(표 2).
| 품종 | Raw data (Gbp) |
Chloroplast | nrDNA | ||
| Coverage(x) | Length(bp) | Coverage(x) | Length(bp) | ||
| 코리아 골드 | 2.7 | 707.52 | 157,360 | 232.88 | 5,824 |
| 참빗살나무 | 2.7 | 666.73 | 157,360 | 381.69 | 5,824 |
완성한 엽록체 유전체의 크기는 신품종 코리아 골드와 참빗살나무 모두 157,360bp 였다. 핵내 45S rDNA의 크기는 무늬참빗살나무와 참빗살나무 모두 5,824bp 였다.
완전한 엽록체 게놈을 조립한 후 DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/) 프로그램과 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통하여 엽록체 유전체의 유전자 부위를 결정하였다.
3-3. 염기서열 비교 분석을 통한 종내 단순서열반복 변이지역 발굴
신품종 코리아 골드 및 참빗살나무 간의 단순서열반복(simple sequence repeat) 변이지역은 NGS 방법을 이용하여 분석하였다. 원시데이터를 이용하여 dpsLCW(detection of polymorphic SSR using low coverage of WGS) 방법을 통해 분석하였으며, 두 종간 단순서열반복의 다형성을 보이는 165개 후보 리드를 발굴하였다. 그 중 7개의 단순서열반복 변이지역을 이용하여 식별 마커를 개발하였다(도 3).
단순서열반복 변이지역 분석을 통하여 개발된 구분마커들을 확인하기 위한 프라이머 세트는 Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 3).
| 마커명 | 코리아 골드 | 참빗살나무 | 산물크기* (bp) |
프라이머 서열(5'→3') (서열번호) |
|
| Eh_SSR04 | (AGA)4 | (AGA)10 | 262/280 | F | TCACTAACCTGCTTGCACCAA (1) |
| R | GAGAGCGATGAAGATGCGTG (2) | ||||
| Eh_SSR07 | (CT)19 | (CT)26 | 284/298 | F | TGTGTGGCCAAGACACAAGT (3) |
| R | ACTGGCAACTTTCCTAGACTGA (4) | ||||
| Eh_SSR08 | (GA)10 | (GA)16 | 261/273 | F | CCAGCAAAAGCTTAAGGAAACGA (5) |
| R | GCACATCTCCATTGCAAGTTCA (6) | ||||
| Eh_SSR010 | (CTG)3 | (CTG)7 | 220/232 | F | GCCATGGACTAATTGCTGCG (7) |
| R | TGGGACCAACAAGCCAACAT (8) | ||||
| Eh_SSR011 | (GA)16 | (GA)8 | 246/231+ | F | ACGTCACATCCACCATGCAA (9) |
| R | ATGGCATTCCGTCCGTGATT (10) | ||||
| Eh_SSR012 | (AT)6 | (AT)10 | 228/236 | F | GAATGCATGCCACTCCAACA (11) |
| R | ATAAGCAATTGGGGAACCTAGTA (12) | ||||
| Eh_SSR014 | (TGT)4 | (TGT)6 | 173/179 | F | ACATACACGCACCTTAGGTCA (13) |
| R | CAATCGCAGCAGCAACAGTATC (14) |
* 산물크기는 코리아 골드/참빗살나무의 순임.
+ Eh_SSR011의 경우, 참빗살나무에서 SSR 변이가 아닌 다른 지역에서 1bp InDel이 존재하여 산물크기가 15bp 차이로 확인됨.
3-4. 중합효소연쇄반응(
PCR
)
PCR 반응은 총 볼륨을 25㎕로 하였고, 20ng의 주형 DNA 2㎕, 각 10mM의 dNTPs 0.5㎕, 각 10 pmole의 프라이머 1㎕, 1U의 Taq 중합효소(Inclone, 한국) 0.25㎕, 10X Taq 반응완충용액 2.5㎕, 멸균수를 사용하였다. PCR은 94℃에서 5분간 초기 DNA 변성을 수행하였고, DNA 증폭을 위해 94℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 20초를 총 35회 수행하였다. 마지막 신장 과정은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 증폭산물은 12% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 확인하였다.
그 결과, 도 4에서와 같이 Eh_SSR08 마커를 제외한 6종의 분자마커를 통해 본 발명의 신품종 코리아 골드와 대조품종 참빗살무늬가 증폭산물의 크기로 구별되는 것으로 확인되었다.
<110> HANTAEK BOTANICAL GARDEN FOUNDATION
<120> Korea Gold, new cultivar of Euonymus hamiltonianus and molecular
marker for discriminating the same
<130> PN19014
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
tcactaacct gcttgcacca a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
gagagcgatg aagatgcgtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tgtgtggcca agacacaagt 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
actggcaact ttcctagact ga 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ccagcaaaag cttaaggaaa cga 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
gcacatctcc attgcaagtt ca 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gccatggact aattgctgcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
tgggaccaac aagccaacat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
acgtcacatc caccatgcaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
atggcattcc gtccgtgatt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
gaatgcatgc cactccaaca 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ataagcaatt ggggaaccta gta 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
acatacacgc accttaggtc a 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
caatcgcagc agcaacagta tc 22
Claims (5)
- 잎 가장자리는 녹색이고 잎 가운데에 무늬가 들어있는 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' (Euonymus hamiltonianus 'Korea Gold') 식물체로서,
상기 식물체로부터 유기된 캘러스가 기탁번호 KCTC18688P로 기탁된 것인 식물체. - 제1항의 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 부분체.
- 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 참빗살나무로부터 제1항의 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참빗살나무로부터 제1항의 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
- 참빗살나무 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 참빗살나무로부터 제1항의 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 식물체의 판별방법.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020190022820A KR102066594B1 (ko) | 2018-02-27 | 2019-02-27 | 참빗살나무 신품종 '코리아 골드' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20000007203A (ko) * | 1998-07-01 | 2000-02-07 | 박재홍 | 느릅나무추출물을 함유하는 건강보조음료조성물 |
-
2019
- 2019-02-27 KR KR1020190022820A patent/KR102066594B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103782810A (zh) | 2014-02-24 | 2014-05-14 | 王吉振 | 一种丝棉木新品种嫁接育苗方法 |
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