KR102066599B1 - 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 - Google Patents

일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것으로, 일월비비추 신품종 퍼스트 벨은 화수장이 길고 화경에 소엽이 붙어있으며 엽색이 진한 녹색을 띠는 품종으로, 다른 일월비비추보다 개화시기가 빠르고 화수장이 길어 관상가치가 매우 높은 품종이므로 정원이나 공원 등 조경수로 이용하거나 가로수로 이용하여도 좋은 품종으로 판단된다.

Description

일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 및 이를 판별하기 위한 분자마커{First Bell, new cultivar of Hosta capitata and molecular marker for discriminating the same}
본 발명은 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것이다.
일월비비추(Hosta capitata (Koidz.) Nakai)는 백합목 백합과에 속하는 여러해살이풀이다. 줄기의 높이는 대략 36~65 cm 정도이고 위로 곧게 뻗어 있다. 잎은 넓은 달걀모양이고 심장저(cordate) 또는 절저이며 길이는 10~16 cm, 폭은 5~7.7 cm정도로 넓은 난형이다. 잎의 끝부분은 물결과 같은 형태를 하고 있으며 잎자루는 길고 밑부분에 자주색 점이 있다. 꽃은 길이가 4.5~5 cm로 자주색이고, 옆을 향해 빽빽하게 달려있다. 수술은 6개로 꽃부리와 길이가 비슷하며, 수술대는 위로 굽고 털이 없으며 암술머리는 둥글다. 열매는 9~10월 경에 달리고 털이 없으며 길이는 2.5~2.7 cm이고, 종자는 흑색 날개가 있으며 편평하고 긴 타원형으로 길이는 약 0.9 cm 정도이다. 일월비비추는 우리나라 각처의 산(전남 백운산, 전북 덕유산, 경남 지리산, 경북 가야산), 일본 등에 분포되어 있으며, 특히 산속의 시냇가와 같은 습지에서 잘 자란다.
비비추에는 인삼의 주요 성분인 사포닌이 들어있어 피부궤양, 결핵, 진통, 소염, 항균, 허약체질, 치통, 위통, 림프절염 등을 치료하는데 사용된다고 알려져 있다. 또한, 한방에서는 종자 또는 전초를 자옥잠(紫玉簪)이라는 약재로 사용하며, 이는 염증을 가라앉히고 피를 멈추게하며 소변을 잘 나오게 하는 효능이 있다.
한편, 최근 분자 생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기 서열의 다형성을 탐색하고 이를 분자마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용 가능하게 되었다. 특히, 유전적 분자마커 기술 개발은 작물 육성에서 이용가치가 증가되고 있다.
한편, 한국공개특허 제2010-0104794호에는 잎의 바탕 색상이 녹색이고, 잎의 가장자리에는 황백색의 복륜무늬가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 '일월비비추의 신품종 선 앤드 문'이 개시되어 있으나, 본 발명의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 일월비비추 식물체의 자연교잡을 유도하고 채집한 종자를 파종하여 발아시킨 유묘를 번식시킨 결과, 일반 일월비비추에 비해 개화시기가 빠르고 화수 길이가 길며 화경에 소엽이 붙어있으면서 엽색이 진한 녹색을 띠는 식물체를 선발할 수 있었으며, 상기 식물체를 계통 육성하여 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'으로 명명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18761P이며, 개화 시기가 7~10일 빠르고, 화수의 길이가 14~16cm로 길고, 포의 너비가 0.4~0.8cm로 좁으며, 포의 색이 진한 녹색인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' (Hosta capitata 'First Bell') 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18761P인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 기탁번호가 KCTC18761P인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'은 일반 일월비비추 품종에 비해 화수장이 2~3배 정도 더 긴 특징을 가지고 있어 관상가치가 매우 높은 품종으로 정원이나 공원 등 조경수로 이용하거나 가로수로 이용하여도 좋은 품종으로 판단된다.
도 1은 본 발명의 출원품종과 대조품종(일월비비추)의 화수(꽃이삭)의 길이(A), 화경(꽃자루)에 소엽 부착 여부(B) 및 포의 형태(C)를 비교한 사진이다.
도 2는 본 발명의 출원품종과 대조품종의 엽색(A) 및 엽 형태(B)를 비교한 사진이다.
도 3은 본 발명의 출원품종과 대조품종의 개화초기, 개화말기 및 결실기에서 꽃의 모습을 비교한 것으로, A는 개화초기(2016년 6월 10일), B는 개화말기(2016년 6월 21일), C는 결실기(2016년 6월 28일)이다.
도 4는 본 발명의 출원품종과 대조품종의 엽록체 게놈 염기서열을 분석하여 InDel(A) 및 SNP(B) 다형성이 나타난 부위를 나타낸 모식도이다.
도 5는 분자마커를 이용한 일월비비추와 퍼스트 벨의 PCR 결과로, A는 InDel(Insert/Deletion) 분자마커, B는 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 분자마커를 의미한다. 각 마커별 레인 순서는 Hc_i_01 및 Hc_d_01과 같다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18761P이며, 일반 일월비비추에 비해 개화 시기가 7~10일 빠르고, 화수의 길이가 14~16cm로 길고, 포의 너비가 0.4~0.8cm로 좁으며, 포의 색이 진한 녹색인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' (Hosta capitata 'First Bell') 식물체를 제공한다.
본 발명의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'은 표 2, 표 3 및 도 1에 기재된 것과 같은 형태학적 특징을 가지며, 일반 일월비비추 식물체와 비교하여 화수의 길이(화수장)가 약 2~3배 길고 화경에 소엽이 붙어있으며 엽색이 진한 녹색을 띠는 특징이 있는 식물체이다. 또한, 표 1 및 도 3에 기재된 것과 같이 일반 일월비비추에 비해 개화시기가 7~10일 빠른 특징이 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'은 식물원 내에 식재되어 있는 일월비비추 개체 중에서 자연교잡을 유도한 후, 일반 일월비비추에 비해 개화시기가 빠르고 화수의 길이가 긴 형질의 개체를 선발하여 상기 개체를 계통 육성하였다. 본 발명자는 일반 일월비비추에 비해 개화시기가 7~10일 정도 빠르고, 화수의 길이가 14~16cm로 길고, 포의 너비가 0.4~0.8cm로 좁으며, 포의 색이 진한 녹색인 특성을 가지는 일월비비추 품종을 '퍼스트 벨'로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2019년 1월 24일자에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC18761P).
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCTC18761P인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체의 '부분체'는 이에 한정하지 않으나, 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'의 화분, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 자손 식물체는 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'의 무성생식을 통해 유래된 자손 식물체 또는 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'을 모본으로 사용하여 다른 품종과 교배를 통해 유래된 자손 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18761P인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이서 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 InDel(Insert/Deletion) 변이지역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이고, 서열번호 9 및 10; 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트는 SNP(single nucleotide polymorphism)에 기반한 dCAPS 마커용 프라이머 세트이다(표 4).
본 명세서에서, 용어 'dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)' 마커는 SNP 중 제한효소 자리에 위치한 SNP를 일컫는다. 본 발명의 dCAPS 마커는 엽록체 게놈 염기서열에 존재하는 일월비비추와 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 간의 특이적인 SNP 중 제한효소(PstI) 자리에 위치한 SNP를 선정하여 후보 dCAPS 마커로 개발할 수 있다.
상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 및 서열번호 11 및 12 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11로 나타낸 염기서열은 정방향 프라이머를 나타내며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12로 나타낸 염기서열은 역방향 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 따른 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별용 프라이머 세트는 상기 6개의 프라이머 세트 중, 1개의 프라이머 세트, 2개의 프라이머 세트 조합, 3개의 프라이머 세트 조합, 4개의 프라이머 세트 조합, 5개의 프라이머 세트 조합 및 6개의 프라이머 세트의 조합이 가능하며, 상기 6개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면, 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별이 보다 정확하게 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
일월비비추 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18761P인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'의 판별 방법은 구체적으로는, 일월비비추 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'의 또 다른 판별 방법은 구체적으로는, 일월비비추 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 판별 방법에 있어서, 상기 제한효소는 PstI 제한효소일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 산물 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 산물에는 PstI 제한효소를 처리하여 증폭 산물을 절단할 수 있다.
본 발명의 방법은 일월비비추 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 일월비비추 신품종 퍼스트 벨의 육성과정 및 수집
본 품종은 2012년도에 한택식물원(용인 소재) 내에 일월비비추들을 자연교잡이 가능하도록 서로 가까운 거리에 식재하였고, 자연선발을 위해 대량번식시켰으며, 번식된 개체 중에서 개화시기가 빠르고 화수장이 긴 개체를 선발하여 육종한 개체이다.
2012년 6월 17일 개화한 개체(HL-2012)를 사진 촬영 및 특성조사한 후 같은 해 10월 6일에 종자를 채종하여 무가온 온실(Passive Solar Green House)내 파종상자에 파종하였다. 2013년 봄에 파종한 개체가 발아하여 어린 묘를 계속 비배관리(fertilization and management) 및 병해충 방제를 하며 온실내에서 육묘하였고, 2012년에 발견된 HL-2012 개체에서 2013년 10월 13일에 채종하여 무가온 온실내에 파종하였다. 2014년에는 HL-2012 개체의 개화시기가 빨라져 9월 10일에 채종하여 바로 무가온 온실에 파종하였으며, 2013년에 발아하여 온실내에서 육묘되던 개체를 유묘포지에 이식하여 비배관리 및 병해충 방제를 해주며 육묘하였다. 2015년도에도 HL-2012 개체에서 10월 6일경 채종하여 무가온 온실에 파종 번식시켰으며, 2015년에는 상기 2012년에 파종한 개체 중 일부가 개화하여 특성을 분석한 결과, HL-2012 개체와 주요 특성이 일치하여 순계분리가 완료되었음을 확인하였으며, 개화 2년차까지 개화 특성을 조사하였다.
2016년에도 HL-2012 개체에서 채종하여 파종 번식시켰으며, 2012년에 파종한 개체가 특성표를 작성할 수 있을 만큼 개화 개체수가 확보되어 개화 후의 특성을 검정한 결과, 주요 특성이 HL-2012 개체와 일치하여 순계분리하는 것을 확인하였다.
본 품종의 개화시기는 다른 일월비비추보다 개화시기가 7~10일 정도 빠르고(표 1), 화수의 길이가 14.7 cm인 품종(도 1A)으로, 본 품종은 다른 일월비비추의 화수장이 6.2 cm인 것에 비해 2~3배 정도 더 긴 품종으로 관상가치가 매우 높아 정원이나 화단, 공원 등 조경수, 절화소재로 이용하거나 가로수로 이용하여도 좋은 품종으로 판단된다.
Figure 112019020355683-pat00001
본 품종은 다른 일월비비추와 달리 화경에 소엽이 부착되어 있고(도 1B), 포가 난형이며(도 1C), 엽색은 진한 초록색이었다(도 2A). 또한, 본 품종의 개화시작일을 기준으로 개화시작일, 개화말기 및 결실기에 본 품종과 다른 일월비비추의 꽃을 비교한 결과, 본 품종의 꽃은 다른 일월비비추에 비해 개화시기가 빠른 것을 확인하였다(도 3).
본 발명의 일월비비추 신품종을 '퍼스트 벨'로 명명하고, 캘러스를 유기하여 2019년 1월 24일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18761P로 기탁하였다.
실시예 2. 일월비비추 신품종 퍼스트 벨의 형태적 변이 분석
상기 실시예 1에서 선별된 신품종 퍼스트 벨과 대조품종인 일월비비추의 형태적인 특성을 실험 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 2, 표 3, 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
Figure 112019020355683-pat00002
Figure 112019020355683-pat00003
실시예 3. 일월비비추 신품종 퍼스트 벨의 판별을 위한 분자마커 개발
3-1. DNA 추출
신품종 퍼스트 벨과 일월비비추의 잎은 한택식물원 내 식물체로부터 채취하였으며, 사용전까지 -70℃에서 보관하였다.
건조한 시료 0.2g을 막사 사발에 넣고 액체 질소를 사용하여 미세분말 상태가 되도록 분쇄하고 2㎖ 튜브에 옮겨 담았다. 1.2㎖의 추출버퍼(1.4M NaCl, 100mM Tris(pH 8.0), 20mM EDTA(pH 8.0), 2% CTAB(hexadecyltrimethyl ammonium bromide), 0.2% β-mercaptoethanol)를 튜브에 첨가하고 5초간 볼텍싱하였다. 65℃ 항온기에서 30~60분 반응시키고(10분에 한번씩 섞어줌), 13,500xg로 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 800㎕의 Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol(25:24:1)을 넣고 상온에서 20분간 인버팅(inverting) 한 후 13,500xg로 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 -20℃에 보관했던 아이소프로판올(isopropanol) 800㎕를 넣고 5분간 인버팅하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠렛만 남긴다. 200~250㎕의 TE 버퍼를 넣어 펠렛을 녹이고, 2.5㎕ RNase(10mg/㎖)를 넣어 30~60분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 3M NaOAc 25㎕를 넣고 잘 섞어준 다음, 600㎕의 차가운(-20℃) 100% 에탄올을 튜브에 넣고 잘 섞은 후 -20℃에서 20분간 반응시킨다. 13,500xg로 10분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 후 차가운(-20℃) 70% 에탄올 500㎕를 넣는다. 탭핑 또는 1~2초의 볼텍싱으로 펠렛을 튜브 벽에서 분리시고, 13,500xg로 10분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 다음, DNA 펠렛을 적어도 1시간 이상 건조시켰다. 건조된 DNA를 20~30㎕의 TE 버퍼에 완전히 녹인다.
3-2. 염기서열 분석 및 엽록체 게놈 서열 조립
추출된 약 2㎍의 게놈 DNA는 랩지노믹스(www.labgenomics.co.kr)에서 제조 업체가 제공하는 paired-end 표준 프로토콜에 따라 500bp 삽입 크기(insert size)의 게놈 라이브러리로 제작되었다. 시퀀싱은 일루미나사의 MiSeq 플래폼을 이용하여 진행하였다.
차세대유전체분석기술(Next-generation sequencing, NGS)로 생산된 대량의 염기서열은 식물체 유전체 크기의 0.5~1X의 low coverage(엽록체 게놈 크기의 300~400X)에 해당하며, 엽록체 게놈은 이 소량의 데이터를 이용하여 dnaLCW(de novo assembly of low-coverage whole genome shotgun sequencing) 방법(한국등록특허 제1447593호)을 통해 완성하였다. 본 분석의 경우 3.4~8.1Gbp에 해당하는 원시데이터를 이용하여 엽록체 게놈을 완성하였다.
완성한 엽록체 유전체의 크기는 신품종 퍼스트 벨이 156,671bp, 일월비비추가 156,389bp였다.
완전한 엽록체 게놈을 조립한 후 DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/) 프로그램과 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통하여 엽록체 유전체의 유전자 부위를 결정하였다.
3-3. 염기서열 비교 분석을 통한 종내 InDel 및 SNP 변이지역 발굴
완성된 신품종 퍼스트 벨 및 일월비비추의 엽록체 게놈의 염기서열을 MAFT(http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) 프로그램을 통하여 비교 분석하였다. 엽록체 게놈 서열의 종간 변이지역은 64개의 삽입/결실(insertion/deletion, InDel) 및 135개의 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)이 확인되었으며, 이 중 InDel 다형이 나타난 4개 부위(도 4A)와 SNP 다형성이 나타난 2개 부위(도 4B)를 이용하여 식별 마커를 개발하였다.
InDel 및 SNP 변이지역 분석을 통하여 개발된 식별 마커들을 확인하기 위한 프라이머 세트는 Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 4). SNP 변이지역을 기반으로 한 2개의 마커는 dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequence) 마커로 개발하였으며, PstI 제한효소로 PCR 산물을 절단하였다(도 4). 하기 표 4의 dCAPS 프라이머 서열에는 PstI 제한효소의 서열이 일부 나타나있지 않으나 각 마커의 PCR 산물에는 제한효소가 포함되어 있다.
신품종 퍼스트 벨과 일월비비추 판별용 분자마커 및 프라이머 정보
마커명 종류 위치 프라이머 서열(5'→3') (서열번호) 산물크기(bp)*
Hci_i_01 InDel rps16 ~ trnQ
(UUG)		 F: CGCACGTTGCTTTCTACCAC (1)
R: ACTTCTGGCCTTTTCGAGTCA(2)		 468/190
Hci_i_02 InDel trnF(GAA)
-ndhJ 		F: AGAACAAAATGAGATTATGCTCCC (3)
R: CGGACCCTTGAAAGTAGCGT(4)		 288/280
Hci_i_03 InDel cssA F: AATGCCGTCGCCTATTGTCA (5)
R: CCAATTCCCAATTATCTTGGTGGG (6)		 185/206
Hci_i_04 InDel ycf1 F: TCGTAAGTTGTTTCTACATCGCT (7)
R: TGTTGGTTGGTTAATTGGTCACG (8)		 255/276
Hc_d_01 dCAPS psbA F: CATTTGTAGATGGAACTTCAACTGC (9)
R: ATCGTAGCTGCTCATGGTTATT (10)		 316/291
Hc_d_02 dCAPS rpoC1
F: TACCTTTATCTTTGGAAGCTCCTGC (11)
R: TGCAAAAATACGGTTCTTTCTT (12)		 231/257
(* 산물크기 순서: 퍼스트 벨/일월비비추)
3-4. 중합효소연쇄반응( PCR )
PCR 반응은 총 볼륨을 25㎕로 하였고, 20ng의 주형 DNA 2㎕, 각 10mM의 dNTPs 0.5㎕, 각 10pmole의 프라이머 1㎕, 1U의 Taq 중합효소(Inclone, 한국) 0.25㎕, 10X Taq 반응완충용액 2.5㎕, 멸균수를 사용하였다. PCR은 94℃에서 5분간 초기 DNA 변성을 수행하였고, DNA 증폭을 위해 94℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 20초를 총 35회 수행하였다. 마지막 신장 과정은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 증폭산물은 2.5% 아가로스 겔 전기영동에서 확인하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 InDel 및 SNP 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 총 5개의 분자마커를 통해 본 발명의 일월비비추 신품종 퍼스트 벨과 일월비비추가 판별되는 것으로 확인되었다.
한국생명공학연구원 KCTC18761P 20190124
<110> HANTAEK BOTANICAL GARDEN FOUNDATION <120> First Bell, new cultivar of Hosta capitata and molecular marker for discriminating the same <130> PN19058 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgcacgttgc tttctaccac 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acttctggcc ttttcgagtc a 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agaacaaaat gagattatgc tccc 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggacccttg aaagtagcgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aatgccgtcg cctattgtca 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccaattccca attatcttgg tggg 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcgtaagttg tttctacatc gct 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgttggttgg ttaattggtc acg 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catttgtaga tggaacttca actgc 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atcgtagctg ctcatggtta tt 22 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tacctttatc tttggaagct cctgc 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgcaaaaata cggttctttc tt 22

Claims (6)

  1. 개화 시기가 대조품종인 일월비비추에 비해 7~10일 빠르고, 화수의 길이가 14~16cm이고, 포의 너비가 0.4~0.8cm이며, 포의 색이 진한 녹색인 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨'(Hosta capitata 'First Bell') 식물체로서,
    상기 식물체로부터 유기된 캘러스가 기탁번호 KCTC18761P로 기탁된 것인 식물체.
  2. 제1항의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 부분체.
  3. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 일월비비추로부터 제1항의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 일월비비추로부터 제1항의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  5. 일월비비추 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 일월비비추로부터 제1항의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별방법.
  6. 일월비비추 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
    상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는, 일월비비추로부터 제1항의 일월비비추 신품종 '퍼스트 벨' 식물체의 판별방법.
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KR101231158B1 (ko) * 2010-07-26 2013-02-07 한국과학기술연구원 일월비비추 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항진균용 조성물

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