KR100363723B1 - 잔디 신품종 베네스트 원 및 동래고려지 특이 ｓｔｓ 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잔디 신품종 베네스트 원 (Benest 1) 및 동래고려지 특이 STS 마커에 관한 것으로, 내병성, 내한성 등이 뛰어난 안양중지와 질감이 우수한 동래고려지를 교배하여 특성이 우수한 잔디 신품종 베네스트 원을 제조하고, 화분친인 동래고려지의 교배여부, 교배품종의 판별 및 교배계통의 분석을 위해 동래고려지 특이 오페론 프라이머 (Operon Primer)를 선발한 후 그를 이용한 RAPD 검정을 실시하여 동래고려지 특이 DNA 표지를 선발하고 그 염기서열을 분석한 후 그로부터 STS 마커를 개발하여 안양중지와 동래고려지 교배개체 및 잔디품종들을 검정한 결과, 특성이 매우 우수한 잔디 신품종 베네스트 원 및 안양잔디와 동래고려지 잔디의 교배계통을 품종등록할 수 있는 근거가 되는 동래고려지 특이 STS 마커를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

잔디 신품종 베네스트 원 및 동래고려지 특이 ＳＴＳ 마커 {Novel grass species Benest 1 and Dongrae koryogi specific STS marker}

본 발명은 잔디 신품종 베네스트 원 (Benest 1) 및 동래고려지 교배품종의 확인을 위한 동래고려지 특이 STS 마커에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 내병성, 내한성 등이 뛰어난 안양중지와 질감이 우수한 동래고려지를 교배하여 각각의 장점을 획득한 잔디 신품종 베네스트 원을 제조하고, DNA 분석법을 이용해서 화분친인 동래고려지에 선택적으로 증폭하는 오페론 프라이머를 선발한 후 그를 이용하여 동래고려지 특이 DNA 절편을 획득하고 염기서열을 분석한 다음 상기 프라이머를 STS 마커로 전환하여 제조한 동래고려지 교배 여부 및 교배계통의 분석에 이용할 수 있는 동래고려지 특이 STS 마커에 관한 것이다.

한국잔디는 다년생 초본류로 화본과에 속하며, 포복경 및 지하경을 가지고 번식하는데 지역에 따라 형태나 특성에 있어 많은 변이를 나타내고 있다. 지금까지의 연구에 의하면 한국에는 들잔디 (Z. japonica), 금잔디 (Z. matrella), 비로드 잔디 (Z. tenufolia), 갯잔디 (Z. sinica), 왕잔디 (Z. macrostachya) 등 5-6종의 잔디가 분포되어 있는 것으로 보고되고 있다. 한국잔디는 난지형잔디로서 한국을 포함한 극동아시아에 널리 자생하고 있으며 정원, 공원, 경기장, 골프장, 도로비탈면, 간척지, 공항 등 거의 모든 장소에서 이용되고 있다. 특히, 한국잔디는 우리나라 기후에 있어 가장 적합한 잔디이며, 다른 한지형 양잔디 및 다른 난지형 잔디보다도 환경적응성이 뛰어나다. 특히 내건성, 내답압성, 내한성, 내서성, 내염성 등이 강한 것으로 알려져 있다. 그러나, 잔디 조성이 늦고, 녹색기간이 짧은 등의 단점을 가지고 있어 그에 따른 우수한 품종에 대한 육종이 요구되어지고 있다.

우리나라의 경우 1965년부터 서울대학교의 유달영, 염도의 등에 의해서 한국에 자생하고 있는 잔디가 수집되었고, 그 중 63개의 우수 개체가 선발되었다. 그 후, 염도의, 주영규, 한인송 등이 1982년 USDA (United States Departmenet of Agriculture)의 germplasm 수집활동에 참여하여 생육이 빠르고 내염성이 있는 세엽형태의 Z. koreana를 보고하였다 (Yeam et al., 1986; Kim, 1989). 이후 1985년부터 1994년까지 한국잔디 (zoysia grass) 육종연구가 거의 중단되어 더 이상 진전이 없었다. 1995년부터 건국대학교, 단국대학교, 안양 잔디환경연구소가 서울대학교에서 보유하고 있는 한국잔디를 분양받아서 연구를 수행하고 있다. 그러나, 우리나라는 한국잔디 (zoysia grass)의 원산지임에도 불구하고 정부지원 및 육종연구의 부족으로 미국, 일본에 비해서 한국잔디의 육종을 통한 신품종육성 및 활용이 크게 뒤지고 있다.

1992년 생물다양성 협약을 계기로 세계 각국이 유전자원의 중요성을 보다 심각하게 인식하기 시작하였고, 우수한 유전자원은 물론, 그의 성능이나 특성이 미처 밝혀지지 않은 유전자원도 나라밖의 반출이나 분양이 갈수록 어려워지고 있다. 12월 생물다양성 국제 협약이 발효된 이후 세계 각국은 앞다투어 자국의 종자를 챙기기에 바빴다. 생물다양성 협약이 각국의 고유종자에 대한 소유권을 인정해주기 때문이었다.

상기 잔디 중 우리나라의 골프장, 경기장, 공원 등에 이용되는 잔디품종은 대부분 들잔디이고 남부지방에서는 금잔디도 일부 사용되고 있으나 체계적으로 선발되어 육종된 품종은 거의 개발되지 않은 상태이다. 미국과 일본 등의 선진국들이 발 빠르게 우리 나라와 동남아시아의 우수한 특성을 보이는 잔디를 수집하고 이를 이용하여 잔디육종을 수행하고 우수한 품종을 세계각국에 판매하여 국제시장에서 우위를 점유하고 있는 데 반하여, 우리나라의 경우는 현재 시장에서 유통되고 있는 한국잔디의 대부분이 임의로 선발하여 증식시킨 것이기 때문에 품종의 구분도 명확하지 않고 여러 종류의 잔디가 무분별하게 섞여 있어 균일성도 떨어진다. 또한, 최근에는 외국에서 수입된 잔디가 싼 가격에 유통되고 있어서 한국 잔디 시장경쟁력을 저하시키고 있다. 따라서, 우수한 유전형질과 생육특성을 보이는 한국잔디를 수집하고 이를 이용하여 우수한 특성을 보이는 잔디를 육성하는 것이 시급히 요구되고 있다.

잔디육종에 있어서는 지금까지 선발육종이 주된 육종방법이었으나, 본 발명자들은 특정형질을 지니는 잔디를 육성하기 위해서 교배육종방법을 수행하였다.안양중지는 이병철 삼성 선대 회장이 수집한 잔디로, 그 특성이 우수하여 안양베네스트 골프 클럽을 위시한 여러 골프장의 페어웨이 (fairway), 티 (tee) 식재와 삼성 그룹사의 조경용으로 널리 이용되어 왔으며 특 98-22500으로 특허된 신품종이다. 안양중지는 갯잔디 (Z. sinica)의 특성을 갖는 중지류로 엽폭이 3~4mm로 들잔디 (Z. japonica)와 갯잔디 (Z. matrella)의 중간적인 특성을 보이고 생육습성은 creeping type이라기보다는 오히려 high-growing type이다. 동래고려지는 동래베네스트 골프클럽의 페어웨이를 이루고 있는 금잔디 (Z. matrella)계의 잔디로 엽폭이 2~3mm로 좁고 질감이 뛰어난 잔디이나 중부지역에서 월동이 불가능한 단점을 가지고 있다.

본 발명은 내병성, 내한성 등이 뛰어난 안양중지와 질감이 우수한 동래고려지를 교배하여 각각의 장점을 갖춘 잔디 신품종을 육성하고자 수행되었다. 내병성, 내한성 등이 뛰어난 안양중지와 질감이 우수한 동래고려지를 교배하여 각각의 장점을 획득한 교배개체를 선발하였고, DNA 분석법을 이용해서 동래고려지에 선택적으로 증폭하는 오페론 프라이머 (Operon Primer)를 선발하였고, 이를 STS 마커로 전환해서 동래고려지의 교배여부를 검정하는 표지로 개발하였다. 개발된 STS 마커를 이용해서 동래고려지의 교배여부를 판별할 수 있을 뿐 아니라, 이 개발된 STS 마커는 판매되고 있는 기존의 동래고려지 잔디품종을 구별할 수 있는 마커로서의 기능이 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 내병성, 내한성 등이 뛰어난 안양중지와 질감이 우수한 동래고려지를 교배한 결과 생산된 품종 특성이 우수한 잔디 신품종 베네스트 원을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 동래고려지에 선택적으로 증폭하는 오페론 프라이머를 선발하고 이를 이용하여 획득한 동래고려지 특이 DNA 절편 및 그 염기서열을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 동래고려지 교배품종의 선별을 위하여 상기 오페론 프라이머를 전환하여 제조한 동래고려지 특이 STS 마커를 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 안양중지의 암술에 동래고려지의 화분을 수분하여 교배종을 획득한 후 고려지의 교배 여부를 판단하기 위한 고려지 특이 DNA 절편을 획득하기 위하여 동래고려지와 안양중지의 DNA를 OPD12 프라이머와 반응시켜 RAPD 분석함으로써 고려지 특이 DNA 절편을 획득하고 그 염기서열을 분석한 후 이 염기서열을 기초로 상기 OPD12 프라이머에 12개의 염기를 더하여 STS 마커를 제조한 후 이를 이용하여 동래고려지 교배품종 및 잔디품종을 확인함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 동래고려지 (Donrae koryogi)를 위한 특이적 RAPD 마커의 동정 결과를 보여주는 전기영동 결과이다. A, B 및 C는 각각 오페론 프라이머 C06, C16, D12에 대한 RAPD 밴드를 보여준다.

도 2는 F₁식물체로 추정되는 식물체를 OPD12를 사용하여 교배검정한 결과를 나타낸다.

도 3은EcoRⅠ으로 절단한 재조합 클론 추정체의 전기영동 결과를 나타낸다.

도 4는 OPD12 프라이머에 의하여 증폭된 동래고려지 특이 DNA 절편의 염기서열 분석 결과이다. 굵은 문자의 밑줄 부위는 RAPD 프라이머 염기서열을 나타낸다.

도 5는 동래고려지의 선별을 위한 STS (Sequence Tagged Site) 마커의 전기영동 결과를 나타낸다.

도 6은 STS 마커를 이용한 교배종의 PCR 결과를 나타낸다.

도 7은 본 발명 안양중지와 동래고려지 교배종 베네스트 원, 안양중지 및 기타 교배종의 길이를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명 안양중지와 동래고려지 교배종 베네스트 원, 안양중지, 동래고려지 및 기타 교배종의 엽폭을 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명 안양중지와 동래고려지 교배종 및 기타 교배종의 포복경의 길이를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 10은 본 발명 잔디 신품종 베네스트 원을 화분에서 생장시킨 형태적 특성을 나타낸 사진도이다.

본 발명은 화분친인 동래고려지의 화분을 종자친인 안양중지의 암술에 수분시켜 교배종을 생산하는 단계; 교배 후 결실된 종자를 채종한 다음 파종하여 발아시키고 온실에서 재배하여 교배종으로 추정되는 46개체의 식물체를 획득하는 단계; 안양중지와 동래고려지 잔디간의 RAPD 분석을 통해서 서로 다른 다형성을 보이는특이표지를 선발하기 위해 안양중지와 동래고려지의 DNA를 추출한 후 OPC06 등 총 40여 개의 오페론 프라이머를 사용하여 RAPD 분석을 실시하는 단계; 총 40여 개의 프라이머 중에서 동래고려지 특이 밴드를 증폭시키는 OPC06, OPC16, OPD12 프라이머를 밝히고 상기 추정 교배종 46개체의 잔디와 반응시켜 OPD12가 900bp의 동래고려지 특이 밴드를 증폭시킴을 확인하는 단계; OPD12 프라이머를 상기 추정 교배종 46개체와 반응시켜 상기 동래고려지 특이 밴드가 증폭되는 것으로 확인된 7개의 교배종을 획득하는 단계; 상기 고려지 특이 밴드가 고려지 잔디에서만 특이하게 증폭되는지를 확인하는 단계; 상기 고려지 특이 DNA 절편 D12-900을 벡터에 삽입시키고 이를E.coliDH10B에 도입하여 형질전환시킨 후 재조합체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 이를EcoRⅠ으로 절단하여 상기 고려지 특이 DNA 절편이 클로닝된 재조합 클론을 확보한 후 그 염기서열을 분석하는 단계; 상기 염기서열 분석 후 RAPD 분석에 사용한 random primer 염기서열에 12개의 염기를 더하여 긴 프라이머를 정방향 및 역방향으로 합성하여 STS 마커 (Sequence tagged site marker)를 제조하는 단계; 상기 STS 마커를 사용하여 동래고려지 잔디 및 야지 등 7품종 잔디의 RAPD 분석을 실시함으로써 상기 본 발명 STS 마커가 교배 계통의 분석 및 품종확인을 위한 마커로서 이용가능함을 확인하는 단계; 상기 안양중지와 동래고려지 교배종의 엽폭, 엽장, 포복경 길이 및 기타 특징 등의 생육을 조사하여 서로 다른 특성을 보이는 7개의 품종을 확인하고 그 중 엽색이 짙고 밀도가 높으며 질감이 부드러워 우수한 품종을 본 발명 잔디 신품종 베네스트 원 (Benest 1)으로 명명하는 단계; 지상 포복경이나 지하경이 포함된 상기 교배종 잔디 식물체를 식재 또는 산파하여 무성번식하거나 분열이 왕성한 경정, 마디부분, 미숙화서, 미숙배, 뿌리의 선단부 등을 채취하여 MS 배지에 치상한 후 캘러스 또는 multishoot을 유기하고 재분화하여 본 발명 잔디 신품종 베네스트 원의 무성번식을 확인하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들에만 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 안양중지와 동래고려지의 교배를 통한 잔디 신품종 획득

안양중지를 종자친으로, 동래고려지를 화분친으로 교배하여 잔디 신품종을 획득하였다.

제1단계. 교배용 잔디의 준비

안양중지와 동래고려지를 직경 11.5cm의 hole cutter로 채취한 후 포트 (내경 16.5cm)에 식재하였다. 안양중지는 98년 2월말에 식재하고, 동래고려지는 97년 11월에 식재하여 5℃로 유지한 온실에서 월동시켰다. 두 잔디품종의 개화시기를 일치시키기 위하여 개화시기가 안양중지보다 빠른 동래고려지를 3월부터 4월에 걸쳐 온실에 입실시켰다.

제2단계. 안양중지와 동래고려지의 교배

종자친은 안양중지로, 화분친은 동래고려지로 하였다. 교배는 1998년 4월 10일부터 5월 10일까지 한달 동안 이른 아침부터 저녁까지 동래고려지의 화분을 채취하여 안양중지의 암술에 수분시켰다. 수분 후 암술이 노랗게 갈변한 후 종자친인안양중지의 수술이 올라오면 수시로 이를 제거하여 안양중지의 자화수분을 최대한 막아주었다.

일반적으로 동래고려지의 추대시기가 안양중지의 그것보다 빠르다고 알려져 있어 온실에서 월동한 동래고려지 중 일부를 3월초에 온실 밖으로 꺼내어 순차적으로 입실시켜 개화기를 조절하였다. 온실 안으로 옮긴 동래고려지는 3월 10일부터 추대가 시작되었다. 온실 밖으로 꺼낸 동래고려지는 3월 23일과 3월 30일 두 차례에 걸쳐 온실로 입실시켰는데 온실 밖에 있던 기간동안 약 일주일 정도 한파가 와서 추대되는 시기가 예상보다 훨씬 늦어졌고 추대된 꽃대의 수도 상당히 감소하였다. 그러나, 온실에서 생육한 동래고려지의 개화기간이 한달 이상 계속되어 이로부터 화분을 받아 교배가 가능하였다. 안양중지는 4월 5일경부터 추대가 시작되었고 그에 따라 4월 10일부터 교배가 가능하였다.

제3단계. 교배 후대 채종

교배 후 두 달 뒤인 6월 4일부터 6월 17일까지 결실된 종자를 채취하였다.

총 57개의 꽃대로부터 802개의 종자를 채종하였다. 802개의 종자 중 287개의 종자는 쭉정이였고 515개의 종자만 충실 종자로 확인되었다 (표 1).

안양중지와 동래교려지의 교배를 통한 교배품종 종자의 채종

총 꽃대수	꽃대당 평균종자수	총 종자수	쭉정이	충실종자
57	19	802	287	515

제4단계. 종자처리 및 파종

채종된 상기 종자를 거즈로 싸서 25% KOH 용액에 Tween-20을 한 방울 떨어뜨려 30분간 처리하였다. KOH 처리 후 흐르는 물에 종자를 담궈 24시간 수세한 다음 페트리 디쉬 (petri dish)에 파종하여 30℃에서 3일간 발아시킨 후 토양에 이식하여 온실에서 생육시켰다.

이 교배종자들의 발아율은 약 60%였다. 유묘기에는 온실에서 교배식물을 재배하였는데 온실에서 유묘를 재배하는 동안 장마가 지속되어 상당수의 유묘가 녹병, 잎마름병에 걸려 고사하였고, 이들 중 70 개체만이 살아남아 이들을 실험포장에 식재하였다. 살아남은 70 개체를 포장에 식재한 후 그 중 겨울을 지내고 살아남은 46개체를 이용하여 하기 DNA 분석을 수행하였다.

실시예 2 : 동래고려지 특이 RAPD 프라이머 표지의 선발

상기 실시예 1의 안양중지와 동래고려지 교배체로 추정되는 46개체의 교배여부를 판단하기 위해 고려지 특이 RAPD 프라이머를 선발하였다.

화분친으로 고려지 잔디를 사용했으므로 교배가 이루어진 경우에는 고려지 특이적 표지를 가지고 있다. 따라서, 교배여부를 판단하기 위해서는 고려지에서 특이적으로 증폭되는 표지를 선발하여야 한다. 안양중지와 고려지잔디 간의 RAPD 분석을 통해서 서로 다른 다형성을 보이는 특이표지를 선발하였다.

제1단계. 안양중지와 동래고려지의 DNA 추출, PCR 증폭, 전기영동 및 RAPD 분석에 의한 동래고려지 특이 표지의 선발

동래 고려지 특이 표지의 선발을 위해 OPC06 등 총 40여 개의 오페론 프라이머 (Operon Primer)를 사용하여 RAPD 분석을 실시하였다.

안양중지와 동래고려지의 DNA를 추출하기 위해 상기 실험포장에 생육중인 안양중지와 동래고려지 잔디 잎 2g을 액체 질소를 이용하여 분쇄한 후 이 중 150㎕를 1.5㎖의 microtube로 옮겼다. 여기에 DNA 추출 완충액 (extraction buffer; 0.35M 소르비톨, 0.1M Tris-base, 5mM EDTA: pH 7.5) : 핵 용해 완충액 (nuclei lysis buffer; 0.2M Tris-base, 0.05M EDTA, 2M NaCl, 2% CTAB) : 5% sarkosyl을 각각 5 : 5 : 2로 섞은 추출용액을 60℃로 데워 750㎕을 넣고 잘 섞어준 후 60℃에서 30분간 가열하였다. 30분 후 클로로포름 (chloroform)을 500㎕ 넣고 15분간 잘 섞어 준 다음, 이를 10,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상징액을 취하여 동량의 이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)을 넣고 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 회수한 다음 70% 에탄올 (ethanol)로 2회 세척한 후 에탄올 (ethanol)을 날려버리고 남아 있는 DNA 펠렛 (pellet)에 TE 완충액 (buffer)을 넣어 DNA를 녹였다. DNA의 최종 농도는 Fluorometer를 이용하여 측정하였다.

Perkin Elmer 9600을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 3 분간 denaturation 시킨 후 94℃ 1분, 35℃ 1분, 72℃ 2분으로 45회 반응시키고 마지막회에서 72℃로 10분간 반응시켰다. 이 때, 20㎕ 반응용액 안에는 주형 (template) 20ng, dNTP 100μM, 프라이머 0.2μM가 포함되었고, 10 X reactionbuffer는 Mg²⁺가 1.5 mM 포함된 것을 사용하였다.

PCR 반응 후 그 산물을 전기영동하였다. PCR 반응 후 TBE 완충액을 넣은 1.4% 아가로스 겔 (agarose gel)에서 100 V로 4 시간동안 전기영동한 다음 에티디움 브로마이드 (EtBr)로 염색하고 자외선 조사기 (UV illuminator)를 이용하여 관찰 및 사진촬영하여 그 데이터를 보관하였다.

총 40개의 오페론 프라이머 가운데에서 OPC06, OPC16, OPD12에서 차이가 나는 고려지 특이 밴드가 증폭됨을 확인하였다 (도 1). 그러나, 교배 후 실험포장에서 월동한 상기 실시예 1의 46개체의 잔디를 이용하여 교배검정을 알아보기 위한 실험을 수행한 결과, OPC06, OPC16의 경우 교배종에서는 고려지 특이 밴드가 증폭되지 않았기 때문에 이들 프라이머의 경우에는 교배종 분석에서 제외시켰다. OPD12의 경우에는 약 900bp의 고려지 특이 밴드를 교배종에서도 확인할 수 있었다 (도 2). OPD12 프라이머를 사용하였을때 고려지에서만 특이하게 나타나는 상기 900bp의 DNA 절편 표지를 D12-900이라 명명하였다.

고려지에서 안양중지와 구별되어 증폭되는 밴드가 나오는 상기 OPD12 프라이머를 이용하여 상기 총 46개체의 교배종에서 DNA를 분리하여 RAPD 분석을 수행한 결과, 98년도 교배번호 3, 15, 22, 31, 33, 36, 42번의 7개의 개체에서 고려지 특이적인 밴드가 증폭되었다. 따라서, 이 결과를 바탕으로 안양잔디와 동래고려지의 교배가 이루어졌음을 확인하였다.

제2단계. RAPD 분석에 의한 고려지 잔디 특이 표지 확인

고려지잔디를 타 잔디와 구별할 수 있는 DNA 표지의 개발을 위해 현 서울종묘(주)의 S-94, 일반종, Meyer, Zenith, 한국의 대표적인 들잔디인 야지, 그리고 안양잔디를 실험재료로 이용하였다. OPD12 프라이머에 대해 전술한 방법으로 RAPD 분석을 실시하여 상기 D12-900 밴드가 동래고려지에서만 특이적으로 증폭되는지를 확인한 결과, 고려지 잔디에서만 특이적으로 증폭됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3 : 고려지잔디 특이 표지의 염기서열 결정 및 STS (Sequence Tagged Site) 표지의 개발

RAPD 분석은 PCR 반응시 길이가 짧은 프라이머를 사용하여 낮은 온도에서 annealing하기 때문에 특이성이 떨어지며 같은 주형 DNA라도 반응조건에 따라 서로 다른 위치에 결합하여 PCR 산물이 증폭되므로 연구자 혹은 연구실에 따라 동일한 결과를 얻지 못하는 경우가 많다. 이러한 문제점을 보완하기 위해 RAPD 표지의 염기서열을 분석하여 최초 random primer보다 길이가 긴 프라이머를 제작하여 PCR 반응에 이용하게 되면 특이성이 높아지고 해당하는 표지만을 분석할 수 있게 되는데 이와 같이 만들어진 표지를 STS 표지 (STS marker)라 한다. 본 발명에서는 하기와 같은 방법으로 STS 마커를 제작하였다.

제1단계. 동래 고려지 잔디 특이 표지의 선발, 클로닝 및 염기서열의 결정

상기 OPD12 프라이머를 이용한 RAPD 결과 얻어진 고려지잔디 특이 DNA 절편(fragment)을 QIAGEN사의 DNA elution kit을 이용하여 아가로스 겔에서 회수하였다. 분리된 DNA 단편을 아가로스 겔에서 전기영동한 후 겔로부터 회수된 DNA의 단일 밴드 여부 및 그 양을 확인하였다. 특이적으로 증폭된 DNA 단편을 잘라낸 후 Promega사의 pGEM-T easy vector와 3:1의 비율로 섞어 14℃에서 24시간동안 라이게이션 (ligation)하였다.E. coli숙주균주 (host strain)인E.coliDH10B를 electroporation하여 형질전환 (transformation)시켰다. 형질전환한E. coli를 앰피실린 (ampicillin) 50㎍/mL, X-gal, IPTG가 포함된 배지에 도포한 후 16시간동안 배양하여 흰색 콜로니 (white colony)로 나온 재조합체 (recombinant)를 선발하고, 알칼리 용해 (alkaline lysis) 방법으로 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드를EcoRI으로 37℃에서 2시간동안 절단하고 1.4% 아가로스 겔에서 전기영동함으로써 원하는 표지의 크기에 해당하는 DNA 단편이 클로닝된 재조합 클론 (recombinant clone)을 8개 확보하였다. 확보된 8개중에서 2번과 7번 2개의 클론에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열 분석은 Sanger의 chain termination 방법을 사용하였다.

도 3에서와 같이, 제한효소로 절단한 DNA를 전기영동한 결과, 상기 표지의 크기에 해당하는 DNA 절편이 존재함을 알 수 있었다. 화살표 부분은 insert의 크기를 나타내고 있다. Insert가 포함된 클론 가운데서 2번과 7번 클론의 양방향 염기서열을 분석한 결과, 2번과 7번이 모두 같은 염기서열을 지니고 있었다 (도 4).

제2단계. 동래 고려지 잔디 특이 RAPD 표지의 STS 표지로의 전환

염기서열 분석 후 RAPD 분석시 이용한 random primer 염기서열에 12개의 염기를 더하여 길이가 긴 프라이머를 정방향 및 역방향으로 합성하였다. 합성된 프라이머의 Tm를 계산하여 PCR 반응시 annealing 온도를 결정하였다.

염기서열 분석결과를 바탕으로 각 표지의 양 말단 염기서열을 가진 22-mer의 올리고뉴클레오티느 (oligonucleotide)를 제작하였다 (최초의 random primer 염기서열을 포함) (표 2, 도 4). 합성 프라이머의 Tm 값을 계산하여 PCR 반응시 annealing 온도를 결정하고 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 현재 시판되고 있는 잔디 4품종, 야지 및 안양중지에 대해서 수행하였다. D12-900은 STS로 전환하여 RAPD에서와 같은 결과를 얻었는데 이때의 반응 조건은 25㎕ 반응용액에 DNA 주형 50 ng, dNTP 200μM, 프라이머 각각 25 pmol, 100 mM Tris-HCl (pH8.3), 1.25 mM MgCl2, 50 mM KCl을 넣어 94℃로 3분 denature후, 94℃ 1분, 66℃ 1분, 72℃ 2분으로 35회 반응하고 72℃로 10분 반응하였다. 상기 D12-900을 이용하여 STS로 전환한 결과 다른 6개의 잔디에서는 증폭이 이루어지지 않았고, 동래고려지 잔디에서만 특이적으로 증폭됨을 확인하였다 (도 5). 따라서, 이렇게 전환된 STS 마커를 교배계통의 분석에 이용할 수 있을 것이다.

클론된 RAPD 마커로부터 유도된 Sequence tagged site (STS) 마커 프라이머 쌍

RAPD markername	Primer namez	Sequencey	Tm Value(℃)4(G+C)+2(A+T)
D12-900	D12F	CACCGTATCCCCAGGAAAGTTG	68
	D12R	CACCGTATCCTGCATGATCAAC	66

제3단계. STS 표지를 이용한 안양중지와 동래고려지 교배종의 분석

상기 본 발명을 통해서 얻어진 STS 마커를 이용해서 안양중지와 동래고려지의 교배종들의 PCR을 수행하였다 (도 6). 그 결과, 오페론 프라이머 (operon primer) D12의 경우에서의 결과에서와 마찬가지로 교배종 3, 15, 22, 31, 33, 36, 46의 DNA에서만 증폭이 이루어졌다. 이로써 전환된 STS 마커가 동래고려지와 교배된 개체들을 판별하는 마커로 사용할 수 있을 뿐 아니라, 교배된 잔디가 품종으로 시판될 때, 품종확인을 위한 마커로 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4 : 상기 교배종의 생육조사

안양중지와 동래고려지의 상기 교배개체를 신품종 잔디로 등록하기 위해서 생육조사를 수행하였다. 그 결과, 대부분의 교배종이 안양중지와 동래고려지의 중간적인 특성, 즉 엽폭은 안양중지보다 좁고, 엽색은 안양중지와 비슷하거나 약간 진한 형태를 보이고, 총 길이는 안양중지보다는 적고 동래고려지보다는 긴 형태를 보였다.

안양중지와 동래고려지 교배종의 길이비교를 도 7에 나타내었다. 식물체의 전체길이는 교배종의 경우 안양중지와 동래고려지의 중간 형태를 보이고 있다. 안양중지> #42 > #22 > 동래고려지 > #31 > #3 > #36 > #15 > #33의 순으로 길이가 나타났다. 기존의 잔디품종으로 판매되고 있는 서울종묘의 S-94, S일반과 미국에서 많이 사용되고 있는 Meyer보다도 식물체의 전체 길이가 짧아 잔디 깎기 횟수가 적으리라 예상된다. 뿐만 아니라, 초형이 대부분의 경우 직립형을 나타내고 있어서 골프장에서 볼받침이 우수하리라 생각된다.

안양중지와 동래고려지 교배종의 엽폭길이 비교결과를 도 8에 나타내었다. 안양중지와 동래고려지를 교배한 계통의 경우 엽폭에 있어서도 안양중지와 동래고려지의 중간적인 특성을 나타내었다. 엽폭은 안양중지> #3 > #31 > #22 > #42 > #15. #33, # 36 > 동래고려지로 나타났다. 교배종의 경우 동래고려지보다 엽폭이 좁게 나타난 개체는 없었으나, 모든 경우 안양중지보다 좁은 엽폭의 특성을 나타내었다. 교배종 개체에서 나타난 엽폭은 기존에 판매되고 있는 중지류 잔디에 비해서도 엽폭이 가늘기 때문에 좋은 질감을 나타내리라 예상할 수 있다.

안양중지와 동래고려지 교배종의 포복경의 길이 비교를 도 9에 나타내었다. 포복경의 길이는 잔디밭 조성과 밀접한 관계가 있다. 포복경의 수와 길이가 길면 길수록 같은 면적의 땅을 그만큼 빨리 피복하는 효과가 있다. 안양중지와 동래고려지의 교배종의 경우 포복경의 길이가 최소 40cm 이상으로 나타났고, #33 > #36 > #42> #31 > #15> #22 > #3의 순으로 길이가 나타났다. 특히 #33의 경우에는 포복경의 길이가 길뿐만 아니라 하나의 개체당 포복경의 평균 숫자가 3.2 ±1.3 으로 상당히 많다. 가장 긴 포복경은 #42의 개체중에서 200cm에 이르는 길이를 나타내는 것이 있었다. 포복경의 길이가 100cm 이상의 잔디의 경우는 사방공사와 빠른 피복을 요하는 지역에 식재하는 잔디로 매우 적합하리라 생각된다.

안양중지와 동래고려지 교배종의 생육 특성

교배종	생육 특성	특징
	엽폭(㎜)		엽장 (㎝)	포복경길이(㎝)
AM03	2.9±0.1	7.4±1.8	44.8±3.3	짙은 엽색, 높은 밀도, 부드러운 질감
AM15	2.0±0.1	6.7±0.6	68.7±15	낮은 총고, 세엽, 뻣뻣한 질감
AM22	2.3±0.2	9.1±1.0	50.5±13.3	왕성한 생육, 안양중지에 비해 낮은 총고
AM31	2.4±0.1	7.7±1.3	75.7±20.6	빠른 피복속도, 왕성한 생육속도
AM33	2.0±0.0	5.2±1.5	144.0±13.0	빠른 피복속도, 왕성한 생육속도
AM36	2.0±0.1	7.1±1.5	140.7±41.3	빠른 피복속도, 포복경의 길이가 매우 길다
AM42	2.2±0.3	10.6±2.4	126.8±36.7	빠른 피복속도

상기 7개의 교배품종 중 엽폭 2.9±0.1㎜, 엽장 7.4±1.8 ㎝, 포복경 길이 44.8±3.3㎝이고 잎은 짙은 엽색을 띄고 밀도가 높으며 질감이 부드러운 것을 특징으로 하는 잔디 신품종 AM03번을 본 발명 잔디 신품종 베네스트 원 (Benest 1)으로 명명하였다. 상기 잔디 신품종 베네스트 원을 화분에서 생장시킨 형태적 특성을 도 10에 나타내었다.

실시예 5 : 본 발명 잔디 신품종 베네스트 원의 무성번식방법

본 발명 잔디 신품종 베네스트 원의 무성번식을 다음 실험예와 같이 수행하였다.

한국잔디 (zoysia grass)는 매우 강력한 포복성이 특징이며 지상포복경과 지하경에 의해 옆으로 신장되므로써 번식이 이루어진다. 지하경 (rhizomes)은 수평으로 신장하는 땅속줄기로서 각 마디에서 하나의 눈 (芽)이 발생되어 이것이 곧 하나의 새순인 유경 (幼莖, shoot)이 되며, 결국은 가지를 생산하는 지상부위의 줄기가된다. 이와 함께, 지하경의 각 마디에서는 뿌리가 나오게 된다. 지상포복경 (stolons)은 지상에 나와 있는 수평의 줄기로 이 역시 각 마디에서 유경과 뿌리를 낸다. 한국잔디의 일종인 안양중지와 동래고려지의 교배종인 본 발명 잔디 신품종 베네스트 원은 지하경이나 지상포복경에 의해 퍼지는 번식능력을 가지고 있으며 이에 의해 빽빽한 방석모양의 초형을 형성하게 된다.

실험예1. Sprigging에 의한 증식방법

Sprig는 지상포복경이나 지하경이 포함된 잔디 식물체의 일부분을 말한다. 이러한 sprigs를 마디가 포함되게 잘라 6 ~ 12 인치 (inches) 간격에 2 ~ 3 인치 깊이로 심었다. 식재 후 수분을 충분히 공급하고 관리하였더니 각 마디로부터 유경과 뿌리가 나와 잔디밭이 형성되었다.

실험예2. Stolonizing에 의해 증식하는 방법

지상포복경이나 지하경을 마디가 포함되게 잘라 잔디포지를 형성할 지역에 산파하였다. 산파 후 건조를 방지하기 위하여 표면 복토 후 관수를 실시하였다. Sprigging보다 더 많은 양의 잔디를 필요로 한다.

실험예3. Sodding에 의해 증식하는 방법

길이 2 ~ 6 피트 (feet), 폭 1 ~ 1.5 피트 정도 크기의 넓적하고 평평한 사각의 잔디 뗏장 (sod)을 일정 간격을 두고 식재하면 지상포복경과 지하경에 의해뗏장사이의 빈 공간이 메워져 잔디밭이 이루어졌다.

실험예4. Plugging에 의해 증식하는 방법

플러그 (plug)는 원통형이나 블록 모양의 작은 작디 조각을 말한다. 이러한 잔디 플러그를 일정 간격을 두고 식재하면 지상포복경과 지하경에 의해 플러그 사이의 빈 공간이 메워져 잔디밭이 이루어졌다.

실험예5. multishoot을 이용하여 증식하는 방법

지상포복경이나 지하경의 마디부분, 경정 등 분열이 왕성한 조직을 채취하여 소독한 후 BA (6-benzyladenin) 0.1 ~ 1.0mg/L와 NAA (1-naphthaleneacetic acid) 0.05 ~ 0.1mg/L가 포함된 MS (Murashige Skoog)배지에 치상하여 multishoot을 유기시켰다. 유기된 multishoot을 각각의 개체로 분리시켜 호르몬이 포함되지 않은 1/2농도의 MS배지 (표 4)로 옮겨 발근시켰다. 발근된 식물체는 순화시킨 후 온실에서 재배하여 증식시켰다.

MS 배지의 조성

구성물질 (constituent)	농도 (㎎/L)
다량 원소(Macronutrients)
KNO3	1900
NH4NO3	1650
MgSO4·7H2O	370
KH2PO4	170
CaCl2·2H2O	440
미량원소(Micronutrients)
H2BO3	6.2
MnSO4·4H2O	22.3
ZnSO4·7H2O	8.6
NaMoO4·2H2O	0.25
CuSO4·5H2O	0.025
CoCl2·6H2O	0.025
KI	0.83
FeSO4·7H2O	27.8
Disodium EDTA	37.3
글라이신(glysine)	2
수크로스(sucrose)	30 ×103
비타민 (vitamins)
Thiamine hydrochloride	0.5
Pyridoxine hydrochloride	0.5
Nicotinic acid	0.5
myo-inositol	100
pH	5.7

실험예6. 켈러스 (callus)로부터 식물체를 재분화하여 증식하는 방법

본 발명 잔디 신품종 베네스트 원에서 지상포복경이나 지하경의 마디부분, 미숙화서, 미숙배, 경정, 뿌리의 선단부 등 분열이 왕성한 조직을 채취하여 소독한 후 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 1 ~ 5mg/L와 kinetin 0.5 ~ 1.0mg/L가 포함된 상기 실험예 5의 MS 배지 (Murashige Skoog) (표 4)에 치상하여 켈러스를 유기시켰다. 유기된 켈러스를 호르몬이 포함되지 않은 1/2농도의 MS배지로 옮겨 식물체를 재분화시켰다. 재분화된 식물체는 순화시킨 후 온실에서 재배하여 증식시켰다.

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 내병성, 내한성 등이 뛰어난 안양중지와 질감이 우수한 동래고려지를 교배하여 각각의 장점을 획득한 우수한 잔디 신품종 베네스트 원을 제공하고, 안양잔디와 동래고려지의 교배를 수행하여 얻은 개체들의 교배여부를 확인하기 위해서 안양잔디와 동래고려지의 유전자를 분리하고 RAPD 검정을 실시하여 화분친인 동래고려지 특이 DNA 표지를 선발하고 그 염기서열을 분석한 후, 선발된 DNA 특이 표지 및 그 프라이머 OPD12를 이용하여 STS 마커를 제조한 다음 상기 교배개체 및 타 잔디 품종을 RAPD 검정한 결과, 교배가 이루어진 개체 및 동래고려지에서는 동래고려지 특이 DNA 표지를 확인할 수 있었으며 이는 안양잔디와 동래고려지의 교배계통을 품종등록할 수 있는 근거를 마련하고 이 방법으로 교배가 이루어진 계통을 빠른 시일내에 확인할 수 있으며 동래고려지를 효율적으로 확인할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 잔디육종산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. 안양중지와 동래고려지를 유성생식법으로 교배시켜 생산한 것으로서 엽폭 2.9±0.1㎜, 엽장 7.4±1.8㎝, 포복경 길이 44.8±3.3㎝이고 잎은 짙은 엽색을 띄고 밀도가 높고 질감이 부드러우며 지상포복경이나 지하경이 포함된 잔디식물체를 식재 또는 산파하여 무성번식시킴을 특징으로 하는 잔디 신품종 베네스트 원 (Benest 1).
2. 동래고려지 DNA를 OPD12 프라이머로 특이적으로 증폭시켜 획득함을 특징으로 하는 동래고려지 교배품종의 판별을 위한 하기 염기서열의 동래고려지 특이 DNA 표지 D12-900.
3. 제 2항 기재의 동래고려지 특이 DNA 표지 D12-900의 양 말단 염기서열을 갖는 22-mer의 올리고뉴클레오티드를 전환시켜 제조함을 특징으로 하는 동래고려지 교배품종의 판별을 위한 하기 염기서열의 동래고려지 특이 STS 마커 D12F 또는 D12R.