KR101928567B1 - 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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김욱진
양선규
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Abstract

본 발명은 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 상세하게는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이를 구별할 수 있는 프라이머 세트; 상기생,편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 키트; 및 상기 프라이머 세트를 이용하는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별 방법 및 키트는 상기 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 유통 과정에 발생하는 혼용, 오용 또는 위품의 유통방지와 이들의 종자나 종묘를 감별하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for discrimination of Taxillus chinensis, Viscum articulatum, Viscum coloratum, Macrosolen tricolor and Taxillus sutchuenensis and uses thereof}
본 발명은 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
국내에서 생산유통되고 있는 한약재 중에는 기원이 부정확하거나 외형이 비슷하여 혼용 또는 오용되는 사례가 많다. 뿐만 아니라 한국, 중국, 일본 등의 한약재를 사용하는 나라에서 약용식물의 기원을 다르게 규정하고 있어 절반 이상을 수입에 의존하고 있는 우리나라는 이러한 혼용 또는 오용에 직접 노출되어 있다고 할 수 있다. 전통적으로 혼용 또는 오용 한약재의 구분이나 기원과 관련된 감별법으로는 형태학적 관점에서의 관능검사, 이화학적 검사, 세포학적 및 생리학적 검사법 등이 이용되고 있으나 한약재는 천연물이기 때문에 일정한 품질을 확보하기가 어렵다. 이는 각 개체간의 성분 변이가 심하고 번식방법, 채취시기, 생육환경, 약재의 부위 등에 따라 큰 차이를 보이기 때문이다. 이와 같이 한약재 유통시장에서 혼용 또는 오용으로 인한 문제는 끊임없이 발생하고 있으나, 이를 방지할 수 있는 기술적 방안은 미흡한 실정이다.
한편, 한국과 중국에서는 겨우살이과의 상기생(중국식물명 광기생, Taxillus chinensis (DC.) Danser), 이명 Loranthus chinensis DC.)의 잎, 줄기 또는 가지를 말린 것을 상기생(桑寄生)이라는 한약재로 사용한다. 그리고 같은 과의 식물인 겨우살이(Viscum coloratum (Kom.) Nakai, 이명 Viscum album var. coloratum Ohwi)의 잎, 줄기 또는 가지를 말린 것을 곡기생이라는 약재로 이용하고 있다.
겨우살이는 상록성 식물로 토양에 뿌리를 내리지 않고 기주식물의 가지에 일종의 부정근의 형태로 뿌리를 내리고 식물체에 고착하여 기주식물로부터 물과 영양분을 흡수하고 광합성을 하여 살아가는 반기생성 식물이다. 겨우살이의 성장속도는 아주 느려 한 해에 가지 한 마디씩 늘려가며, 씨앗이 숙주에 정착해 첫 가지가 나오기까지만 3년이 걸린다. 어린 가지에 기생한 겨우살이는 숙주 나무에 큰 피해를 주지 않은 채 보통 20~30년 동안 함께 살아가고, 새 둥지 형태로 겨우살이가 자라려면 30년은 걸린다. 주로 한국, 중국, 대만, 일본, 러시아에 분포하며, 우리나라 겨우살이의 자생지 고도에 따른 분포는 10~200m 범위내로, 200~400 m에서 가장 흔히 분포한다. 겨우살이는 자웅이주로 3~4월에 가지 끝에 수꽃은 길이 2.5~3.0mm로 보통 3개씩, 암꽃은 지름 1.5~2.0mm로 3(~5)개씩 모여 달리며, 열매는 지름 6~8mm의 구형이며 10~11월에 밝은 황색으로 익는다. 종자는 길이 5~6mm의 납작한 타원형이며 점액질의 과육에 의해 싸여 있다.
상기생, 편지곡기생(Viscum articulatum Burm.f.), 겨우살이, 삼색초화(Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser) 및 참나무겨우살이(Taxillus sutchuenensis var. duclouxii (Lecomte) H.S.Kiu, 이명 Taxillus yadoriki (Siebold) Danser)가 유통과정에서 오용되거나 혼용되어 유통되고 있으나 이를 구별 또는 감별할 수 있는 기술이 미흡하므로 이들을 편리하게 판별할 수 있는 기술이 요구되고 있다.
품종 간 또는 유사품 간의 구별 또는 감별하는 기술의 일례로는 한국등록특허 제720864호에 파이로시퀀싱법에 의한 당귀의 종간 유전자 감별 키트가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0062179호에 겨우살이의 원산지 판별용 마이크로새틸라이트 마커에 관한 기술이 개시되어 있으나, 본 발명의 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해 언급된 바는 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하고, 상기 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이를 구별할 수 있는 유전자 마커를 개발하고, 상기 유전자 마커의 종 특이 DNA 절편의 증폭 유무와 크기를 멀티플렉스 PCR로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 분석 시료의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별방법을 제공한다.
본 발명은 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 감별 방법은 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 혼용, 오용 및 시장에서의 위품의 유통을 방지하며, 상기생의 재배 및 생산 관련하여 종자와 종묘의 감별에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 matK 유전자 염기서열 및 종 감별용 특이 SCAR 마커 개발을 위한 프라이머 부위를 나타낸 것이다.
도 2는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 종별 특이 프라이머를 이용한 PCR 증폭결과를 확인한 전기영동사진이다.
도 3은 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭 결과이다.
도 4는 한국 및 중국에서 유통되고 있는 한약재 상기생 및 곡기생에 대한 본 발명의 멀티플렉스-SCAR 마커 기반의 유전자 감별 결과이다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 10의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 10의 프라이머는 서열번호 10의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 10의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, '프라이머'는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기생(Taxillus chinensis )을 감별하기 위한 것이고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 편지곡기생(Viscum articulatum)을 감별하기 위한 것이며, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 겨우살이(Viscum coloratum)를 감별하기 위한 것이고, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 삼색초화(Macrosolen tricolor)를 감별하기 위한 것이며, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 참나무겨우살이(Taxillus sutchuenensis var. duclouxii)를 감별하기 위한 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 상기생(Taxillus chinensis ), 편지곡기생(Viscum articulatum), 겨우살이(Viscum coloratum), 삼색초화(Macrosolen tricolor) 및 참나무겨우살이(Taxillus sutchuenensis var. duclouxii)의 감별용 키트에 관한 것이다.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라아제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것이 특징이다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
1) 분석 시료의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 상기생(Taxillus chinensis), 편지곡기생(Viscum articulatum), 겨우살이(Viscum coloratum), 삼색초화(Macrosolen tricolor) 및 참나무겨우살이(Taxillus sutchuenensis var. duclouxii)의 감별방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서 분석 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다. 바람직하게는 표적 서열의 증폭은 멀티플렉스 PCR을 통해 수행할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 하나의 튜브에 넣고 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과, 각각의 프라이머 세트가 다른 프라이머 세트에 영향을 받지 않고 독립적으로 각 PCR 산물을 효율적으로 생성할 수 있는 것이 특징이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지 되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 상기생 , 편지곡기생 , 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 DNA의 추출
상기생(Taxillus chinensis ), 편지곡기생(Viscum articulatum), 겨우살이(Viscum coloratum), 삼색초화(Macrosolen tricolor) 및 참나무겨우살이(Taxillus sutchuenensis var. duclouxii)를 국내외 자생지 또는 재배지에서 수집하여 -70℃에 보관하였다.
상기 국내외 자생지 또는 재배지에서 수집하여 보관중인 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 시료를 액체 질소로 급냉시키고 막자사발을 이용하여 분말 상태가 되도록 마쇄한 후, 식물 genomic DNA Prep 키트를 이용하여 DNA를 추출하였다. 구체적으로 분말 상태의 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 시료를 각 50mg씩 1.5㎖ 튜브에 분주하고, 500㎕의 세포 파쇄액을 넣고 잘 섞어 준 다음, 8㎕의 프로테아제-K(20mg/㎖)를 넣고 가볍게 볼텍싱 하였다. 이 후, 65℃에서 30분간 인큐베이션하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 시료를 얼음에서 5분간 냉각시킨 후, 200㎕의 단백질 침전 용액(Protein Precipitation solution)을 첨가하여 잘 섞어 13,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 600㎕의 상등액을 취하여 제조사의 사용자 지침에 따라 분리하여 최종 50㎕(45ng/㎕)의 정제된 총 DNA를 -20℃에 보관하였다.
실시예 2. 프라이머 제작 및 PCR 증폭
본 발명의 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 matK 유전자 염기서열 및 종 감별용 특이 SCAR 마커 개발을 위한 프라이머 부위를 도 1에 개시하였다. 한약재 상기생으로 이용되는 상기생(Taxillus chinensis)과; 곡기생으로 이용되는 겨우살이(Viscum coloratum); 이들의 유사 한약재로 유통되고 있는 편지곡기생(Viscum articulatum), 삼색초화(Macrosolen tricolor) 및 참나무겨우살이(Taxillus sutchuenensis var. duclouxii);를 종별로 수집하여 matK 유전자 부위를 범용성 프라이머인 matK AF(5'-CTA TAT CCA CTT ATC TTT CAG GAG-3'; 서열번호 11)와 matK 8R(5'-AAA GTT CTA GCA CAA GAA AGT CGA-3'; 서열번호 12)을 이용하여 증폭한 후, 확보된 종별 염기서열 비교 분석과 이를 통해 제작한 종 특이적 PCR 산물을 증폭할 수 있는 SCAR 프라이머 부위를 채택하였다.
이후, 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 종 특이적 프라이머 부위 탐색 및 증폭용 프라이머 세트를 합성하였다(표 1).
상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 종 특이적 프라이머 서열
프라이머 명칭 서열(5'->3') 타겟 종 증폭 예상 DNA 절편의 크기(bp)
TC_F3-1 서열번호 1 GGTATCAAGGAAAATCGCTTAT 상기생
 354
TC_R4 서열번호 2 AATCGGCCGATATGAACTTAA
VA_F2-1 서열번호 3 CCCTATGTTGTTTAGCTTCTCA 편지곡기생 429
VA_R5 서열번호 4 TAAAAACAGCAACTAGGTGTTC
VC_F1 서열번호 5 ATGTAGGTTCTGAGAATCCGT 겨우살이
(곡기생)		 171
VC_R2-1 서열번호 6 GACTGAAAATACCGCTTCCAG
MT_F3 서열번호 7 GATTTTCAAACTATTTCATGGC 삼색초화 276
MT_R7 서열번호 8 TCTAGCATTTGACTTCGTCCA
TS_F2-1 서열번호 9 CCTAGGCGTAGTATCTTGTCTT 참나무
겨우살이		 214
TS_R2-1 서열번호 10 GAATCGTAACAAATGTAAAGGC
이후, 20ng의 총 DNA와 20pmole의 상기생(서열번호 1 및 서열번호 2), 편지곡기생(서열번호 3 및 서열번호 4), 겨우살이(서열번호 5 및 서열번호 6), 삼색초화(서열번호 7 및 서열번호 8) 및 참나무겨우살이(서열번호 9 및 서열번호 10) 각각의 프라이머 쌍 및 2유닛의 DNA 중합효소를 30㎕의 1×반응용액 [75mM Tris-HCl (pH 8.8), 20mM (NH4)2SO4, 0.1%(v/v) Tween 20, 20μM dNTP, 200μM MgCl2]에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler(MJ Research, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 2분간 초기변성한 후 95℃에서 20초 변성, 65℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 20초 신장을 27~35회 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 신장시키는 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% 아가로스겔 상에서 100 bp DNA 래더(ladder; Solgent, Korea)와 함께 전기영동한 후, EtBr로 염색하여 관찰하였다.
상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 구별을 위한 특이적 프라이머를 이용하는 PCR 반응 조건
PCR 조성 PCR 조건
주형(20ng/㎕) 1㎕ 단계 1: 95℃, 2분
단계 2: 95℃, 20초 -> 65℃, 30초
-> 72℃, 20초[27~35cycles]
단계 3: 72℃, 5분
프라이머 F, R(10pmole/㎕) 각 1㎕
DDW 12㎕
2x pre-mix 15㎕
total 30㎕
그 결과 도 2에 개시한 바와 같이, 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이가 모두 성공적으로 증폭되었고, 타겟 종 이외의 다른 종은 증폭되지 않았다.
실시예 3. 상기생 , 편지곡기생 , 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 멀티플렉스-SCAR 분석
5종의 프라이머 세트를 동시에 모두 이용하여 multiplex PCR 증폭을 통한 종 특이적 DNA 절편의 증폭유무와 종 판별이 가능한지를 확인하였다.
상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 구별을 위한 multiplex-PCR 반응 조건
PCR 조성 PCR 조건
template(20ng/㎕) 1㎕



단계 1: 95℃, 2분
단계 2: 95℃, 20초 - 59℃, 30초 - 72℃ 20초 [35 cycles]
단계 3: 72℃ 5분



프라이머
(10pmole/㎕)		 TC_F3-1 1㎕
TC_R4 1㎕
VA_F2-1 1㎕
VA_R5 1㎕
VC_F1 1㎕
VC_R2-1 1㎕
MT_F3 1㎕
MT_R7 1㎕
TS_F2-1 1㎕
TS_R2-1 1㎕
DDW 4㎕
2x pre-mix 15㎕
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이, 다른 프라이머 세트에 의해 영향을 받지 않고 본 발명의 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 모두 증폭이 잘 이루졌다는 것을 확인하였다.
실시예 4. 25종의 유통 한약재를 이용한 유전자 감별
시장에서 유통되는 25종의 한약재에 대하여 유전자 감별을 실시하였다. 상기 실시예 3에서 실시한 PCR 조건과 동일하게 수행하였으며, 그 결과 도 4 및 표 4에 개시한 바와 같이 나타났고, 한국 및 중국에서 유통되고 있는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이 중에서, 일부는 위품이 혼입되어 있거나, 위품인 것으로 판별되었다.
한약재 상기생 및 곡기생 유통품에 대한 본 발명의 멀티플렉스-SCAR 마커 기반의 유전자 감별 결과
NO 유통제품명 생산국가 멀티플렉스-SCAR 분석결과 Note
1 곡기생 중국 겨우살이/편지곡기생 정품 곡기생에 위품 편지곡기생 혼입
2 곡기생 중국 겨우살이/편지곡기생 정품 곡기생에 위품 편지곡기생 혼입
3 곡기생 중국 겨우살이/편지곡기생 정품 곡기생에 위품 편지곡기생 혼입
4 곡기생 한국 겨우살이
5 곡기생 한국 겨우살이
6 곡기생 중국 겨우살이
7 곡기생 중국 겨우살이
8 곡기생 한국 겨우살이
9 상기생 한국 겨우살이 곡기생을 상기생으로 오용
10 상기생 한국 겨우살이 곡기생을 상기생으로 오용
11 상기생 중국 상기생/참나무겨우살이 정품 상기생에 위 참나무겨우살이 혼입
12 상기생 중국 상기생
13 곡기생(겨우살이) 한국(홍천) 겨우살이
14 겨우살이 한국(영월) 겨우살이
15 겨우살이 한국(영주) 겨우살이
16 참나무겨우살이 한국(지리산) 겨우살이 곡기생을 참나무겨우살이로 오용
17 참나무겨우살이 한국(남원) 겨우살이 곡기생을 참나무겨우살이로 오용
18 겨우살이 한국(영주) 겨우살이
19 겨우살이 한국(영천) 겨우살이
20 겨우살이 한국 겨우살이
21 겨우살이 중국 겨우살이
22 참나무겨우살이 한국(함양) 겨우살이 곡기생을 참나무겨우살이로 오용
23 참나무겨우살이 한국(홍천) 겨우살이 곡기생을 참나무겨우살이로 오용
24 상기생 중국 겨우살이 곡기생을 상기생으로 오용
25 상기생 한국(영주) 겨우살이 곡기생을 상기생으로 오용
26 상기생 한국 겨우살이 곡기생을 상기생으로 오용
<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Primer set for discrimination of Taxillus chinensis, Viscum articulatum, Viscum coloratum, Macrosolen tricolor and Taxillus sutchuenensis and uses thereof <130> PN17375 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TC_F3-1 <400> 1 ggtatcaagg aaaatcgctt at 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TC_R4 <400> 2 aatcggccga tatgaactta a 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VA_F2-1 <400> 3 ccctatgttg tttagcttct ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VA_R5 <400> 4 taaaaacagc aactaggtgt tc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC_F1 <400> 5 atgtaggttc tgagaatccg t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC_R2-1 <400> 6 gactgaaaat accgcttcca g 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MT_F3 <400> 7 gattttcaaa ctatttcatg gc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MT_R7 <400> 8 tctagcattt gacttcgtcc a 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TS_F2-1 <400> 9 cctaggcgta gtatcttgtc tt 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TS_R2-1 <400> 10 gaatcgtaac aaatgtaaag gc 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> matK AF <400> 11 ctatatccac ttatctttca ggag 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> matK 8R <400> 12 aaagttctag cacaagaaag tcga 24

Claims (11)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기생(Taxillus chinensis)을 감별하기 위한 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 편지곡기생(Viscum articulatum)을 감별하기 위한 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 겨우살이(Viscum coloratum)를 감별하기 위한 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 삼색초화(Macrosolen tricolor)를 감별하기 위한 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 참나무겨우살이(Taxillus sutchuenensis var. duclouxii)를 감별하기 위한 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  7. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라아제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 키트.
  9. 1) 분석 시료의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적 서열의 증폭은 멀티플렉스(multiplex) PCR을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 감별방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 감별방법.
KR1020180010390A 2018-01-29 2018-01-29 상기생, 편지곡기생, 겨우살이, 삼색초화 및 참나무겨우살이의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도 KR101928567B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Yonghua Li et al., Journal of Medicinal Plants Research, 4(24), p.2706-2709, 2010.

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