KR20090123114A

KR20090123114A - 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 감별용 유전자 마커

Info

Publication number: KR20090123114A
Application number: KR1020080049033A
Authority: KR
Inventors: 문병철; 추병길; 이도연; 이혜원; 김호경
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2028-05-27
Also published as: KR100998571B1

Abstract

본 발명은 바디나물[Angelica decursiva Franch. et Savatier (=Peucedanum decursivum Maxim.)], 백화전호(Peucedanum praeruptorum Dunn.) 및 토전호(Anthricus sylvestris (L.) Hoffman)의 품종 판별용 유전자 마커에 관한 것으로, 구체적으로 바디나물, 백화전호 및 토전호에서 종 특이적으로 존재하는 유전자 염기서열을 분석하여 선별된 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 프라이머를 이용하는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별 방법 및 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 품종 판별 방법은 전호류의 혼·오용 및 위품의 유통방지에 활용될 수 있다.

바디나물, 백화전호, 토전호, 유전자 마커, 품종 판별

Description

바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 감별용 유전자 마커{DNA marker for discrimination of Angelica decursiva Franch. et Savatier(=Peucedanum decursivum Maxim.), Peucedanum praeruptorum Dunn. and Anthricus sylvestris (L.) Hoffman}

본 발명은 바디나물[Angelica decursiva Franch. et Savatier (=Peucedanum decursivum Maxim.)], 백화전호(Peucedanum praeruptorum Dunn.) 및 토전호(Anthricus sylvestris (L.) Hoffman)의 품종 판별용 유전자 마커에 관한 것이다.

국내에서 생산유통되고 있는 한약재 중 기원이 부정확하거나 명칭이 비슷하여 혼·오용되는 사례가 많다. 뿐만 아니라 한국, 중국, 일본 등의 생약재를 약으로 사용하는 나라에서 약용식물의 기원을 다르게 규정하고 있어 80% 이상을 수입에 의존하고 있는 우리나라는 이러한 혼·오용에 직접 노출되어 있다고 할 수 있다. 전통적으로 혼·오용 한약재의 구분이나 기원과 관련된 감별법으로는 형태학적 관 점에서의 관능검사, 이화학적 검사, 세포학적 및 생리학적 검사법 등이 이용되고 있으나 한약재는 천연물이기 때문에 일정한 품질을 확보하기가 어렵다. 이는 각 개체간의 성분 변이가 심하고 번식방법, 채취시기, 생육환경, 약재의 부위 등에 따라 큰 차이를 보이기 때문이다. 최근 들어 한약재 유통시장에서 기원과 관련된 혼·오용으로 가장 논란이 되고 있는 한약재로 전호류를 꼽을 수 있다.

전호는 산형과(Umbelliferae)의 다년생 초본인 바디나물[또는 자화전호(Angelica decursiva Franch. et Savatier 또는 Peucedanum decursivum Maxim.)] 또는 백화전호(Peucedanum praeruptorum D_UNN _.)의 뿌리로 규정하고 있다[대한약전외한약(생약)규격집, 2008]. 그러나 현재 국내 약재시장에서는 바디나물은 거의 유통되고 있지 않으며 백화전호와 산형과 식물인, 식물명 전호(Anthricus sylvestris Hoffman)의 뿌리가 주로 유통되고 있다. 식물명 전호는 중국에서는 아삼이라는 약재로 사용되고 있는 바디나물이나 백화전호의 한약재명인 전호와는 효능이 전혀 다른 약재이다. 이러한 전호의 유사품으로 식물명 전호가 토전호라는 약재명으로 유통되어 혼·오용 되게 된 것은 식물명 전호가 약재명과 같아서 이를 잘못 알고 재배 생산하였기 때문인 것으로 알려져 있다.

약용식물이나 한약재의 감별 마커 개발은 주로 형태적 특성의 감별이나 두 종간의 구분(Park CG et al ., Korean J. Medicinal Crop Sci . 15:1-5, 2007), 또는 여러 품종 중에 특정 품종이나 위품 판별용 유전자 마커 개발을 위한 연구로 진행되어 왔다(Wang J et al ., Planta Med . 67:781-783, 2001). 이러한 유전자 감별 마커의 개발은 주로 ITS(internal transcribed spacer)와 같은 특정부위의 염기서열 비교나 RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA)와 같은 전체 게놈 유전자의 다형분석에 기초하여 특이 프라이머 부위를 이용하는 SCAR(sequence characterized amplified region) 마커 개발연구를 통해 이루어졌다. 상기 RAPD 방법은 다양한 게놈 수준에서의 분석법 중 분석이 쉽고, 간편하기 때문에 가장 보편적으로 이용되고 있는 분석법이나, 분석조건에 따라 재현성이 떨어지는 단점이 있다(Bang KH et al ., Koidz . Korean J. Medicinal Crop Sci . 11:268-273, 2003). 이에, 상기 단점을 보완하기 위하여 RAPD 분석을 통해 확보한 특이 증폭 산물의 염기서열을 분석하여 종 특이 염기서열을 기반으로 한 SCAR 프라이머를 이용하고 있는 것이다(Paran I & Michelomore RW, Theor . Appl . Genet . 85:985-993, 1993).

이에, 본 발명자들은 바디나물, 백화전호 및 토전호의 ITS 염기서열 비교분석과 RAPD 특이 증폭 DNA 밴드의 염기서열 분석을 통해 바디나물과 백화전호는 물론, 백화전호와 위품인 토전호의 구별할 수 있는 SCAR 유래 다품종 동시 유전자 감별마커를 개발하고, 상기 유전자 감별 마커가 전호류의 혼·오용 및 위품의 유통방지에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바디나물[Angelica decursiva Franch. et Savatier (=Peucedanum decursivum Maxim.)], 백화전호(Peucedanum praeruptorum Dunn.) 및 토전호(Anthricus sylvestris (L.) Hoffman)의 품종 판별용 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되고, 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 이용하여 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바디나물[Angelica decursiva Franch. et Savatier (=Peucedanum decursivum Maxim.)], 백화전호(Peucedanum praeruptorum Dunn.) 및 토전호(Anthricus sylvestris (L.) Hoffman)의 품종 판별용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 폴리뉴클 레오티드 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 키트를 제공하다.

아울러, 본 발명은 상기 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 프라이머를 이용하여 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

'멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)'은 복수의 프라이머쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법이다. 이 경우 복수 프라이머의 상호 작용을 계산하여 프라이머가 다이머를 형성하지 않는 프라이머 조합을 만들어야 한다. 또 복수의 PCR 산물 크기를 아가로즈 겔에서 충분히 구별할 수 있어야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 바디나물[Angelica decursiva Franch. et Savatier (=Peucedanum decursivum Maxim.)], 백화전호(Peucedanum praeruptorum Dunn.) 및 토전 호(Anthricus sylvestris (L.) Hoffman)의 품종 판별용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

구체적으로, 서열번호 5로 기재된 토전호 품종 판별용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 서열번호 29로 기재된 백화전호 품종 판별용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 서열번호 28로 기재된 바디나물 및 백화전호 품종 판별용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 실시예에서는 바디나물, 백화전호 및 토전호에서 각각 특이적으로 존재하는 서열번호 5로 기재된 토전호 특이적 ITS 유전자(도 1 참조) 및 서열번호 28 및 29로 기재된 각각 바디나물 및 백화전호 특이적 유전자(도 2 참조)를 ITS 서열 분석 방법 및 서열번호 8 내지 27의 RAPD 프라이머를 이용한 분석방법을 통해 수득한 후, 상기 염기서열 내에서 본 발명의 서열번호 6 또는 7 및 서열번호 2의 종 특이 ITS 증폭용 프라이머 쌍 및 서열번호 30 내지 34의 종 특이 SCAR 프라이머 쌍을 제작하였다. 상기 SCAR 프라이머 쌍들은 종 특이적 유전자를 증폭할 수 있도록 제작된 것으로, 실제로 상기 ITS 증폭용 프라이머 쌍 및 SCAR 프라이머 쌍들을 이용하여 바디나물, 백화전호 및 토전호의 식물 DNA를 PCR 한 결과, 예상 크기의 단일 증폭산물을 생산하는 것을 확인할 수 있었다(도 1, 도 3 및 도 4 참조). 구체적으로, 토전호 특이적 ITS 556 S 프라이머(서열번호 6) 및 서열번호 2의 ITS4 프라이머의 경우 및 토전호 특이적 ITS 273 S 프라이머(서열번호 7) 및 서열번호 2 의 ITS4 프라이머의 경우는 토전호 특이적으로 556 bp 및 273 bp 크기의 증폭 산물을 생성하는 것을 확인할 수 있었다(도 1b 및 1c 참조). 또한, OPA16 RAPD 프라이머에 의한 바디나물 특이 증폭 산물(JA16-1; 도 2a 참조)로부터 제작한 S와 AS SCAR 프라이머 쌍(도 3a 참조)의 경우는 토전호를 제외한 바디나물과 백화전호에서 공통으로 363 bp 크기의 증폭 산물이 나타났다(도 3b 참조). 상기 JA16-1 S와 AS 프라이머 쌍은 바디나물 감별용으로 활용은 어렵지만 유사품인 토전호와 정품의 전호인 바디나물과 백화전호를 감별용으로 이용할 수 있을 것이다. 아울러, OPA17 RAPD 프라이머에 의한 약 600 bp 크기의 백화전호 특이 증폭 산물(JA17-2; 도 2b 참조)로부터 제작한 S와 AS 1 또는 AS 2 SCAR 프라이머의 경우(도 4a)는 각각 145 bp(도 4b 참조) 및 305 bp(도 4c 참조) 크기에서 정확하게 백화전호 특이적으로 DNA 단편을 증폭하였다. 상기 JA17-2 S 프라이머와 JA17-2 AS 1 또는 JA17-2 AS 2 프라이머는 백화전호 감별용으로 이용할 수 있을 것이다.

이와 같이, 본 발명의 서열번호 5, 서열번호 28 및 29로 기재되는 서열 내에서 선택되는 상기 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 품종 판별용 프라이머 쌍은 판별하고자 하는 품종에 따라 각각 또는 두 가지 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

구체적으로, 한 번의 검사로 종 판별 및 위품의 혼입 여부를 판별할 수 있도록 하기와 같이 프라이머 세트를 조합하여 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과, 예상한 크기의 정확한 DNA 단편이 증폭됨을 확인함으로써 3종류의 전호류를 동시에 감별할 뿐만 아니라 위품인 토전호의 혼입 또한 감별해 낼 수 있는 다품종 동시 유전자 감 별용 마커인 것을 확인하였다(도 5 참조).

프라이머 세트 조합:

1) JA17-2 S와 AS 1 SCAR 프라이머의 백화전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(145 bp), 토전호로부터 바디나물과 백화전호를 구별할 수 있는 JA16-1 S와 AS SCAR 프라이머 쌍(363 bp) 및 ITS 273 S와 ITS4 프라이머의 토전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(273 bp);

2) JA17-2 S와 AS 2 SCAR 프라이머의 백화전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(305 bp), 토전호로부터 바디나물과 백화전호를 구별할 수 있는 JA16-1 S와 AS SCAR 프라이머 쌍(363 bp) 및 ITS 273 S와 ITS4 프라이머의 토전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(273 bp).

또한, 본 발명은 상기 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 제공한다.

구체적으로, 하기에 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 제공한다:

1) 서열번호 5로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍;

2) 서열번호 29로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍; 및,

3) 서열번호 28로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 바디나물 및 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍.

상기 1)의 프라이머 쌍은 본 명세서에서는 서열번호 6 또는 서열번호 7 및 서열번호 2로 기재되어 있으며, 상기 2)의 프라이머 쌍은 서열번호 32 및 서열번호 33 또는 서열번호 34으로 기재되어 있고, 상기 3)의 프라이머 쌍은 서열번호 30 및 서열번호 31로 기재되어 있다.

상기 프라이머 쌍들의 길이는 너무 짧으면 원하는 서열에 특이적이지 않고, 너무 길면 미스매치(mismatch) 될 수 있으므로, 16 ~ 35 bp의 크기를 갖는 것이 바람직하며, 16 ~ 25 bp의 크기를 갖는 것이 더욱 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는 토전호, 바디나물 및 백화전호에서 각각 특이적으로 존재하는 서열번호 5, 서열번호 28 및 서열번호 29의 종 특이적 유전자(도 1 참조)의 염기서열을 ITS 서열 분석 방법 및 서열번호 8 내지 27의 RAPD 프라이머를 이용한 분석방법을 통해 수득한 후, 상기 염기서열 내에서 본 발명의 서열번호 6 또는 7 및 서열번호 2의 종 특이 ITS 증폭용 프라이머 쌍 및 서열번호 30 내지 34의 종 특이 SCAR 프라이머 쌍을 제작하였다. 상기 SCAR 프라이머 쌍들은 종 특이적 유전 자를 증폭할 수 있도록 제작된 것으로, 실제로 상기 ITS 증폭용 프라이머 쌍 및 SCAR 프라이머 쌍들을 이용하여 바디나물, 백화전호 및 토전호의 식물 DNA를 PCR 한 결과, 예상 크기의 단일 증폭산물을 생산하는 것을 확인할 수 있었다(도 1, 도 3 및 도 4 참조).

또한, 본 발명의 서열번호 5, 서열번호 28 및 서열번호 29로 기재되는 서열 내에서 선택되는 상기 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 품종 판별용 프라이머 쌍은 판별하고자 하는 품종에 따라 각각 또는 두 가지 이상을 혼합하여 사용될 수 있다(도 5 참조).

또한, 본 발명은 상기 바디나물, 백화전호 또는 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 바디나물, 백화전호 또는 토전호 품종 판별용 키트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 토전호 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 29로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 백화전호 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 28로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 바디나물 및 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 포함하는 바디나물 및 백화전호 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍, 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍 및 바디나물 및 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 모두 포함하는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 상기 프라이머 쌍은 바디나물, 백화전호 또는 토전호의 DNA를 각각 종 특이적으로 증폭하였고(도 1, 도 3 및 도 4 참조), 판별하고자 하는 품종에 따라 각각 또는 두 가지 이상을 혼합하여 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 프라이머 쌍들을 혼합하여 사용한 경우에서도 예상한 크기의 정확한 DNA 단편이 증폭됨을 확인함으로써 3종류의 전호류를 동시에 감별할 뿐만 아니라 위품인 토전호의 혼입 또한 감별해 낼 수 있는 다품종 동시 유전자 감별용 마커인 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한 상기 키트는 DNA 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 DNA 추출용 시약, 데옥시뉴클레오티드, DNA 증폭 반응에 적합한 열안정성 폴리머라제 및 핵산의 표지화 및 검출용 시약을 함유할 수 있다.

아울러, 본 발명은 1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;

2) 본 발명의 프라이머를 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,

3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별 하는 단계를 포함하는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종을 판별방법을 제공한다.

상기 시료는 바디나물, 백화전호 및 토전호 자체 또는 상기 바디나물, 백화전호 및 토전호가 포함된 것으로 예상되는 식품일 수 있다.

또한, 상기 프라이머는 서열번호 5, 서열번호 28 및 29로 기재되는 서열 내에서 선택되는 상기 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 상기 프라이머들은 바디나물, 백화전호 및 토전호의 DNA를 각각 종 특이적으로 증폭하였다(도 1, 도 3 및 도 4 참조).

또한, 본 발명의 서열번호 5, 서열번호 28 및 29로 기재되는 서열 내에서 선택되는 상기 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 품종 판별용 프라이머는 판별하고자 하는 품종에 따라 각각 또는 두 가지 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 프라이머를 혼합하여 사용한 경우에서도 예상한 크기의 정확한 DNA 단편이 증폭됨을 확인함으로써 3종류의 전호류를 동시에 감별할 뿐만 아니라 위품인 토전호의 혼입 또한 감별해 낼 수 있는 다품종 동시 유전자 감별용 마커인 것을 확인하였다(도 5 참조)

단계 3)의 정성 분석은 전기영동 결과 PCR 산물의 검출 여부에 의해 수행될 수 있다. 즉, 토전호 특이적으로 증폭되는 ITS 마커를 증폭할 수 있는 프라이머와 JA16-1과 JA17-2의 SCAR 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 같이 사용하여 PCR을 수행할 경우 전호류로의 종 구별뿐만 아니라 위품인 토전호가 혼입되었을 경우에도 식별이 가능할 것으로 판단될 수 있다.

본 발명의 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍을 이용한 품종 판별 방법은 전호류의 혼·오용 및 위품의 유통방지에 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 식물 DNA 추출

<1-1> 공시재료

국내 바디나물[Angelica decursiva Franch. et Savatier (=Peucedanum decursivum Maxim.)] 자생지 3곳, 중국 백화전호(Peucedanum praeruptorum Dunn.) 자생지 3곳 그리고 토전호(Anthricus sylvestris (L.) Hoffman) 재배지 2곳에서 각각 수집해서 사용하였다. 구체적으로, 바디나물은 경남 남해군 상주면, 경남 사천시 곤양면 및 대전시 동구 용운동의 자생지에서, 백화전호는 중국 감숙성 이현, 문현 및 사천성 송판의 자생지에서 토전호는 전남 해남군 약산도 재배지 2곳에서 각각 1계통씩 수집하여 생체시료의 뿌리, 줄기, 잎을 -70℃에 보관하였다.

<1-2> 식물 DNA 추출

-70℃에 보관중인 상기 생체시료를 액체 질소로 급랭시키고 막자사발을 이용 하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, Plant genomic DNA Prep 키트(Solgent, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 구체적으로, 분말상태의 생체시료 50 ㎎을 1.5 ㎖ 튜브에 분취하고 세포파쇄액 500 ㎕를 넣고 잘 섞어준 다음, 프로테아제-K(20 ㎎/㎖) 8 ㎕를 넣고 가볍게 볼텍싱 한 뒤 65℃에서 30분간 인큐베이션하여 세포파쇄 하였다. 파쇄된 시료를 얼음에서 5분간 냉각시킨 뒤 단백질 침전 용액(Protein Precipitation Solution) 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞어 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액 600 ㎕를 취하여 제조사의 사용자 지침에 따라 분리하여 최종 50 ㎕(45 ng/㎕)의 정제된 전체 DNA를 -20℃에 보관하였다.

< 실시예 2> ITS 염기서열 분석 및 프라이머 제작

<2-1> PCR 수행

ITS(Internal Transcribed Spacer) 부위 염기서열 분석을 통한 특이 프라이머를 제작하고자 바디나물, 백화전호 및 토전호의 핵리보좀 DNA(nuclear ribosomal DNA nrDNA)의 ITS 부위를 서열번호 1(ITS1; 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG-3')과 서열번호 2(ITS4; 5'-TCC TCC GCT GAT TGA TAT GC-3')로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하였다.

구체적으로, 20 ng의 전체 DNA와 20 pmole의 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머 쌍 및 2 unit의 DNA 중합효소를 30 ㎕의 1×반응용액[75 mM Tris-HCL (pH 8.8), 20 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1%(v/v) Tween 20, 20 μM dNTP, 200 μM MgCl₂] 에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler(MJ Research, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 초기변성한 후 95℃에서 30초 변성, 51℃에서 40초 어닐링, 72℃에서 1분 신장을 30회 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 최종 신장시키는 조건으로 수행하였다. ITS 부위 PCR 증폭 산물은 1.5% 아가로스겔 상에서 100 bp DNA 래더(ladder; Invitrogen, USA)와 함께 전기영동한 후, EtBr로 염색하여 관찰하였다.

<2-2> 염기서열 분석

실시예 2-1에서 확보한 각각의 전호류의 ITS 증폭 산물의 염기서열을 분석하였다.

구체적으로, 확인된 ITS 증폭 산물을 아가로스겔로부터 PCR & Gel Purification 키트(SolGent, Korea)를 이용하여 회수하여 분리정제한 뒤, pGEM-T Easy Vector Systems(Promega, USA)에 삽입하였다. 삽입된 증폭 산물은 XL1-Blue MRF' 형질전환용 세포(Stratagene, USA)에 형질도입한 뒤, 앰피실린(Sigma, USA)과 X-gal/IPTG(Sigma, USA)가 첨가된 LB 아가 배지에 도말하여 배양하였다. 하얀색 콜로니(white colony)를 선별하여, 앰피실린이 첨가된 LB 액체 배지에서 37℃에서 재배양한 후, 세포를 회수하여 Plasmid mini preparation 키트(SolGent, Korea)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리한 후, T7과 SP6 프라이머를 이용하여 ABI3730 automatic DNA sequencer(Applied Biosystems, USA)에서 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 도 1a에서와 같이 바디나물(서열번호 3)에서는 689 bp, 백화전호(서열번호 4)는 693 bp 및 토전호(서열번호 5)는 694 bp의 ITS 부위 증폭 산물을 수득하였으며, 바디나물과 백화전호는 94.6%, 바디나물과 토전호는 82.8% 그리고 백화전호와 토전호는 82.7%의 염기서열이 같음을 알 수 있었다. 상기 세 종의 ITS 염기서열의 상동성을 조사한 결과, ITS1 위치인 140～160 bp 부위와 ITS2 위치인 420～440 bp 위치에서 토전호 특이 염기서열을 확인할 수 있었다.

<2-3> 전호류 품종 선별용 프라이머 쌍 제작

상기 각각의 전호류의 ITS 증폭 산물의 염기서열 분석결과를 바탕으로 20 mer의 SCAR 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하고 그 증폭 산물의 특이성을 확인하였다.

구체적으로, 토전호 ITS1 부위의 서열번호 6(5'-GGTGTCAACAACCAAATA-3')으로 기재되는 ITS 556 S 프라이머와 ITS2 부위의 서열번호 7(5'-CCCTGACCAACTAATCTTC-3')로 기재되는 ITS 273 S 프라이머를 SCAR 마커용 프라이머로 바이오니아(한국)에 의뢰하여 제작한 후, 서열번호 2로 기재되는 ITS4 프라이머와 함께 실시예 2-2와 동일한 방법으로 PCR 증폭하여 증폭산물의 특이성을 확인하였다.

그 결과, 도 1b 및 도 1c에서 나타난 바와 같이 각 프라이머 쌍들은 556 bp 및 273 bp의 토전호 특이적인 증폭산물을 생산하였다.

< 실시예 3> RAPD 분석

바디나물과 백화전호는 ITS 염기서열의 유사도가 너무 높아 품종 판별용 종 특이적 마커를 확보하지 못하였다. 이에 전체 게놈을 대상으로 RAPD(Random Amplified polymorphic DNA) 분석을 통한 품종 판별용 종 특이적 마커와 프라이머 쌍을 개발하였다.

<3-1> PCR 수행

Operon사의 10-mer RAPD Kits 중 RAPD kit A와 C(표 1)를 이용하여 RAPD 분석을 위한 PCR 증폭을 수행하였다. 20 ng의 전체 DNA와 40 pmole의 표 1의 RAPD 프라이머 및 2 unit의 DNA 중합효소를 30 ㎕의 1×반응용액에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler(MJ Research, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 초기변성한 후 95℃에서 30초 변성, 46℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 45초 신장을 30회 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 신장시키는 조건으로 수행하였다. RAPD 특이 PCR 증폭 산물은 1.5% 아가로스겔 상에서 100 bp DNA 래더(ladder; Invitrogen, USA)와 함께 전기영동한 후, EtBr로 염색하여 관찰하였다.

그 결과, PCR 증폭 산물들은 주로 0.2 kb ~ 3.0 kb 크기에서 다양하게 나타났으며, 2종의 프라이머(OPA16 및 OPA17)로부터 바디나물 및 백화전호에 대한 2개의 종 특이적 증폭 산물을 확보하였다(도 2).

구체적으로, OPA16 프라이머로부터 바디나물 특이 증폭 산물을 확보하였고(도 2a), 이를 JA16-1이라고 명명하였으며; OPA17 프라이머로부터 백화전호 특이 증폭 산물을 확보하였고(도 2b), 이를 JA17-2로 명명하였다.

Operon RAPD 프라이머 A와 C의 서열

프라이머	서열(5'-3')	서열번호	GC 함량(%)	프라이머	서열(5'-3')	서열번호	GC 함량(%)
OPA-11	CAATCGCCGT	8	60%	OPC-11	AAAGCTGCGG	18	60%
OPA-12	TCGGCGATAG	9	60%	OPC-12	TGTCATCCCC	19	60%
OPA-13	CAGCACCCAC	10	70%	OPC-13	AAGCCTCGTC	20	60%
OPA-14	TCTGTGCTGG	11	60%	OPC-14	TGCGTGCTTG	21	60%
OPA-15	TTCCGAACCC	12	60%	OPC-15	GACGGATCAG	22	60%
OPA-16	AGCCAGCGAA	13	60%	OPC-16	CACACTCCAG	23	60%
OPA-17	GACCGCTTGT	14	60%	OPC-17	TTCCCCCCAG	24	70%
OPA-18	AGGTGACCGT	15	60%	OPC-18	TGAGTGGGTG	25	60%
OPA-19	CAAACGTCGG	16	60%	OPC-19	GTTGCCAGCC	26	70%
OPA-20	GTTGCGATCC	17	60%	OPC-20	ACTTCGCCAC	27	60%

<3-2> RAPD 특이 증폭 산물 의 염기서열 분석

실시예 3-1에서 확보한 2개의 종 특이 증폭 산물의 염기서열을 실시예 2-2와 동일한 방법으로 분석하였다.

그 결과, JA16-1(바디나물 특이적) 및 JA17-2(백화전호 특이적)에 대한 각각 서열번호 28 내지 29의 염기서열을 수득하였다.

< 실시예 4> SCAR 마커 탐색 및 다품종 동시감별 유전자 마커 개발

실시예 3의 종 특이 RAPD 증폭 산물의 염기서열 분석결과를 바탕으로 RAPD 10-mer 프라이머 서열 부위를 제외한 부분에서 20 mer의 SCAR 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하고 그 증폭 산물의 특이성을 확인하였다.

구체적으로, 표 2에 나타난 바와 같이 SCAR 프라이머를 제작하였다.

SCAR 프라이머

증폭산물	프라이머	염기서열(5'-3')	서열번호
JA16-1	S	TTGAGGATGATAAGGGGTAG	30
	AS	CCTAAGTGTTGACACCTACT	31
JA17-2	S	ATCCGGTGATGGGGGAGAAT	32
	AS 1	GAAGCACCGCTATACGGCTT	33
	AS 2	CTTTATCCCTATTCCAAGCT	34

상기 SCAR 프라이머를 이용한 PCR 증폭조건은 하기와 같다: 20 ng의 전체 DNA와 20 pmole의 S(sense) 프라이머와 AS(anti sense) 프라이머 및 2 unit의 DNA 중합효소를 30 ㎕의 1×반응용액에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 초기변성한 후 95℃에서 1분 변성, 51℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 2분간 신장을 30회 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 신장시켰다. 상기 SCAR 증폭 산물은 1.5% 아가로스겔 상에서 100 bp DNA 래더와 함께 전기영동한 후, EtBr로 염색하여 관찰하였다.

그 결과, OPA16 RAPD 프라이머에 의한 바디나물 특이 증폭 산물(JA16-1; 도 2a)로부터 제작한 S와 AS SCAR 프라이머 쌍(도 3a)의 경우는 토전호를 제외한 바디나물과 백화전호에서 공통으로 363 bp 크기의 증폭 산물이 나타났다(도 3b). 상기 JA16-1 S와 AS 프라이머 쌍은 바디나물 감별용으로 활용은 어렵지만 유사품인 토전호와 정품의 전호인 바디나물과 백화전호를 감별용으로 이용할 수 있을 것이다.

또한, OPA17 RAPD 프라이머에 의한 약 600 bp 크기의 백화전호 특이 증폭 산물(JA17-2; 도 2b)로부터 제작한 S와 AS 1 또는 AS 2 SCAR 프라이머의 경우(도 4a)는 각각 145 bp(도 4b) 및 305 bp(도 4c) 크기에서 정확하게 백화전호 특이적으로 DNA 단편을 증폭하였다. 상기 JA17-2 S 프라이머와 JA17-2 AS 1 또는 JA17-2 AS 2 프라이머는 백화전호 감별용으로 이용할 수 있을 것이다.

< 실시예 5> 종 특이 염기서열을 이용한 다품종 동시 유전자 감별 마커 개발

<5-1> 마커 개발

한 번의 검사로 혼·오용되고 있는 전호류 3종을 동시에 판별할 수 있는 전호류 다품종 감별용 마커를 개발하였다.

<5-2> 멀티플렉스 PCR 1

표 2의 JA17-2 S와 AS 1 SCAR 프라이머의 백화전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(145 bp), 토전호로부터 바디나물과 백화전호를 구별할 수 있는 JA16-1 S와 AS SCAR 프라이머 쌍(363 bp) 및 ITS 273 S와 ITS4 프라이머의 토전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(273 bp)을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

멀티플렉스 PCR 조건은 20 ng의 전체 DNA와 20 pmole씩의 S 프라이머와 AS 프라이머 3쌍과 2 unit의 DNA 중합효소를 30 ㎕의 1×반응용액에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 초기변성한 후 95℃에서 1분 변성, 51℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 2분간 신장을 30회 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 신장시켰다. 상기 SCAR 증폭 산물은 1.5% 아가로스겔 상에서 100 bp DNA 래더와 함께 전기영동한 후, EtBr로 염색하여 관찰하였다.

그 결과, 도 5a에서 나타난 바와 같이 예상한 크기의 정확한 DNA 단편이 증폭됨을 확인함으로써 3종류의 전호류를 동시에 감별할 뿐만 아니라 위품인 토전호의 혼입 또한 감별해 낼 수 있는 다품종 동시 유전자 감별용 마커인 것을 확인하였다.

<5-3> 멀티플렉스 PCR 2

표 2의 JA17-2 S와 AS 2 SCAR 프라이머의 백화전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(305 bp), 토전호로부터 바디나물과 백화전호를 구별할 수 있는 JA16-1 S와 AS SCAR 프라이머 쌍(363 bp) 및 ITS 273 S와 ITS4 프라이머의 토전호 특이 증폭용 프라이머 쌍(273 bp)을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 5b에서 나타난 바와 같이 예상한 크기의 정확한 DNA 단편이 증폭됨을 확인함으로써 3종류의 전호류를 동시에 감별할 뿐만 아니라 위품인 토전호의 혼입 또한 감별해 낼 수 있는 다품종 동시 유전자 감별용 마커인 것을 확인하였다. 상기 마커는 도 5a의 마커의 경우보다 DNA 증폭 특이성이 떨어졌다.

도 1은 바디나물, 백화전호 및 토전호에서 ITS 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다:

a: 상동성 검사;

b: ITS 556 S 프라이머를 이용한 PCR 수행 결과; 및,

c: ITS 273 S 프라이머를 이용한 PCR 수행 결과.

도 2는 RAPD 분석용 프라이머를 이용하여 바디나물, 백화전호 및 토전호에서 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다:

a: OPA16; 및,

b: OPA17.

도 3은 JA16-1 증폭산물의 염기서열 및 상기 염기서열을 근거로 제작한 SCAR 프라이머쌍을 이용하여 바디나물, 백화전호 및 토전호에서 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다:

a: 염기서열; 및,

b: PCR 결과.

도 4는 JA17-2 증폭산물의 염기서열 및 상기 염기서열을 근거로 제작한 SCAR 프라이머쌍을 이용하여 바디나물, 백화전호 및 토전호에서 PCR을 수행한 결과를 나 타낸 도이다:

a: 염기서열;

b: PCR 결과(145 bp); 및,

c: PCR 결과(305 bp).

도 5는 3쌍의 SCAR 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR 수행 결과를 나타낸 도이다:

a: JA17-2 S/AS 1, JA16-1 S/AS 및 ITS 273/ITS4; 및,

b: JA17-2 S/AS 2, JA16-1 S/AS 및 ITS 273/ITS4.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Gene marker for classification of Angelica decursiva, Peucedanum praeruptorum and Anthricus sylvestris <130> 8P-04-30 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 <400> 1 tccgtaggtg aacctgcg 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 <400> 2 tcctccgctg attgatatgc 20 <210> 3 <211> 689 <212> DNA <213> Angelica decursiva <400> 3 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct 60 aacacgttaa caatttgggc gagcgtcggg gggcctcggt ctcctgtctt cgaatccctg 120 gtaggtggcc actcccgggt ggtcactggc ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc 180 aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt atcccgttcg cgggcaccgg cgtcattcca 240 aaacacaacg actctcgaca acggatatct cggctctcgc atcgatgaag aacgtagcga 300 aatgcgatac ttggtgtgaa ttgcagaatc ccgtgaacca tcgagtcttt gaacgcaagt 360 tgcgcccgaa gccactaggc tgagggcacg cctgcctggg tgtcacgcat cgtattgcct 420 gcagaccact cacacctgag aagttgtgac ggtttggggc gcaaattggc ctcccgtacc 480 ttgtcgtgcg gttggcggaa aaacgagtct ccggcgacgg atgtcgcgac atcggtggtt 540 gtgaaagacc ctcttgtctt gtcgcgcgag tccccgtcat cttagcgagc tccaggaccc 600 ataggcagca cacactctgt gcgcttcgac tgtgacccca ggtcaggcgg gactacccgc 660 tgagtttaag catatcaata agcggagga 689 <210> 4 <211> 693 <212> DNA <213> Peucedanum praeruptorum <400> 4 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg tcgaatcctg caacagcaga atgacccgct 60 aacacgtcaa caatttgggc aagcgtcggg gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccttg 120 gtaggtggcc actcccgggt tgccactggc cttcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc 180 aaggacctta aaaactgaat tgtacgtccg tatcccgtta gcgggcagcg gcgtcgttct 240 aaaacacaac gactctcgac aacggatatc tcggctctcg catcgatgaa gaacgtagcg 300 aaatgcgata cttggtgtga attgcagaat cccgtgaacc atcgagtctt tgaacgcaag 360 ttgcgcccga agccattagg ttgagggcac gtctgcctgg gtgtcacgca tcgtctttgc 420 ccacaaacca ctcacacctg agaagttgtg tcggtttggt ggcggaaact ggcctcccgt 480 accttgttgt gcggttggcg gaaaaatgag tctccggcga cggacgtcgc gacatcggtg 540 gttgtaaaag accctcttgt attgtcgtac gaatcctcgt cgtcttaaga gagattcagg 600 acccttaggc agcacacact ctgtgcgctt cgactgtgac cccaggtcag gcgggaccac 660 ccgctgagtt taagcatatc aataagcgga gga 693 <210> 5 <211> 694 <212> DNA <213> Anthricus sylvestris <400> 5 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg tcgaatcctg ctcaagcgga atgacccgtt 60 aactcgttaa aacatcgggc aagcgttagg gggcccaagg tcccctcttt gcgatcccgt 120 ggtggttgtc ccctcacggg tgtcaaccaa ccaaataaat caaccgggcg ctgacggcgc 180 caaggaaatt aatattgaat tgattgttag cttctcgttc gcgggaagcg gcgtcaatct 240 gaaacacaaa tgactctcgg caacggatat cccggctctc gcatcgatga agaacgtagc 300 gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac cattgagtct ttgaacgcaa 360 gttgcgcccg aagccactag gctaagggca cgtctgcctg ggtgtcacgc atctagttgc 420 cccctgacca actaatcttc taagagattt tgtcggtttg ggggcggaaa ttagcctcct 480 gtgccatgtt gtgcggctgg cgtaaaactg agtctatggt gacgaatgtc acgacatcgg 540 tggttgtaag aagaccttct tgtcttgtcg tgtgaatgtc cgtcatctta taaggctcaa 600 tgacccttag gcgccaaaaa ctttggcact tcgattgtga ccccaggtca ggcgggatta 660 cccgctgagt ttaagcatat caataagcgg agga 694 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 556 S <400> 6 ggtgtcaaca accaaata 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 273 S <400> 7 ccctgaccaa ctaatcttc 19 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-11 <400> 8 caatcgccgt 10 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-12 <400> 9 tcggcgatag 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-13 <400> 10 cagcacccac 10 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-14 <400> 11 tctgtgctgg 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-15 <400> 12 ttccgaaccc 10 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-16 <400> 13 agccagcgaa 10 <210> 14 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-17 <400> 14 gaccgcttgt 10 <210> 15 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-18 <400> 15 aggtgaccgt 10 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-19 <400> 16 caaacgtcgg 10 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA-20 <400> 17 gttgcgatcc 10 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-11 <400> 18 aaagctgcgg 10 <210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-12 <400> 19 tgtcatcccc 10 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-13 <400> 20 aagcctcgtc 10 <210> 21 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-14 <400> 21 tgcgtgcttg 10 <210> 22 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-15 <400> 22 gacggatcag 10 <210> 23 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-16 <400> 23 cacactccag 10 <210> 24 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-17 <400> 24 ttccccccag 10 <210> 25 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-18 <400> 25 tgagtgggtg 10 <210> 26 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-19 <400> 26 gttgccagcc 10 <210> 27 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC-20 <400> 27 acttcgccac 10 <210> 28 <211> 383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JA16-1 <400> 28 agccagcgaa ttgaggatga taaggggtag ccaacctatg ggtaattgag tactttttca 60 aaagagactc aaattggtga ttcttaaagt gcgtgccttg gtcactaatg atagctcgag 120 gtgtgccaaa tcgagaaaag atattctctt ttaggaattt aagaacgacc ttgttatcat 180 tggacctagt tggtatggct tctacccact tagaaacgta atcaaccgct aagagaatgt 240 agaggttgcc gaacgaatta ggaaagggac ccataaaatc aatcccccac acgtcgaaaa 300 tttcaatgat aaggatggga gtcattggca tcatgtttct tctcgtgatc tttcctaagt 360 gttgacacct actttcgctg gct 383 <210> 29 <211> 608 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JA17-2 <400> 29 gaccgcttgt tataaatccg gtgatggggg agaataagat ctggaaagtc ctgatcgatg 60 aagggagttc ggtcaacatc ttgtatcacc ggacatattg caaaatgaac ttgggaggcg 120 aacaactaga gccatgccat gaagcaccgc tatacggctt cggtaatcaa cctgtaccga 180 tcgaaggaac tataacactg aacgtcttat taggaaaagc accattcaca acgatgaaag 240 aggcgaaatt ttacgttgtt agagtcgaca gcccgtataa tgggatcctg ggaagacctg 300 ctttatccct attccaagct gtgtcatcta tccctcactt gaaattgaaa tttccaaccg 360 aacacggggt cggagaaatg aggggcgacc aaaaagcagc acgaatcatt atgttggaag 420 acctggagaa agaaaaagtt gtcgaaatga ccgaagccgg gaaaagaaga agaaatgaga 480 ccgaaccagg aggcagtcac caactgctga atatcgagtt ggagaaattt ggagccgacc 540 tgtcaaatcc gatagccgaa ccggctgtcg aaaccgaaga agttgaatta tacgtaggac 600 aagcggtc 608 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JA16-1 S <400> 30 ttgaggatga taaggggtag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JA16-1 AS <400> 31 cctaagtgtt gacacctact 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JA17-2 S <400> 32 atccggtgat gggggagaat 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JA17-2 AS 1 <400> 33 gaagcaccgc tatacggctt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JA17-2 AS 2 <400> 34 ctttatccct attccaagct 20

Claims

서열번호 5로 기재된 토전호(Anthricus sylvestris (L.) Hoffman) 품종 판별용 폴리뉴클레오티드.
서열번호 29로 기재된 백화전호(Peucedanum praeruptorum Dunn.) 품종 판별용 폴리뉴클레오티드.
서열번호 28로 기재된 바디나물[Angelica decursiva Franch. et Savatier (=Peucedanum decursivum Maxim.)] 및 백화전호 품종 판별용 폴리뉴클레오티드.
서열번호 5로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 토전호 품종 판별용 프라이머 쌍.
제 4항에 있어서, 서열번호 5으로 기재되는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 각각 서열번호 6 또는 서열번호 7 및 서열번호 2로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
서열번호 29로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍.
제 6항에 있어서, 서열번호 29로 기재되는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 각각 서열번호 32 및 서열번호 33 또는 서열번호 34으로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
서열번호 28로 기재되는 서열 내에서 선택되는, 15 ~ 50 개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 바디나물 및 백화전호 품종 판별용 프라이머 쌍.
제 8항에 있어서, 서열번호 28로 기재되는 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 각각 서열번호 30 및 서열번호 31로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
제 4항의 프라이머 쌍을 포함하는 토전호 품종 판별용 키트.
제 6항의 프라이머 쌍을 포함하는 백화전호 품종 판별용 키트.
제 8항의 프라이머 쌍을 포함하는 바디나물 및 백화전호 품종 판별용 키트.
제 4항, 제 6항 및 제 8항의 프라이머 쌍을 모두 포함하는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종 판별용 키트.
1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;

2) 제 4항, 제 6항 및 제 8항의 프라이머를 이용하여 단계 1)의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,

3) 단계 2)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 바디나물, 백화전호 및 토전호 품종을 판별방법.
제 14항에 있어서, 단계 1)의 시료는 바디나물, 백화전호 및 토전호 자체 또는 상기 바디나물, 백화전호 및 토전호가 포함된 것으로 예상되는 식품인 것을 특징으로 하는 판별방법.
제 14항에 있어서, 단계 2)의 프라이머는 판별하고자 하는 품종에 따라 각각 또는 두 가지 이상의 프라이머를 혼합하여 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 판별방법.