KR20180075451A

KR20180075451A - 체리 대목 품종 판별 방법

Info

Publication number: KR20180075451A
Application number: KR1020180068696A
Authority: KR
Inventors: 최철; 김기훈; 한아름
Original assignee: (주)에그리바이오텍
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2018-07-04

Abstract

본 발명은 형태학적 또는 생리학적으로 유사한 품종들을 판별함에 있어 시간을 단축 시킬 수 있음은 물론, 주관적인 결정이 아닌 분자생물학적 프라이머를 사용하여 체리 품종 판별을 가능하게 하는 체리 대목 품종 판별 방법에 관한 것으로,
체리 대목 '기슬라(Gisela) 5', '기슬라(Gisela) 6', '산벚나무(Sargent cherry)', '대련(Dalian)' ,'콜트(Colt)' 중 선택된 어느 하나의 체리 대목 DNA를 추출하는 것과, 추출한 체리 대목 DNA에 중합효소반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 추출된 DNA를 증폭시키는 것과, 상기 증폭 산물을 검출하는 것과, 검출한 산물은 반복염기서열 분석법(Simple Sequence Repeat, SSR)을 통해 품종 간 다형성을 탐색하고 증폭되는 차이에 따라 체리 대목을 판별하도록 한 것이다.

Description

체리 대목 품종 판별 방법{Identification method the variety of Cherry Rootstock}

본 발명은 체리 대목 품종 판별 방법에 관한 것으로 더욱 상세히는 형태학적 또는 생리학적으로 유사한 품종들을 판별함에 있어 시간을 단축 시킬 수 있음은 물론, 주관적인 결정이 아닌 분자생물학적 프라이머를 사용하여 체리 품종 판별을 가능하게 하는 체리 대목 품종 판별 방법에 관한 것이다.

체리는 장미과에 속하는 과수로 유럽 서부에서 터키에 걸친 지역을 원산지로 하는 유럽계와, 현재의 중국 부근을 원산지로 하는 동아시아계의 두 계통이 있으며, 우리나라에는 조선말 중국, 미국, 유럽으로부터 도입되었다.

체리는 여러 과수류 중에서도 새로운 소득 작물로 인식이 되어 최근 재배면적이 늘어나고 있고 소비자들로부터도 관심을 받는 과수 중 하나이며, 과수 중에서 수확기가 가장 빠르고 경제성이 좋은 작물로 농가 소득의 증대에 이바지하고 있는 추세에 있다.

이러한 체리는 보통 대목과 접목하여 재배하는데 이러한 대목의 사용은 관리가 편리하고, 단위면적당 수확량이 좋으며, 결과 최소 수령이 단축된다는 장점이 있다.

체리 대목의 종류에는 크게 왜성 대목과 일반 대목이 있으며, 왜성 대목으로는 '기슬라(Gisela) 5', '기슬라(Gisela) 6' 가 있고, 일반 대목으로는 '산벚나무(Sargent cherry)', '대련(Dalian)' 그리고 학술적으로 준표준형(semi-standard)으로 분류되는 '콜트(Colt)' 가 있다.

체리나무의 크기가 작으면 밀식을 하여 단위면적당 생산 수량을 증가시킬 수 있고, 관리가 수월하다는 장점이 있기 때문에 유럽과 미국 등에서는 최근 'Gisela 5'의 인기가 상당히 높은 것으로 알려져 있다.

일반 대목으로 분류되는 'Sargent cherry'는 척박한 토양에서도 왕성한 생장력을 보이며 내한성, 내공해성이 좋으며, 'Dalian'은 중국의 대련 연구소에서 개발된 대목으로 꽃눈 형성이 빠르고, 착과량이 비교적 많은 특징을 갖고 있다.

이밖에 준표준형인 'Colt'는 일반 대목에 비해 착과량이 많고 조기결실성과 풍산성을 나타내며, 뿌리 분포가 넓고 생장도 좋으며 접목친화성이 높고 유합이 잘 된다. 유목기에 생육이 왕성하지만 이후 수세가 완화되는 특징이 있다.

이렇듯 체리 대목은 각각이 갖는 품종별 특성이 다르기 때문에 그에 알맞은 생육환경을 제공할 경우 생산량이 향상되고 품질이 우수한 과실을 수확할 수 있는데 종전에는 체리의 형태학적 및 생리학적 특성을 품종 판별의 도구로 이용하였다.

그러나 상기 방법은 많은 시간 소요되고, 비용이 많이 들며 종종 주관적인 결정에 의해 이루어지는 단점이 있었다.

한편, 국제식물신품종보호연맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV)에서는 다유전적(multigenic), 양적 및 환경적인 요인이 체리 품종 특성의 발현에 영향을 미치기 때문에, 체리 품종 판별을 분자생물학적 프라이머를 사용하도록 요청하고 있다.

본원 발명과 관련된 선행기술로는 공개특허 제10-2013-0097971호(발명의 명칭 : 왜성 체리 묘목 생산방법)가 있으나, 이는 나무의 키가 높게 자라지 않는 왜성 체리 묘목을 1년 안에 생산하여 [0001] 농가에 공급할 수 있도록 하는 묘목 생산 방법에 관한 것이며, 본원 발명과 같이 품종을 판별하는 기술분야와는 상당한 차이가 있다.

1. 공개특허 제10-2013-0097971호(발명의 명칭 : 왜성 체리 묘목 생산방법)

이에 본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 인식하여 그 해결책을 제시한 것으로 형태학적 또는 생리학적으로 유사한 품종들을 판별함에 있어 시간을 단축 시킬 수 있음은 물론, 주관적인 결정이 아닌 분자생물학적 프라이머를 사용하여 체리 품종 판별을 가능하게 하는 체리 대목 품종 판별 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 형태학적 특성이 잘 나타나지 않는 유목기의 품종을 판별함으로써 체리 품종의 혼입을 사전에 차단할 수 있도록 함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본원 발명의 체리 대목 품종 판별 방법은,

체리 대목 '기슬라(Gisela) 5', '기슬라(Gisela) 6', '산벚나무(Sargent cherry)', '대련(Dalian)' ,'콜트(Colt)' 중 선택된 어느 하나의 체리 대목 DNA를 추출하는 것과, 추출한 체리 대목 DNA에 중합효소반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 추출된 DNA를 증폭시키는 것과, 상기 증폭 산물을 검출하는 것과, 검출한 산물은 반복염기서열 분석법(Simple Sequence Repeat, SSR)을 통해 품종 간 다형성을 탐색하고 증폭되는 차이에 따라 체리 대목을 판별하도록 한 것을 특징으로 한다.

이때 상기 DNA 추출은 놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용한 추출방법 중 선택된 어느 하나의 방법으로 추출하는 것을 특징으로 한다.

또한, 추출된 DNA를 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 중 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군을 통해 증폭할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 중 선택된 어느 하나의 방법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 검출할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 체리 대목 판별은 KNUCR1 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 151bp/160bp, 콜트(Colt)는 137bp/150bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 154bp/165bp, 대련(Dalian)은 159bp/179bp이며, KNUCR2 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 173bp, 콜트(Colt)는 157bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 135bp, 대련(Dalian)은 127bp/157bp이며, KNUCR3 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 139bp, 콜트(Colt)는 124bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 132bp,대련(Dalian)은 97bp/121bp이며, KNUCR4 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와6)은 154bp/164bp, 콜트(Colt)는 150bp/182bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 161bp/168bp, 대련(Dalian)은 166bp/178bp이며, KNUCR5 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 180bp/231bp, 콜트(Colt)는 189bp/202bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 195bp/213bp, 대련(Dalian)은 197bp이며, KNUCR6 프라이머 세트를 이용시 결과, 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 165bp/173bp, 콜트(Colt)는 164bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 170bp/190bp, 대련(Dalian)은 156bp이며, KNUCR7 프라이머 세트를 이용시 SSR 분석 결과 168bp/199bp는 기슬라 5, 6(Gisela 5,6), 147bp/169bp는 콜트(colt), 192bp는 산벚나무(Sargent cherry), 162bp는 대련(Dailan)이며, KNUCR8 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 131bp, 콜트(Colt)는 113bp/127bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 120bp/134bp, 대련(Dalian)은 116bp/131bp이며, KNUCR9 프라이머 세트를 이용시, 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 118bp/155bp, 콜트(Colt)는 153bp/160bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 142bp/154bp, 대련(Dalian)은 106bp/114bp이며, KNUCR10 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 168bp/177bp, 콜트(Colt)는 183bp/215bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 187bp 그리고 대련(Dalian)은 216bp/231bp이며, KNUCR11 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 109bp/117bp, 콜트(Colt)는 117bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 101bp 그리고 대련(Dalian)은 118bp이며, KNUCR12 프라이머 세트를 이용시 SSR 분석 결과, 89bp/126bp는 기슬라 5, 6(Gisela 5, 6), 126bp는 콜트(colt), 131bp는 산벚나무(Sargent cherry), 107bp는 대련(Dailan)이라는 것으로 판별하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 특징으로 구성되는 본원 발명의 체리 대목 품종 판별 방법은 체리 대목의 품종을 신속하고 간편하게 판별할 수 있으며, 이로 인해 체리의 품종 보호 및 생산, 품질관리를 효율적으로 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 체리 대목에서 시험 된 22개의 프라이머 쌍에 대한 단편 크기(bp)를 나타낸 결과 도면
도 2는 SSR 검출용 프라이머 세트 KNUCR7을 이용하여 체리 대목 품종을 판별한 결과를 나타낸 도면
도 3은 SSR 검출용 프라이머 세트 KNUCR12을 이용하여 체리 대목 품종을 판별한 결과를 나타낸 도면
도 4는 SSR 검출용 프라이머 세트 12쌍을 이용하여 체리 대목 품종 5개 유연관계 분석한 결과를 나타낸 도면

이하, 첨부된 도면 및 바람직한 실시 예에 따라 본 발명에서 제공하는 체리 대목 품종 판별 방법을 설명하면 하기와 같다.

먼저, 본원 발명의 체리 대목 품종 판별 방법은 체리 대목 '기슬라(Gisela) 5', '기슬라(Gisela) 6', '산벚나무(Sargent cherry)', '대련(Dalian)' ,'콜트(Colt)' 중 선택된 어느 하나의 체리 대목 DNA를 추출한다.

상기 DNA 추출은 놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용한 추출방법 중 선택된 어느 하나의 방법으로 추출할 수 있으며 본원 발명에서는 묘목 농원의 체리 묘목을 경정배양(shoot tip)한 체리 대목 품종의 유엽을 아래의 2가지 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다.

첫 번째는 퀴아젠(QIAGEN)사의 DNeasy plant mini kit 매뉴얼을 참고하여 DNeasy plant mini kit를 사용하였으며, 실험순서는 재료 100mg을 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 AP1 buffer 500㎕를 첨가하여 500㎕를 E-tube에 옮겼다.

RNase 4㎕를 첨가하여 65℃에 30분간 반응시킨 후 P3을 넣어 얼음에 5분 동안 처리하였다. 원심분리(14,000rpm, 6분)하여 상층 액을 새로운 tube에 옮긴 후, 다시 원심분리(14,000rpm, 6분)하였다.

QIAshredder spin columm에 최대한 상층 액을 취하여 옮기고, 원심분리 (14,000, 2분)한 후, QIAshredder spin columm은 버린다.

collection tube에 하층 액 (460㎕)을 새로운 E-tube에 옮기고, Buffer AW1은 옮긴 양의 1.5배에 해당하는 양 (690㎕)을 첨가한 후, DNeasy Mini spin columm에 600㎕을 옮겨놓고 원심분리(8,000rpm, 1분)하였다.

Buffer AW2를 500㎕ 넣고, 원심분리(8,000rpm, 1분)한 후, 걸러져 내려온 여과액은 버리고, 100% EtOH 500㎕를 첨가한 후, 원심분리(14,000rpm, 2분)하여 여과액은 다시 버린 후 새로운 E-tube에 다시 옮긴 다음 AE 100㎕를 첨가한다. 상온에 10분 동안 처리하고, 원심분리(14,000rpm, 1분)하였다.

두 번째 방법으로는 Lodhi et al. 의 CTAB(cetyl-tri-methyl ammonium bromide) 방법을 변형하여 이용하였다.

시료 100㎎을 액체질소를 이용하여 막자사발에 마쇄한 후 DNA 추출 완충액(extraction buffer)(100mM Tris-HCl(pH 8.0), 500mM NaCl 및 50mM EDTA), 400㎕와 2×buffer(2% CTAB, 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.4M NaCl, 20mM EDTA(pH 8.0) 및 1% PVP-40), β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 10mM 혼합용액 400㎕ 및 10% SDS 10㎕를 첨가하여 섞었다.

상기 시료를 1.5㎖ 튜브에 옮겨 65℃에서 20분간 반응시킨 후 5M KOAc(potassium acetate) 200㎕를 첨가하여 얼음에 20분간 처리하였다. 700㎕의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알코올(Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol)(25:24:1 부피비)을 첨가한 후 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층 액 700㎕을 취한 뒤 새 튜브에 옮겼다.

상기 튜브에 상기 상층 액과 부피 비가 1:1이 되도록, 클로로포름 : 이소아밀알코올(24:1 부피비)을 700㎕ 첨가하여 다시 14,000rpm에서 10분간 원심분리 후 상층 액을 얻어 새 튜브에 옮겼다.

상기 튜브에 차가운 이소프로페놀(isopropanol)을 첨가하여 -70℃에서 10분간 처리한 후, 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층 액을 버리고 70% EtOH 1㎖를 첨가하여 원심분리하였다. 상기 원심분리된 튜브에서 펠렛을 제외한 나머지를 버리고 건조 시킨 후 멸균 수 50㎕로 녹였다. 상기 시료에 RNase(10㎎/㎖) 2㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 이상 처리한 뒤 -20℃에서 저장하여 DNA를 추출하였다.

상기와 같은 방법을 통해 추출한 체리 대목 DNA를 증폭시키는데 이러한 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 중 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군을 통해 증폭할 수 있다.

본원 발명에서는 기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 사과 속 식물에서 추출된 게놈 DNA와 도 1에서 도시된 바와 같이 본 발명에서 제공되는 SSR 검출용 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충 용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2,KCl등을 포함한다. 이 때 MgCl2농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다.

상기와 같이 추출한 DNA를 증폭하고 나면, 증폭한 산물을 검출한다. 이때 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 중 선택된 어느 하나의 방법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 검출할 수 있다.

상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬 광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

상기 검출한 산물은 반복염기서열 분석법(Simple Sequence Repeat, SSR)을 통해 품종 간 다형성을 탐색하고 증폭되는 차이에 따라 체리 대목을 판별하도록 한 것이 본원 발명의 핵심이다.

이렇듯 체리 대목 품종 판별은 도 1에서 도시된 바와 같이 Primer set를 12쌍을 이용하여 PCR product를 Fragment Analysis 수행 후 Pro size 2.0을 이용하여 분석한 결과, 프라이머 세트에 대한 각 품종별로 확인된 대립유전자의 크기(base pair, bp)를 확인하였으며, 표현형에 큰 차이를 보이지 않는 체리 대목 품종을 정확하게 판별할 수 있었다. Gisela series(Gisela 5, Gisela 6)와 Colt, Sargent cherry, Dalian은 유전자형 결과(bp)가 특이적으로 나타남으로써 품종 구별이 가능하였다(그러나 유전적 유사도가 높은 Gisela series(Gisela5,6) 간의 판별은 어려웠다).

보다 구체적으로 도 1을 참조하면, KNUCR1 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 151bp/160bp, 콜트(Colt)는 137bp/150bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 154bp/165bp 그리고 대련(Dalian)은 159bp/179bp를 하였다.

KNUCR2 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 173bp, 콜트(Colt)는 157bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 135bp 그리고 대련(Dalian)은 127bp/157bp를 확인하였다.

KNUCR3 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 139bp, 콜트(Colt)는 124bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 132bp 그리고 대련(Dalian)은 97bp/121bp를 확인하였다.

KNUCR4 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 154bp/164bp, 콜트(Colt)는 150bp/182bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 161bp/168bp 그리고 대련(Dalian)은 166bp/178bp를 확인하였다.

KNUCR5 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 180bp/231bp, 콜트(Colt)는 189bp/202bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 195bp/213bp 그리고 대련(Dalian)은 197bp를 확인하였다.

KNUCR6 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 165bp/173bp, 콜트(Colt)는 164bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 170bp/190bp 그리고 대련(Dalian)은 156bp를 확인하였다.

KNUCR7 프라이머 세트를 이용한 SSR 분석 결과 168bp/199bp는 기슬라 5,6(Gisela 5,6), 147bp/169bp는 콜트(colt), 192bp는 산벚나무(Sargent cherry), 162bp는 대련(Dailan) 이라는 것을 확인하였다.

KNUCR8 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 131bp, 콜트(Colt)는 113bp/127bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 120bp/134bp 그리고 대련(Dalian)은 116bp/131bp를 확인하였다.

KNUCR9 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 118bp/155bp, 콜트(Colt)는 153bp/160bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 142bp/154bp 그리고 대련(Dalian)은 106bp/114bp를 확인하였다.

KNUCR10 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 168bp/177bp, 콜트(Colt)는 183bp/215bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 187bp 그리고 대련(Dalian)은 216bp/231bp를 확인하였다.

KNUCR11 프라이머 세트를 이용한 결과, 기슬라 5,6(Gisela 5와6)는 109bp/117bp, 콜트(Colt)는 117bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 101bp 그리고 대련(Dalian)은 118bp를 확인하였다.

KNUCR12 프라이머 세트를 이용한 SSR 분석 결과, 89bp/126bp는 기슬라 5,6(Gisela 5,6), 126bp는 콜트(colt), 131bp는 산벚나무(Sargent cherry), 107bp는 대련(Dailan) 이라는 것을 확인하였다.

결과를 통해 Gisela series, Colt, Sargent cherry, Dalian 품종들 간의 PCR product가 증폭된 size(peak) 차이를 확인함으로써 품종 판별이 가능하였으며, 품종을 형태학적이나 육안으로 판별하는 것에 비해 객관적 판단이 가능하였다.

도 2에서 도시된 바와 같이 KNUCR7 primer set를 이용한 PCR product를 Fragment Analysis 수행 후 Pro size 2.0을 이용하여 분석한 결과, 프라이머 세트에 대한 각품종별 확인된 대립유전자의 크기(base pair, bp)를 확인하였으며, 이 중 Gisela 5, Gisela 6 (168bp, 199bp)와 Colt (147bp, 169bp), Sargent cherry (192bp), Dalian (162bp)으로 유전자형 결과(bp)가 특이적으로 나타남으로써 품종 구별이 가능하였다.

또한, 도 3에서 도시된 바와 같이 KNUCR12 primer set를 이용한 PCR product를 Fragment Analysis 수행 후 Pro size 2.0을 이용하여 분석한 결과, 프라이머 세트에 대한 각 품종별로 확인된 대립유전자의 크기(base pair, bp)를 확인하였으며, 이 중 Gisela 5, Gisela 6 (89bp, 126bp)와 Colt (126bp), Sargent cherry (131bp), Dalian (107bp)으로 유전자형 결과(bp)가 특이적으로 나타남으로써 품종 구별이 가능하였다.

도 2, 3의 A는 Gisela 5, B는 Gisela 6, C는 Colt, D는 Sargent cherry, E는 Dalian를 나타낸 것이다.

또한, 도 4에서 도시된 바와 같이 SSR 분석을 통한 체리 대목 품종 간 유전적 유연관계 분석을 수행하였으며, 클러스터 분석을 통해 유전적 유사도를 확인해본 결과, 0.46의 유사도에서 두 개의 그룹으로 나뉘어 졌다. 제 Ⅰ 그룹은 Gisela 5, Gisela 6 이 속하며, 이들은 1.00의 유사도를 가지며 거의 유사한 유전형을 가진다고 예상할 수 있었다. 또한, 제 Ⅱ 번째 그룹은 Colt, Sargent cherry, Dalian이 속해 있으며, Colt의 유전형보다 Sargent cherry와 Dalian이 유전적으로 가깝다는 것을 확인할 수 있었다. 즉 도 4는 품종간 유전적 유연관계를 바탕으로, 5개의 품종을 크게 2개의 그룹으로 분류한 결과라 할 수 있다.

또한, 연차 간 변이나 식물의 생육과 무관하고 시간노력을 절감할 수 있으며 분석 가능한 샘플 수가 거의 무한대라고 할 수 있다.

종자관리원에 따르면 현재까지 국내에서 개발된 유전자 분석 방법에 의한 품종식별 기술은 14 작물 3,200여 품종에 대하여 이루어져 분쟁 품종의 유사성 판정 등 종자관리에 활용되고 있으며, 분자표지의 종자관리 분야 활용은 품종보호출원시 대조품종선정(D/B 구축 완료작물), 품종보호출원시 구별성, 균일성, 안정성의 확인, 품종보호등록 품종의 특성 유지확인(사후검정)에 활용할 수 있다

상기 Primer( 프라이머 )는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존한다.

상기 다형성(polymorphism) 은 다형 형상이라고도 하며, 하나의 유전자좌에서 2개 이상의 다양한 대립형질이 존재하는 현상을 말하며 표현형과 단백질 및 DNA 수준에서도 나타난다.

상기 PCR (Polymerase chain reaction)은 중합효소 연쇄반응이라하며, 내열성 DNA 중합효소를 이용하여 단일가닥으로 DNA 탈형(denaturation), 프라이머 결합(annealing), 중합반응(polymerization)의 주기(cycle)를 반복함으로써 DNA 분자를 기내에서 증폭하는 반응이다.

상기 PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)를 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Taq DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다.

이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다.

그러나, PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다.

SSR(single sequence repeat) 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있다.

Claims

체리 대목 '기슬라(Gisela) 5', '기슬라(Gisela) 6', '산벚나무(Sargent cherry)', '대련(Dalian)' ,'콜트(Colt)' 중 선택된 어느 하나의 체리 대목 DNA를 추출하는 것과, 추출한 체리 대목 DNA에 중합효소반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 추출된 DNA를 증폭시키는 것과, 상기 증폭 산물을 검출하는 것과, 검출한 산물은 반복염기서열 분석법(Simple Sequence Repeat, SSR)을 통해 품종 간 다형성을 탐색하고 증폭되는 차이에 따라 체리 대목을 판별하도록 한 것을 특징으로 하는 체리 대목 품종 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 DNA 추출은 놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용한 추출방법 중 선택된 어느 하나의 방법으로 추출하는 것을 특징으로 하는 체리 대목 품종 판별 방법.
제1항에 있어서,
추출된 DNA를 증폭은 중합효소연쇄반응, 다중 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, 실시간 중합효소연쇄반응, 정량적 중합효소연쇄반응, DNA 칩, 등온증폭 중 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 군을 통해 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 체리 대목 품종 판별 방법.
제1항에 있어서,
상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 중 선택된 어느 하나의 방법 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 체리 대목 품종 판별 방법.
제1항에 있어서,
체리 대목 판별은 KNUCR1 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 151bp/160bp, 콜트(Colt)는 137bp/150bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 154bp/165bp, 대련(Dalian)은 159bp/179bp이며, KNUCR2 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 173bp, 콜트(Colt)는 157bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 135bp, 대련(Dalian)은 127bp/157bp이며, KNUCR3 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 139bp, 콜트(Colt)는 124bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 132bp,대련(Dalian)은 97bp/121bp이며, KNUCR4 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와6)은 154bp/164bp, 콜트(Colt)는 150bp/182bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 161bp/168bp, 대련(Dalian)은 166bp/178bp이며, KNUCR5 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 180bp/231bp, 콜트(Colt)는 189bp/202bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 195bp/213bp, 대련(Dalian)은 197bp이며, KNUCR6 프라이머 세트를 이용시 결과, 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 165bp/173bp, 콜트(Colt)는 164bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 170bp/190bp, 대련(Dalian)은 156bp이며, KNUCR7 프라이머 세트를 이용시 SSR 분석 결과 168bp/199bp는 기슬라 5, 6(Gisela 5,6), 147bp/169bp는 콜트(colt), 192bp는 산벚나무(Sargent cherry), 162bp는 대련(Dailan)이며, KNUCR8 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 131bp, 콜트(Colt)는 113bp/127bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 120bp/134bp, 대련(Dalian)은 116bp/131bp이며, KNUCR9 프라이머 세트를 이용시, 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 118bp/155bp, 콜트(Colt)는 153bp/160bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 142bp/154bp, 대련(Dalian)은 106bp/114bp이며, KNUCR10 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 168bp/177bp, 콜트(Colt)는 183bp/215bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 187bp 그리고 대련(Dalian)은 216bp/231bp이며, KNUCR11 프라이머 세트를 이용시 기슬라 5, 6(Gisela 5와 6)은 109bp/117bp, 콜트(Colt)는 117bp, 산벚나무(Sargent cherry)는 101bp 그리고 대련(Dalian)은 118bp이며, KNUCR12 프라이머 세트를 이용시 SSR 분석 결과, 89bp/126bp는 기슬라 5, 6(Gisela 5, 6), 126bp는 콜트(colt), 131bp는 산벚나무(Sargent cherry), 107bp는 대련(Dailan)이라는 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는 체리 대목 품종 판별 방법.