KR20160095213A - 수박의 과형 구별용 dna 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수박의 과형 구별용 DNA 마커에 관한 것으로서, 상세하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 수박 과형 구별용 wsb3-24 DNA 마커를 제공한다. 또한, 상기 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 수박 과형 구별용 키트 및 수박 과형 구별 방법을 제공한다. 이러한 DNA 마커를 이용하여 다양한 수박 과형을 지닌 품종을 매우 신속하고 정확하게 육성함으로써 종자회사의 육종프로그램에 크게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

수박의 과형 구별용 DNA 마커{DNA marker for selecting fruit shape of watermelon}
본 발명은 수박의 과형 구별용 DNA 마커에 대한 것이다.
수박은 Cucurbitaceae 과의 유실 작물로서, 아프리카에서 기원한 것으로 알려져 있으며, 아프리카, 중앙아시아 및 지중해의 온대지역에서 재배된다. 수박은 11개의 배우자 염색체 (2n=2x=22)를 가지고 있고, 유전체의 크기는 약 425 Mb이다. 수박은 건생종 Citrullus Schrad. Ex Eckl. et Zeyh.에 속하는데, 4개의 배수체로 이루어진다: 1년생, 야생종 또는 재배종, Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai; 2년생, 야생종, C. colocynthis (L.) Schrad and C. ecirrhosus Cogn.; 및 1년생, 야생종, C. rehmii De Winter. C. lanatus는 널리 재배되는 단맛의 붉은 과육을 지니는 수박인 C. lanatus var. lanatus와 고대 재배종의 보존된 멜론 타입인 C. lanatus var. citroides의 아종으로 나뉜다.
수박(C. lanatus var. lanatus)은 세계적으로 가장 인기있는 과일 중 하나로서, 수분, 당, 풍미와, 라이코펜(lycopene), 시트룰린(citrullin) 및 아르기닌(arginine)과 같은 많은 영양소를 함유하고 있다. 2012년 수박의 세계적인 순생산량은 1억 537만 2천톤으로 추정되며, 아시아 대륙이 가장 많고(생산량의 83.3%), 다음으로 북미(5.8%), 유럽(5.1%), 아프리카(5.6%) 및 오세아니아(0.1%)의 순서이다(http://www.fao.org). 한국에서 수박은 2012년 203만 달러의 농장 생산 가치 및 14,885ha의 재배 면적을 갖는 주요 작물이다. 한국은 세계에서 8번째로 수박을 많이 생산하는 국가이다.
분자 마커들을 활용한 육종 프로그램이 상기 특성들의 효과적인 유전자이입을 촉진하여, 종자 시장 수요를 만족시킬 수 있는 우수한 수박 품종을 개발할 수 있다. 중요 형질들과 강하게 연관된 분자 마커들은 분자마커이용선발(marker-assisted selection; MAS)에 유용하게 사용될 수 있는데, 이는 마커 유전자형을 기초로 상기 형질들을 선택함으로써 품종 개량 공정을 촉진시킬 수 있다. 수박에 있어서는 유전자 지도 구축을 통해 여러 분자 마커들이 개발되고 있다. C. lanatus var. lanatus에서는 유전적 배경 및 다형성이 부족하여, 일찍부터 C. lanatus var. lanatus 및 var. citroides 사이의 종내 교차를 기초로 한 유전자 지도 구축이 수행되었다. 최근 차세대 서열분석(Next Generation Sequencing; NGS)과 같은 유전체 서열분석 기술이 발달함에 따라, 수박에 대한 참조 유전체 서열을 공개적으로 얻을 수 있고 (Cucurbit Genome Database, http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome), 관련 품종을 포함하는 다양한 수박 품종의 전체 유전체 재서열분석 결과도 보고되고 있다. 수박에서 전체 유전체 또는 전사체의 NGS는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)과 같은 많은 세트의 서열 변이의 발견을 상당히 촉진시켰고, 고해상도의 종내 유전자 지도 구축 및 양적 형질 유전자좌(qualitative trait loci; QTL) 분석을 가능하게 했다. 하지만, 유전체 연구의 발전에도 불구하고, 내병성 및 중요 원예 형질들에 대한 분자 마커들은 참조 유전체 서열이 밝혀져 있는 다른 작물과 비교하여 매우 제한적이다.
수박의 과형은 장타/단타/원형으로 크게 구분되는데 소비시장이나 국가에 따라 선호하는 과형이 달라 중요한 육종목표 형질이 되고 있다. 하지만 과형 형질은 환경의 영향을 다소 받으며, 형질을 확인하기 위해 과수확 시기까지 재배를 한 후 선발해야 한다는 어려움 때문에 표현형에 기반한 선발육종에 한계가 있다. 따라서 과형을 유묘단계에서 구분할 수 있는 분자 마커를 개발하여 분자마커이용선발 육종에 활용함으로서 육종연한 단축 및 소요경비를 절감할 수 있다.
미국공개특허 US20140041078(2014.02.06 공개)
본 발명의 목적은 수박 과형 구별용 마커 및 이를 이용한 수박 과형 구별 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 수박 과형 구별용 wsb3-24 DNA 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 수박 과형 구별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 과형 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 수박 과형 구별 방법을 제공한다.
본 발명은 수박의 과형 구별용 DNA 마커에 관한 것으로서, 수박의 신품종 육성에 요구되는 과형(원형/타원형) 형질을 선발해 낼 수 있는 DNA 마커를 유전자 지도작성과 QTL 분석 방법으로 개발하였다. 이러한 DNA 마커를 이용하여 다양한 수박 과형을 지닌 품종을 매우 신속하고 정확하게 육성함으로써 종자회사의 육종프로그램에 크게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 'Arka Manik'×'TS34' 교배로부터 유래한 F2 개체군을 통해 구축된 종내 유전자지도의 과형(fruit shape; FS)에 대한 주동 QTL이 위치한 한 연관군(linkage group)을 나타낸다. 좌측의 숫자들은 각 유전체의 상단으로부터의 cM 거리를 나타낸다. QTL 측면의 가장 짧게 연관된 마커들의 간격을 통해 QTL 위치를 확인하였다. FS의 주동 QTL은 굵은 바로 표시하였다.
도 2는 과형(fruit shape; FS)에 대한 주동 QTL 측면 ETS 마커인 wsb3-24로 'Arka Manik'과 'TS34'를 PCR 증폭한 후 제한효소 HincII로 처리하여 아가로스 젤 전기영동한 이미지를 나타낸다. PCR 증폭산물(약 1500 bp)이 wsb3-24 프라이머 세트가 제작된 전사체 서열(394 bp)보다 큰 이유는 인트론 서열의 존재로 유추된다.
이에, 본 발명자들은 수박에서 과형에 대한 주동 QTL을 확인하고, 상기 QTL과 연관된 발현-서열 태그(expressed-sequence tagged; EST) 마커를 개발하였다. 상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 NGS에 의해 밝혀진 전사체 서열 변이를 기초로 한 종내 유전자지도를 구축하였다. 이러한 결과는 과형을 포함한 과실 특성 관련 수박 신품종을 개발하기 위한 품종 개량 프로그램에 실질적으로 응용하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 수박 과형 구별용 wsb3-24 DNA 마커를 제공한다. 상세하게는, 상기 wsb3-24 DNA 마커는 제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커이다.
서열번호 1은 'Arka Manik'에서 증폭되는 wsb3-24 DNA 마커 염기서열이며, 서열번호 2는 'TS34'에서 증폭되는 wsb3-24 DNA 마커 염기서열이다.
본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
본 발명에 있어서, "분자 마커" 또는 "DNA 마커"는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 분자 마커 또는 DNA 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로, 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite)나 유전자 염기 서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, "제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커"는 SNP처럼 한 개의 염기서열이 변하거나 InDel에 의해 발생하는 제한효소에 의해 잘리는 부위의 변화를 해석할 수 있는 마커이다. CAPS 마커는 유전자좌에 특이적인 프라이머로 PCR 증폭을 한 후 제한효소로 잘라준 뒤 나타나는 다형성을 분석하는 방법이다.
본 발명에 있어서, "양적 형질 유전자좌(qualitative trait loci; QTL)"는 양적형질에 연관(association)되어 영향을 끼치는 유전체의 지역으로 정의되는데 개념적으로 QTL은 한 개의 형질에 영향을 끼치는 다수 유전자들, 또는 이들 유전자들에 강하게 연관(likage)된 군집을 말한다.
본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 수박 과형 구별용 프라이머 세트를 제공한다. 서열번호 3의 프라이머는 5'- CCATAATCCGATCCAATGCT-3'이고, 서열번호 4의 프라이머는 5'-GGAAAGGGATGGGTGAAAGT-3'이다
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 과형 구별용 키트를 제공한다.
상기의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2+와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
한편, 프라이머 세트가 CAPS 마커를 포함하는 경우에는 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 외에 제한효소를 필요로 한다. 즉, CAPS 마커는 증폭 반응을 수행한 후에, 해당하는 제한효소로 절단해야 증폭 산물을 구별할 수 있기 때문이다.
본 발명은 (1) 수박에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 분석하는 단계를 포함하는 수박 과형 구별 방법을 제공한다.
수박에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 젤 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서,모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 식물 재료
(1) 유전자 지도 구축
인도에서 크림슨-타입(Crimson-type)을 상업화한 방임 수분(open pollinated; OP) 품종 'Arka Manik'(AM)과 한국에서 개발된 쥬빌리-타입(Jubilee-type) 근친교배주 'TS34'(TS)를 EST 마커 개발 및 QTL 분석을 위한 유전자 연관 지도 구축에 사용하였다. 모계 모체로서 'AM'과 꽃가루 기증자로서 'TS'를 교배함으로써 F1 식물을 만들었다. F1 식물은 자가수분되었고, F2 자손을 만들었다. 그 후, 상기 F2 자손들은 자가수분되었고, 총 133개의 F3 패밀리를 얻었다.
(2) 형질-연관 마커 평가
과형에 있어 주요 QTL과 연관된 EST 마커들은 형질에 있어 동형접합체인 50개의 근친교배주를 이용하여 평가하였다. 상기 근친교배주의 잎 샘플은 한국 밀양에 있는 농우바이오(주)에서 제공받았다.
2. 표현형 분석
'AM', 'TS', F1, F2 개체에 대해 과형(fruit shape; FS) 형질을 조사하였고, 상기 형질과 연관된 유전 및 마커 개발에 대해 연구하였다.
과실-관련 형질에 있어서, 5개의 'AM', 'TS', F1 식물 및 133개의 F2 식물은 2012년 태국 콘켄(Konken)에서 재배하였고, 성숙된 수박 과실을 수확하였다. 과형(원형 vs 긴 타원형) 분석은 각 수박을 위에서 아래로 잘라서 너비 및 길이를 눈금자로 측정한 후, 세로 길이에 대한 너비의 비율을 기초로 한 과형 지수(fruit shape index; FSI)로 나타냈다.
3. 전사체 분석 및 서열 변이 검출
총 RNAs는 'Arka Manik' 및 'TS34'의 한-잎 단계(one-leaf stage) 묘목으로부터 추출하였다. 품종당 3개의 식물 전체를 모아 얼린 후, 액체 질소를 사용하여 갈았다. 총 RNAs는 QIAGEN RNA purification kit을 이용하여 분리하였고, cDNA는 제조사의 지시에 따라 합성하였다. NGS 기술은 Illumina Solexa Hiseq2000 (NICEM)을 이용하여 cDNAs를 서열분석 하는데 적용하였다. 'AM' 및 'TS' 사이의 유니진(Unigene) 서열 상동성은 정렬되었고, SNP를 포함하는 서열 변이, 단순 염기반복서열(simple sequence repeat; SSR) 및 삽입/결핍(indel)을 확인하였다.
4. 유전자 지도 구축을 위한 EST -기반 마커 개발
SGN CAPS Designer tool (http://solgenomics.net/tools/caps_designer) 및 Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)를 이용하여, 제한효소 인식 사이트에 위치한 SNP를 기초로 한 제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커를 개발하였다. 효소 절단 사이트가 없는 SNPs에 대해서는 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)를 이용하여 derived-CAPS (dCAPS) 마커들을 개발하였다. 서열-특징화된 증폭 다형성(sequence-characterized amplified polymorphism; SCAR) 마커들은 Primer3를 이용하여 유니진(unigene) 서열 내 indel 부위(>5 bp) 측면의 프라이머 세트들을 제작하여 개발하였다. 제작된 프라이머들은 합성되었고(Bioneer, Daejoen, Korea), PCR 증폭하여, 'AM' 및 'TS' 사이의 다형성을 확인하였다. 상기 마커 개발을 위한 유전체 DNA 추출, 클로닝, PCR, 제한효소 및 아가로스 젤 전기영동은 이전에 보고된 대로 수행하였다(Mol. Breed. 2014, 34:949-961). 본 발명에서 새롭게 개발된 프라이머들과 더불어, 이전에 보고된 수박 EST-SSR 프라이머들이 'AM' 및 'TS' 사이의 다형성을 위해 스크리닝되었고, 유전자 지도 구축을 위해 사용되었다.
5. 유전자 지도 구축 및 QTL 분석
유전자 지도 구축을 위해, CAPS, dCAPS, SCAR 및 EST-SSR 마커들을 이용하여 터치다운(touchdown) PCR 및 아가로스 젤 전기영동을 기초로 'AM', 'TS' 및 F2 개체군의 유전자형 분석을 수행하였다. JoinMap v 4.0 software을 활용한 chi-square (X 2 ) 분석을 통해 예측 멘델 F2 비율 (1:2:1)로 분리되어 확인된 공우성(codominance) 마커들에 한하여 유전자 연관 분석에 포함시켰다. JoinMap Version 4.0 software를 이용하여 유전자 연관 지도를 구축하였는데, 여기에서 Kosambi map function 및 확률대수(logarithm of odds; LOD)-공산 점수(likelihood scores) 3.0 내지 4.0을 연관군(linkage groups; LGs) 및 유전자 거리(genetic distance; GD, cM) 결정에 대한 임계치로서 적용하였다. 연관군은 연관 유전체(chromosomes; Chr.)에 따라 명명하였다. 양적 형질 유전자좌(qualitative trait loci; QTL) 분석 및 지도화는 MapQTL v5.0 software의 MQM function을 이용하여 복합 간격 지도화(composite interval mapping; CIM)를 통해 수행하였다. 각각의 연관군 상의 유전자 지도 순서는 수박 참조 유전체 서열(Cucurbit Genome Database, http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome)를 기초로 한 물리적 위치를 비교하여 확인하였다.
< 실시예 1> 전사체 분석 및 서열 변이의 검출
'AM' 및 'TS' 유래 전체 RNAs의 NGS로부터 각각 총 3.64Gb 및 9.96Gb 데이터 세트가 제작되었는데, 이는 수박 유전체(425 Mbp) 추정 크기의 대략 10X 해독 범위(read coverage)에 해당한다. 수박 참조 유전체 서열(Cucurbit Genome Database, http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome)과 대응되는 총 2,819개의 유니진(ungenes)에서 Contig assembly를 수행하였다. 'AM' 및 'TS' 사이의 동형접합성 유니진들의 서열 비교 결과, 14,910개의 서열 변이체가 검출되었고, 이 중 7,455개는 단일 염기 불일치였다.
< 실시예 2> 유전자 지도화를 위한 EST -기반 마커들의 개발
'AM' 및 'TS' 사이의 서열 다형성(SNPs 또는 indels)을 포함하고 유전체 11 상에 고르게 분포된 전체 522개의 유니진들을 선택하였다. PCR-기반 공우성(codominant) 마커들을 개발하기 위하여, 다형성 측면의 PCR 프라이머쌍을 제작하였다. SNPs를 기반으로 한 455 CAPS, 11 dCAPS 및 In/Dels를 기반으로 한 56 SCARs에 대한 프라이머쌍이 제작되었다. 상기 마커들과 함께, 이전에 보고된 54개의 수박 EST-SSRs가 PCR 평가 및 'AM' 및 'TS' 사이의 다형성 검출에 포함되었다. 전체 576개의 마커들이 다형성에 대해 검증되었고, 그 결과 312개의 마커(54.16%)[229 CAPS(50.32%), 4 dCAPS(36.36%), 29 SCAR(51.78%) 및 50 EST-SSR(92.59)]가 'AM' 및 'TS' 사이의 다형성 밴드 패턴을 나타냈다. 상기 마커들 중에서, 우성 패턴 또는 애매한 결과를 나타내는 97개의 마커를 제외하였고, 최종 215개의 마커 세트를 F2 개체군 유전자형 분석 및 유전자 연관 지도 구축에 사용하였다.
< 실시예 3> 유전자 연관 지도 구축
과형 마커 개발을 위해 133개의 F2 식물 및 215개의 DNA 마커를 이용하여, 종내 수박 유전자 연관 지도를 구축하였다(도 2). 215개의 마커들 중 4개는 멘델 예측 (P<0.05)으로부터 분리변형되어 지도화 과정에서 제외되었고, 9개 비관련 마커들은 본 발명에 기재하지 않았다. 15개의 LGs는 182 CAPS, 2 dCAPS, 19 SCAR 및 8 EST-SSR을 포함하는 211개 마커들에 의해 확인되었다. 본 유전자 지도는 2,495.8 cM에 걸쳐있는데, 평균 마커 간격은 11.7cM이고, LG 당 평균 14.1 마커들이 존재한다.
< 실시예 4> 표현형 평가 및 QTL 분석
수박의 과형은 일반적으로 원형, 타원형 또는 길쭉한 형태로 구분된다(UPOV, http://www.upov.int). 과형 지수(Fruit shape index; FSI)는 세로 길이에 대한 지름의 비율에 의해 결정될 수 있다. 'AM' 및 'TS'의 FSI는 각각 1.1 및 1.7이었는데, 이는 각각 원형 및 길쭉한 형태로 구분된다(UPOV, http://www.upov.int). F2 개체군의 FSI 범위는 0.9 내지 2.1이었다. 133개의 F2 식물의 표현형 분포는 불완전 우성 유전으로 수박 과형이 단일 유전자좌에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. QTL 맵핑 결과, 주요 QTL(본 발명에서는 FS3 .1로 명명)은 Chr. 3에 위치해 있고, 표현형 변이(LOD = 30.05)는 79.8%인 것으로 나타났다. 과형에 대한 주요 QTL FS3 .1은 CAPS 마커 wsb3-9 및 wsb3-24 (3.54cM, SNP location at 26945390 bp)와 근접하게 연관되어 있다(도 2).
< 실시예 5> 과형에 대한 마커 확인
농우바이오(주)로부터 제공받은 수박 계통들을 이용하여, MAS를 위한 FSI-연관 마커들의 적용성을 확인하였다. 50개의 수박 근친교배주(계통)로 구성된 상기 자료는 원형 또는 타원형의 수박 과형, 및 줄무늬 없음(no stripe; NS), 어두운 녹색 표면, 크림슨-타입 줄무늬, 또는 쥬빌리-타입 줄무늬와 같은 다양한 과피 패턴을 나타낸다. 과형에 있어서, QTL 부위에 맵핑된 7개의 마커들[wsb3-9, wsb3-24, wsb3-35, wsb3-10]로 50개의 근친교배주에 대한 유전자형을 분석하였다. QTL 맵핑에서 가장 높은 Exp. %을 나타낸 wsb3-24는 시험된 근친교배주의 86%가 마커-표현형 일치를 나타냈다(25개의 원형 교배주 중 23개 및 25개의 타원형 교배주 중 20개). wsb3-24 측면의 다른 마커들은 유전자형 및 표현형 빈도에 있어서 일치도가 wsb3-24에 비해 낮은 것으로 나타났다. 마커 확인 결과, 수박-형질 관련 QTL과 연관된 상기 마커들은 MAS에 유용하게 사용될 수 있고, 보다 자세한 QTL 맵핑 및 유전자 클로닝 연구에도 적용될 수 있을 것으로 판단된다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> DNA marker for selecting fruit shape of watermelon <130> ADP-2014-0611 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 394 <212> DNA <213> watermelon <400> 1 ccataatccg atccaatgct tgttgcacaa cttgctctga ttgaacatcc aaagcgctag 60 ttgcttcgtc tagcaacaga attgttgggt ttcgaattat ggctctggct attgctaatc 120 tctgtttctg tcctcctgag agttgcaccc ctctctcccc acattctgcc tcgtacccat 180 ctttcaaaga cgagataaat tcatgggcat tggcggctct ggctgcgtcg ataagctcat 240 tctcagaagc gtcgggcttc ccaaagagga tgttgtcgcg tatggtgcca gagaaaatca 300 ggggatcttg gctgacaagg gccacatgct tcctatacca ttgaagatcc atttctctga 360 tatccacacc gtccactttc acccatccct ttcc 394 <210> 2 <211> 394 <212> DNA <213> watermelon <400> 2 ccataatccg atccaatgct tgttgcacaa cttgctctga ttgaacatcc aaagcgctag 60 ttgcttcgtc tagcaacaga attgttgggt ttcgaattat ggctctggct attgctaatc 120 tctgtttctg tcctcctgag agttgcaccc ctctctcccc acattctgcc tcgtacccat 180 ctttcaaaga cgagataaat tcatgggcat tggcggctct ggctgcgtcg acaagctcat 240 tctcagaagc gtcgggcttc ccaaagagga tgttgtcgcg tatggtgcca gagaaaatca 300 ggggatcttg gctgacaagg gccacatgct tcctatacca ttgaagatcc atttctctga 360 tatccacacc gtccactttc acccatccct ttcc 394 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccataatccg atccaatgct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggaaagggat gggtgaaagt 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 수박 과형 구별용 wsb3-24 DNA 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 wsb3-24 DNA 마커는 제한 증폭 다형성 서열(Cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커인 것을 특징으로 하는 수박 과형 구별용 wsb3-24 DNA 마커.
  3. 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 수박 과형 구별용 프라이머 세트.
  4. 제3항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 수박 과형 구별용 키트.
  5. (1) 수박에서 DNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 PCR 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 분석하는 단계를 포함하는 수박 과형 구별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계는 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 수박 과형 구별 방법.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180077871A (ko) * 2016-12-29 2018-07-09 부산대학교 산학협력단 쥬빌리 타입 또는 크림슨 타입 수박 품종 판별용 snp 마커
KR102011117B1 (ko) * 2018-10-10 2019-08-14 충남대학교산학협력단 적색 과육의 수박 품종 선발용 caps 마커 및 이의 용도
KR102390826B1 (ko) * 2020-11-11 2022-04-25 충남대학교 산학협력단 주황색 과육의 수박 선발용 caps 마커 및 이의 용도
CN118166157A (zh) * 2024-05-10 2024-06-11 浙江大学海南研究院 西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0787979A (ja) * 1993-09-27 1995-04-04 Norin Suisansyo Yasai Chiyagiyou Shikenjo スイカの選抜に用いる合成オリゴヌクレオチド
KR100823692B1 (ko) * 2007-11-07 2008-04-18 주식회사 농우바이오 국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ｄｎａ마커
KR20090111223A (ko) * 2008-04-21 2009-10-26 대한민국(국립종자원장) 수박 ｆ1 종자 순도 검정 방법
JP2010239960A (ja) * 2009-03-19 2010-10-28 National Institute Of Agrobiological Sciences 栄養繁殖作物の品種識別マーカー
US20140041078A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for producing watermelon plants with selected seed sizes

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0787979A (ja) * 1993-09-27 1995-04-04 Norin Suisansyo Yasai Chiyagiyou Shikenjo スイカの選抜に用いる合成オリゴヌクレオチド
KR100823692B1 (ko) * 2007-11-07 2008-04-18 주식회사 농우바이오 국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ｄｎａ마커
KR20090111223A (ko) * 2008-04-21 2009-10-26 대한민국(국립종자원장) 수박 ｆ1 종자 순도 검정 방법
JP2010239960A (ja) * 2009-03-19 2010-10-28 National Institute Of Agrobiological Sciences 栄養繁殖作物の品種識別マーカー
US20140041078A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for producing watermelon plants with selected seed sizes

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180077871A (ko) * 2016-12-29 2018-07-09 부산대학교 산학협력단 쥬빌리 타입 또는 크림슨 타입 수박 품종 판별용 snp 마커
KR102011117B1 (ko) * 2018-10-10 2019-08-14 충남대학교산학협력단 적색 과육의 수박 품종 선발용 caps 마커 및 이의 용도
KR102390826B1 (ko) * 2020-11-11 2022-04-25 충남대학교 산학협력단 주황색 과육의 수박 선발용 caps 마커 및 이의 용도
CN118166157A (zh) * 2024-05-10 2024-06-11 浙江大学海南研究院 西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记及其用途

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