KR102390826B1 - 주황색 과육의 수박 선발용 caps 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주황색 과육의 수박 선발용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 유전체 재분석 기술을 통해 선발된 SNP 유래 CAPS 마커는 주황색 과육의 수박을 효과적으로 판별할 수 있으므로, 주황색 과육의 수박 품종 개발 및 육종에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 주황색 과육의 수박 선발용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
수박(Citrullus lanatus)은 박과(Cucurbitaceae) 작물 중 하나로, 약 4천년 전 아프리카에서 유래되었으며 현재는 전세계적으로 재배되고 있다. 수박은 열매의 모양, 표면 무늬의 색깔, 과육의 색깔 등으로 구별할 수 있다. 수박은 원형, 아원형, 길쭉한 원통형 등 다양한 모양의 품종들이 있으며, 수박을 재배할 때 일정한 틀을 이용하여 만들어진 사각 수박은 수박 품종에 포함되지 않는다. 우리나라에서는 주로 원형 또는 아원형의 수박 품종을 재배하고 있으며 같은 모양이더라도 표면의 색깔이 초록 및 검초록빛이 나는 품종 등이 재배되고 있다. 또한, 과육의 색이 적색, 주황색, 노란색 등을 띄는 다양한 수박 품종이 있으며, 우리나라를 비롯하여 세계적으로 주로 적색 품종이 많이 재배되고 있다. 수박은 주로 생과일, 화채, 주스 등으로 섭취하고, 종자는 건조시켜 볶은 후 간식으로 섭취할 수 있다. 종자는 단백질, 지방 및 탄수화물이 풍부하고, 과육은 수분함량이 높다. 과육에는 영양소가 풍부하지 않으나, 적색 과육 품종의 경우 리코펜의 함량이 6,300~6,800 ㎍/100g으로 매우 높다. 최근 기능성 수박의 수요증가로 인해 다양한 과육색의 품종 개발이 중요한 수박 육종의 목표가 되고 있다.
분자표지를 이용한 선발(marker-assisted selection, MAS)은 최근 유전체 서열정보가 대량 보급되면서 점차 이용이 확대되었고, 대량의 유전자원을 표준 유전체 서열과 비교하여 유전체 재분석(genome resequencing)이 가능해지면서 수박에서도 기존의 유전자지도(genetic map) 작성과 양적형질유전자좌(quantitative trait locus)의 탐색 없이도 형질연관 SNP와 이를 기반으로 한 분자표지 개발이 가능해졌다. 유전체 재분석은 기존에 공개된 표준 유전체 데이터를 참조하여, 시퀀싱을 수행하는 개체의 서열 단편들을 맞추어 나가며 분석하는 방식을 말한다. 이와 같이 개체의 염기서열 정보를 공개된 표준 유전체와 비교하여 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 상기 SNP를 기반으로 한 특정 형질에 대한 분자마커의 개발이 가능하며, 유전자형 분석(genotyping)이 가능하게 되었다.
CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 단형성 PCR 산물에 대한 제한효소 처리로 생성된 다형성 단편이다. 사전에 품종 간에 염기서열의 차가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차이가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA 를 가지는 품종과의 차이를 구별할 수 있으며 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.
한편, 한국등록특허 제2011117호에는 수박 유래 TRAPPC3(Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) 유전자 내 SNP에 기반한 '적색 과육의 수박 품종 선발용 CAPS 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1822995호에는 '쥬빌리계 수박 호피 무늬 형질 선발용 DNA 마커'가 개시되어 있으나, 본 발명의 주황색 과육의 수박 선발용 CAPS 마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 주황색, 적색 및 노란색 과육의 수박 유전자원 계통의 염기분석을 수행하여 주황색 과육의 수박에 특이적인 Psy1(Phytoene synthase 1) 유전자를 확인한 후 상기 유전자와 표준유전체의 염기서열 정보를 맵핑하여 유전자 내 다형성을 보이는 단일염기다형성(SNP) 마커를 발굴하였고, 상기 SNP를 기반으로 CAPS 마커를 제작한 후 상기 CAPS 마커가 주황색 과육의 수박을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 수박 유래 Psy1(Phytoene synthase 1) 유전자의 염기서열 중 445번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 수박 유래 Psy1 유전자의 염기서열 중 445번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 주황색 과육의 수박을 선발하는 방법을 제공한다.
본 발명의 SNP 기반 CAPS 분자마커는 주황색 과육의 수박을 조기에 효율적으로 판별할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감할 수 있으며, 수박 품종의 분자육종 연구 및 수박 육종 산업에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1A는 수박 표준 유전체(97103 v1), 적색 과육의 수박 유전체, 노란색 과육의 수박 유전체 및 주황색 과육의 수박 유전체들 간의 Psy1(Phytoene synthase 1, Cla009122) 유전자 염기서열 정렬 및 유전체 비교 분석을 나타내는 모식도이고, 도 1B는 Psy1 단백질의 아미노산 서열에서 수박 과육색의 SNP 염기에 따라 번역되는 아미노산의 종류가 상이함을 보여주는 모식도이다. 검정색 화살표는 프라이머 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 CAPS 마커 'WMHB1(watermelon high β-carotene)'을 이용하여 주황색 과육, 적색 과육 및 노란색 과육의 수박을 분석한 전기영동 사진이다.
도 2는 본 발명의 CAPS 마커 'WMHB1(watermelon high β-carotene)'을 이용하여 주황색 과육, 적색 과육 및 노란색 과육의 수박을 분석한 전기영동 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 수박 유래 Psy1(Phytoene synthase 1) 유전자의 염기서열 중 445번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열은 수박 유래 Psy1 유전자 염기서열로, Psy1 유전자는 Phytoene synthase 1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명의 SNP 마커를 주황색 과육의 수박 선발에 사용할 수 있는 것은 수박 유래 Psy1 유전자인 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 445번째가 G 또는 A로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 상기 SNP 위치 염기에 있어서, G 염기는 주황색 과육의 수박의 염기이고, A 염기는 노란색 또는 적색 과육의 수박의 염기이다(표 4 참고). 상기 Psy1 유전자의 445번째 염기는 엑손 부위에 존재하는 SNP이다.
본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 수박 유래 Psy1 유전자의 염기서열 중 445번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 마이크로어레이를 제공한다.
바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리 L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 주황색 과육의 수박 선발용 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1의 수박 유래 Psy1 유전자의 염기서열 중 445번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 및 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 키트는 제한효소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제한효소는 바람직하게는 NmeAIII일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은, 또한
수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 주황색 과육의 수박을 선발하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 제한효소는 바람직하게는 NmeAIII일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 주황색 과육의 수박을 선발하는 방법에 있어서, 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 NmeAIII 제한효소 처리에 의해 절단되면 주황색 과육의 수박으로 선발될 수 있다(도 1 참고).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 수박 유전자원 및 수박 유전체 재분석
유전체 재분석(genome resequencing)에 활용된 수박 유전자원은 국내 육종회사(현대종묘)에서 자체 육성된 순계(>F4~F8세대) 24개 분양된 자원으로, 적색 과육의 수박 9개, 노란색 과육의 수박 9개, 주황색 과육의 수박 6개로 구성되어 있다(표 1). 상기 순계의 유전체 재분석 결과 주황색 과육에 특이적인 대립유전자 연관 SNP에 기반한 CAPS 마커의 검증에는 국내에서 재배 유통되고 있는 다양한 과육색의 수박 유전자원을 사용하였다(표 2 및 표 3).
2. 수박 유전체 재분석(whole genome resequencing) 및 SNP 탐색
상기 표 1의 수박 유전자원 24개의 종자를 플라스틱 셀 트레이에 파종하고 온실(충남대학교, 한국)에서 재배한 후 실생의 2~3번째 잎을 채취하여 액체질소에 곧바로 동결시킨 후 -80℃에서 보관하였다. DNA는 0.2g의 잎 조직을 이용하여 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법으로 추출하였고, DNA 순도와 농도는 Nanodrop 1000 Spectrophotometer(Thermo Scientific, 미국)을 이용하여 계측하였다. 유전체 재분석을 위해 최종 quality 및 quantity check(1.6-2.2 at 260/280, >1.62 at 260/230, and >30 ng·㎕-1)를 통과한 고순도 DNA는 국내 유전체분석 회사(씨더스)에 의뢰하였다.
유전체 재분석은 Illumina사의 Hiseq 2000과 Nextseq의 paied-end sequencing 방법을 이용하여 수행하였고, 이를 위해 100~150 bp의 짧은 DNA 단편을 위한 라이브러리를 제작하였으며 염기분석 후 SolexaQA package(v.1.13)을 통해 3가지 기준[(1) p-value 0.05, (2) Phred score (the accuracy of base calling value between 0 and 40, Dynamic Trim ≥ 20), (3) short read length (length sort) ≥ 25 bp]을 통과한 염기서열 정보만을 분석에 활용하였다.
그 다음, 수박 표준 유전체(97103 v1, http://cucurbitgenomics.org/)에 맵핑하여 각각 유전자원 특이 SNP 매트릭스를 만들었고, 이 중 신뢰성이 낮은 SNP, 즉 품질기준[(read depth <3, mapping quality <30, biallelic SNP(InDel), unmapped reads]을 통과하지 못한 SNP는 제거하였다. 필터링된 SNP는 동형접합(homozygous, ≥ 90% of reads), 이형접합(heterozygous, 40-60% of reads) 및 동형접합 또는 이형접합으로 구별할 수 없는 다른 종류로 분류되었다.
3. 주황색 과육의 수박에 특이적인 CAPS 마커의 개발
수박 유전자원의 SNP 매트릭스를 통해 1) 주황색 과육 타입에서 단형성(monomorphic), 2) 노란색과 적색 과육 타입(n=15)에서 단형성, 3) 주황색 과육 타입과 노란색 및 적색 과육 타입 간에 다형성(polymorphic)을 보이는, 유전자(genic) 또는 유전자간 사이(intergenic)에서 SNP를 분석하여 Psy1(Phytoene synthase1) 유전자에서 후보 SNP를 선발하였다.
상기 Psy1 유전자 염기서열의 SNP를 탐지할 수 있는 제한효소를 스크리닝하기 위하여 17개의 제한효소 EcoRI, Bsu36I, HindIII, MboII, NmeAIII, PstI, SpeI, BamHI, MluI, AluI, DraI, PvuI, XhoI, BclI, TaqI, KpnI 및 MspI의 타겟 염기서열을 예측한 후 확인된 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 다자인하였다. 프라이머 디자인은 길이 18-26 bp, GC 함량 40-60%, 결합 온도(annealing temperature) 56-60℃, PCR 증폭산물의 길이 100-500 bp로 조정하였다. 상기 선발된 SNP 정보, 제한효소 종류, 디자인된 프라이머 서열 및 절단된 산물 크기 정보는 하기 표 4에 나타내었다.
4. CAPS 마커의 검증
PCR 증폭은 게놈 DNA(30 ng), 8~10 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머, 0.25 mM dNTPs, 10× Ex-Taq buffer, 1 unit Ex-Taq polymerase(TaKaRa, 한국)가 혼합된 총 12 ㎕의 혼합물을 사용하여 수행하였다. PCR 과정은 전변성 95℃ 3분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 58℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 30초의 과정을 총 40회 반복; 최종 신장 72℃ 10분의 조건으로 수행하였다.
증폭된 PCR 산물은 제한효소 NmeAIII로 절단되었다. 제한효소의 반응은 총 15 ㎕에서 이루어졌고, 반응 혼합액은 각각 PCR 증폭산물 12 ㎕, 10x 버퍼액 1.5 ㎕, 제한효소 1 U(Unit) 및 DDH20로 구성되었다. 절단된 PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.
실시예 1. 주황색 과육의 수박에 특이적인 유전자 및 유전자 내 다형성을 보이는 SNP 발굴
차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS) 기술 중 하나인 유전체 재분석을 통해 다양한 형질의 24개 수박 유전자원 계통(표 1)의 전장 게놈 서열 데이터를 얻은 후 염기서열 분석을 수행한 결과, 주황색 과육의 수박에 특이적인 Psy1(Phytoene synthase1, Cla009122) 유전자를 확인하였으며, 주황색 과육과 적색 및 노란색 과육을 보이는 수박 계통간 Psy1 유전자에 위치한 대립 유전자간에 완벽하게 공분리(co-segregation)되는 현상을 확인할 수 있었다.
수박의 Psy1 유전자 서열에 존재하는 SNP는 Psy1 유전자 CDS(coding sequence)의 445번째에 존재하며, 이 SNP 위치에서 주황색 과육의 수박은 G 염기를 가지고, 적색 및 노란색 과육의 수박은 A 염기를 가진다(도 1A).
또한, 서열번호 1의 Psy1 유전자 CDS로부터 번역된 Psy1 단백질은 총 421개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 상기 SNP 변이 염기를 포함하는 코돈이 암호화하는 아미노산은 아미노산 서열의 149번째에 존재한다. SNP 염기의 종류에 따라 주황색 과육의 수박에서는 글루탐산(Glutamic acid, E)으로, 적색 또는 노란색 과육의 수박의 경우 리신(Lysine, L)으로 번역되었다(도 1B).
주황색 과육의 수박 9개 계통(1, 29, 820, 840, 842, 843)의 Psy1 유전자의 CDS(coding sequence) 445번째 염기서열은 공통적으로 'G' 염기를 가지고 있었고, 다른 과육색의 수박 계통들(노란색- 3, 816, 819, 833, 835, 837, 838, 919; 적색- 812, 829, 830, 832, 917, 45)은 모두 'A' 염기를 갖고 있음을 확인하였다(표 5).
실시예 2. 수박 유래
Psy1
유전자내 SNP 기반 CAPS 마커의 개발 및 검증
수박 유래 Psy1 유전자에서 주황색 과육의 수박 계통에서 다형성을 보이는 SNP의 탐지가 가능한 제한효소를 스크리닝하여 최종적으로 선별된 NmeAIII로 SNP를 탐지할 수 있는 1개의 CAPS 마커를 개발하였으며, 이를 WMHB1(watermelon high β-carotene)으로 명명하였다(표 4). 우선 NmeAIII 제한효소는 5'-GCCGAG-3'를 포함하는 서열을 인식하여 절단하므로(도 1A 참고), Psy1 유전자의 445번째 염기가 'G'인 주황색 과육 수박의 경우, PCR 증폭산물이 2개의 절편(99 및 147 bp)으로 절단되었고, 다른색 과육의 수박에는 제한효소 인식자리가 존재하지 않아 246 bp 크기의 단일 절편만을 가지고 있음을 확인하였다(도 2).
도 2의 주황색 과육의 수박 시료에서는 99 bp 및 147 bp 크기의 밴드뿐만 아니라 246 bp의 밴드도 검출되었는데, 이는 사용한 DNA 농도에 비해 NmeAIII 제한효소(1 Unit)의 사용량이 상대적으로 부족하였기 때문에 나타난 현상인 것으로 사료된다. 이를 통해 본 발명의 프라이머 세트가 수박 과육색별 SNP 변이 위치를 제대로 증폭시킬 수 있음과 동시에 NmeAIII 제한효소가 SNP 변이 위치에서 정확하게 반응할 수 있음을 알 수 있으며, 제한효소의 사용량을 증가시킬 경우 주황색 과육의 수박 시료의 PCR 증폭산물이 보다 더 정확하게 절단되어 다른 과육색으로부터 주황색 과육의 수박을 효과적으로 판별할 수 있을 것으로 예상되었다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC)
<120> CAPS marker for selecting orange flesh watermelon and uses
thereof
<130> PN20065
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1266
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 1
atgtcttttg ctccttcgtt ggttgtttct cccaacgtcg aactttcccc atcgagcttt 60
gggtttcttg attcagttcg agatggatcc caaattcccg attcttccag attcttctcg 120
cgaaatcgag cggcgaatct gatgagcaag aaacagaaat gggggaatca ctctcactct 180
acagaactga aatacccaat tctctgtgaa ggtggatatg gctctgttat tgcagcaagt 240
atggtggcga atcccgccgg agaaatggcc gtctcagctg agcagaaggt gtataacgta 300
gttatgaaac aggcggcttt ggtaaaacgg caactgagaa ccgccggaga attggatgtg 360
aagccggata ttgttcttcc ggggactttg agcttgttga atgaagctta tgatcgttgt 420
ggtgaagttt gtgcagagta tgccaagaca ttttatctgg gaactatgtt gatgactcct 480
gagaggcaaa aggctatttg ggcaatttat gtatggtgta ggaggacaga tgaacttgtt 540
gatgggccaa atgcttcaca tataacacct actgcattgg acagatggga ggcaaggttg 600
gaagagcttt tccaagggag gccttttgat atgctcgatg cagctttagc cgataccgtt 660
actaagtttc cagttgatat tcagccgttc aaagatatga tcgaagggat gaggatggat 720
cttaggaagt cgagatacaa gaattttgac gaactttatc tttactgcta ttatgttgct 780
ggaactgttg ggttgatgag tgttcctatc atgggcattg cacctgactc ccaagcaagc 840
acagagagtg tgtataattc tgccttagca ttaggcatag ctaatcagct cacaaacatt 900
ctcagagatg ttggagaaga tgctagaaga ggaagaatat atctaccaca agatgagcta 960
gcacaggcag gactttcaga tgaggacata tttgctggaa gagtaactga taaatggaga 1020
aacttcatga agagtcagat taagagagct agaatgttct ttgatgaggc tgagaaagga 1080
gttttggagc ttaataaagc tagcagatgg ccggtgtggg cctcattgct attatatagg 1140
caaatattgg atgagattga agcaaatgac tacaacaact tcacaaagag ggcttatgtg 1200
agcaaagcca aaaaaatatt ggctttgcct atggcttatg caaggtctct ccttggccct 1260
tcatga 1266
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
attgttcttc cggggacttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tagccttttg cctctcagga 20
Claims (6)
- 서열번호 1의 수박 유래 Psy1(Phytoene synthase 1) 유전자의 염기서열 중 445번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 SNP 마커 조성물.
- 서열번호 1의 수박 유래 Psy1 유전자의 염기서열 중 445번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 마이크로어레이.
- 삭제
- 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소 NmeAIII를 포함하는 주황색 과육의 수박 선발용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
- 수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 제한효소 NmeAIII로 절단하는 단계; 및
상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 주황색 과육의 수박을 선발하는 방법.
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100823692B1 (ko) * | 2007-11-07 | 2008-04-18 | 주식회사 농우바이오 | 국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ｄｎａ마커 |
| KR20160095213A (ko) * | 2015-01-31 | 2016-08-11 | 부산대학교 산학협력단 | 수박의 과형 구별용 dna 마커 |
| KR20160095212A (ko) * | 2015-01-31 | 2016-08-11 | 부산대학교 산학협력단 | 쥬빌리계 수박 호피 무늬 형질 선발용 dna 마커 |
| WO2017134297A1 (en) * | 2016-02-05 | 2017-08-10 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Qtls conferring resistance to potyviruses in watermelon |
-
2020
- 2020-11-11 KR KR1020200149946A patent/KR102390826B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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|---|---|
| KR102390826B9 (ko) | 2024-01-11 |
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