KR100984736B1 - 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 마커, 상기 마커를 이용하여 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하는 방법, 및 상기 마커를 포함하는 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 마커를 이용하면, 벼멸구 저항성 유전자를 갖는 개체나 계통을 쉽고 간편하게 그리고 안정되게 선발할 수 있다.
Figure R1020080053512
Bph1, 벼멸구, CAPS, representational difference analysis, 벼

Description

벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 마커{Marker for selecting brown planthopper-resistant rice cultivar}
본 발명은 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 마커, 상기 마커를 이용하여 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하는 방법, 및 상기 마커를 포함하는 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 키트에 관한 것이다.
벼 (Oryza sativa L)는 세계 인구의 주요 식량원이다. 매년 벼 수확량의 현저한 감소는 곤충 침입에 의해 야기되며, 벼멸구 (brown planthopper; BPH)가 아시아에서 벼 작물에 대한 가장 파괴적인 해충이다. BPH는 종종 감수성 품종에서 벼 수확량의 60%까지의 심각한 손실을 초래한다.
현재의 방제는 주로 화학적 방제를 사용하고 있으나 저항성 품종을 이용하여 그 피해를 줄이기 위해 다수의 저항성 품종을 육성하고 있다. 그러나 저항성 품종을 육성하고자 할 때 저항성 유전자를 보유하고 있는 계통이나 개체를 선발하는 과정이 용이한 것은 아니다.
한편, 최근에는 분자 생물학의 발전과 함께 DNA 마커를 이용한 고밀도 분자 유전 지도가 작성되어 DNA 마커로 식물의 어떤 형질을 선발할 수 있게 되었다(gene tagging). 이 때 생물 개체의 특이적 DNA 구조의 다형성 (polymorphism)을 이용한 핵산지문법(DNA fingerprinting)이 이용되며, 이 방법은 환경에 의해 거의 영향받지 않으며, DNA의 변이율도 년 1/109 정도로 낮아 매우 안정되게 유전자형을 판별하는데 사용할 수 있다. 그 중 PCR (Polymerase Chain Reaction) 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 핵산 단편(이하 프라이머)을 생물체의 핵산과 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Tag DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA (1~50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다.
저항성 품종은 BPH 해충과 싸우는 가장 경제적이고 효과적인 방법이다. 따라서, 곤충 저항성을 갖는 벼 품종의 육종은 작물 개선 프로그램에서 최우선 과제이다. 지금까지, 수많은 주요한 BPH 저항성 유전자가 인디카 벼 품종 및 야생 벼 품종에서 동정되었다.
인디카 벼 품종은 자포니카 종보다 비교적 높은 수준의 BPH 저항성을 나타내며, 19가지 보고된 저항성 유전자 중에서, 11가지가 인디카 품종에서 동정되었다 (Zhang Q (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:16402-16409). 인디카 BPH 저항성 품종인 Mudgo 유래의 처음으로 동정된 우성 저항성 유전자좌인 Bph1은 12번 염색체의 long arm 상에 맵핑되었다 (Kim SM, Sohn JK (2005) Mol Cells 20:30-34).
BPH 저항성을 갖는 것에 관련된 많은 유전자가 다양한 분자적인 방법, 예를 들면, cDNA 어레이, SSH (suppression subtractive hybridization) 및 RDA (representational difference analysis)을 이용하여 벼에서 동정되었다 (Ren et al. (2004) Plant Breeding 123:342-348). 상기 유전자는 몇 가지 기능성 그룹, 예를 들면, 신호전달 경로, 산화 스트레스/아폽토시스, 상처 반응 및 병원균 관련 단백질에 속한다. 우리는 이전에 Bph1를 갖는 삼강벼와 BPH 감수성 라인인 낙동벼의 역교배로부터 유래된 BPH 저항성 NIL (near isogenic line)인 SNBC61에서 배타적으로 발현되는 전사체를 검출하는 효율적인 RDA 방법을 개발하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547). 분리된 유전자는 저항성 라인에서 상향 조절되는 것 같으며, BPH 저항성에 대해 공지된 QTL (quantitative trait loci)과 가까이에 위치한다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 저항성 NIL (near isogenic line)인 SNBC61에서 차별적으로 발현되는 드문 전사체를 검출할 수 있는 변형된 RDA 방법을 이용하여, 분리된 RDA 클론의 발현 수준을 RT-PCT로 분석하고, 상기 RDA 클론의 염색체 위치를 주요한 BPH 저항성 유전자인 Bph1와 비교하였다. 흥미롭게도, 가상적인 리폭시게나아제를 코딩하는 RDA 클론 중의 하나는 Bph1 유전자좌에 가까이 맵핑되었으며, 더욱이, CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 분석은 Bph1 마커가 저항성과 공분리된다는 것을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼멸구 저항성 유전자를 갖는 개체나 계통을 쉽고 간편하게 그리고 안정되게 선별할 수 있는 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 마커를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 마커를 이용하여 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 마커를 포함하는 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 마커를 이용하면, 벼멸구 저항성 유전자를 갖는 개체나 계통을 쉽 고 간편하게 그리고 안정되게 선발할 수 있다. 또한, 상기 분자 마커는 MAS (marker-assisted selection)을 통한 BPH 저항성을 개선하는 벼 육종에 유용할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼멸구 저항성 유전자를 갖는 개체나 계통을 쉽고 간편하게 그리고 안정되게 선별할 수 있는 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 마커를 제공한다. 상기 마커는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.
상기 마커는 바람직하게는, 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 마커는 가장 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1 및 2의 프라이머 세 트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 증폭 산물을 제한효소로 절단한 후, 절단 산물을 겔 전기영동함으로써 수행될 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 제한효소는 SphI일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트에서, 제한효소는 SphI이며, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 CAPS 마커이므로, 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 외에 제한효소를 필요로 한다. 즉, CAPS 마커는 증폭 반응을 수행한 후에, 해당하는 제한효소로 절단해야 증폭 산물을 구별할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
식물 재료
Bph1 유전자좌의 공여자로서 삼강벼 및 반복친 라인 (recurrent parental line)으로서 낙동벼 사이의 5회 역교배로부터 유래된 64가지 SNBC NILs 을 이용하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547). 이 중에서, SNBC61 을 RDA 실험에 주로 이용하였는데, 이는 그것이 RDA 실험에 대한 모든 생물분석에서 BPH 바이오타입 1에 대한 높은 수준의 저항성을 유지했기 때문이다 (Lee et al. (2005) Korean J Breed 37:295-299).
RDA 실험
BPH 곤충에 대한 노출 후에 SNBC61 및 낙동벼로부터 추출된 총 RNA를 이용한 이전의 RDA 실험으로부터의 difference product을 테스터(tester)로서 이용하였다. 드라이버(driver)로서, 상기 실험으로부터 동정된 모든 8개 OsBphi ( O ryza s ativa BPH-inducible) 클론을 이용하였다 (도 1). 상기 변형된 'double-RDA' 실험을 이전에 기재된 절차에 따라 수행하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547).
DNA 서열 분석
차별적으로 발현된 산물을 QIAEX II 키트 (Qiagen, Valencia, CA; )를 이용하여 정제하고, 시퀀싱을 위해 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA; )를 이용하여 서브클로닝하였다. RDA 서열을 NCBI 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 기탁하였다. OsBphi 클론의 서열 유사성을 벼 게 놈 서열에 대해 query로서 RDA 서열을 이용한 BLASTN 서치를 수행함으로써 분석하였다 (Yu et al. (2002) Science 296:79-92; International 벼 Genome Sequencing Project 2005). OsBphi 클론에 대한 유전자좌명 및 전장 cDNA를 TIGR (http://tigrblast.tigr.org/euk-blast/index.cgi?project=osa1) 및 NCBI 데이터베이스에 대해 BLASTN 서치에 의해 동정하였다. OsBphi 유전자의 가상적인 기능을 이의 유도된 아미노산 서열을 이용한 BLASTP 서치를 수행함으로써 예측하였다.
OsBphi 유전자의 염색체 위치
OsBphi 유전자를 GRAMENE 데이타베이스 (http://www.gramene.org)에 대해 RDA 서열을 이용한 BLASTN 서치를 수행함으로써 벼 염색체 상에 위치화하였다. 관련된 마커에 대한 서열 정보를 NCBI 및 GRAMENE 데이터베이스로부터 얻었다.
DNA 겔- 블롯 분석
낙동벼, 삼강벼 및 SNBC61 유래의 대략 3 ㎍의 게놈 DNA를 EcoRI 또는 HindIII로 절단한 후, 혼성화 실험을 수행하였다. 혼성화를 높은 스트린전시 조건하에 표준 절차에 따라 [α-32P] dCTP-표지된 OsBphi RDA-특이적 프로브를 이용하여 수행하였다 (Yi et al. (2004) Theor Appl Genet 109:978-985). 혼성화 시그널을 phosphorimager (Typhoon, Amersham Biosciences)를 이용하여 기록하였다.
반정량적 RT - PCR 분석
반정량적 RT-PCR 분석을 위한 제1가닥 cDNA를 이전에 기재된 절차에 따라 제조하였다 (Cho et al. (2006) Planta 224:598-611). 총 RNA를 BPH 공급 후 2 내지 8일 기간 동안 낙동벼 및 SNBC61의 충분히 전개된 제3 또는 제4 잎의 줄기로부터 분리하였다. 각 OsBphi 유전자에 대한 PCR 산물을 유전자 특이적인 프라이머 (표 1)를 이용하여 증폭하였다.
표 1. RT-PCR 분석에 이용된 프라이머
클론 정방향 프라이머(5'→3') 역방향 프라이머(5'→3')
OsBphi237 CAGAGAACTATTTTTGCGTCTGTGC(서열번호 3) ACTGCAAGCGGGCACATCAG(서열번호 4)
OsBphi252 ATCTCCGCGATACTCATCATCCTC(서열번호 5) GTGCTACTAGACACGTTCCCATCG(서열번호 6)
OsBphi262 GGAGACAAATCAACCGAATACT(서열번호 7) GTTGTCCTCCATCATGTGAC(서열번호 8)
Ubiquitin5 GACTACAACATCCAGAAGGAGTC(서열번호 9) TCATCTAATAACCAGTTCGATTTC(서열번호 10)
Ubiquitin5 (Ubi5) 유전자를 유전자 발현 프로파일링에 대한 내부 표준으로서 이용하였다 (Kim et al. (2003) Plant Mol Biol 50:1203-1213). PCR 반응을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547). PCR 사이클 수는 하기와 같다: OsBphi237 (28 사이클); OsBphi252 ( 29 사이클); OsBphi262 (30 사이클). 실험을 3회 이상 반복하였다.
NIL 의 표현형 분석
64가지 SNBC NIL의 BPH 저항성을 측정하기 위해, 3주령 유묘를 이전에 기재한 바와 같이 BPH 바이오타입 1로 침입하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547). 곤충의 제2 또는 제3령 유충을 공급 (feeding) 실험 동안 2일에 걸쳐 유묘당 대략 10마리의 곤충의 밀도로 케이지에서 유지하였다.
CAPS 분석
벼 게놈 DNA를 간단한 미니프렙 방법에 의해 어린 잎으로부터 분리하였다 (Chen DH, Ronald PC (1999) Plant Mol Biol Rep 17:53-57). CAPS 분석을 주형으로서 50 ng의 게놈 DNA를 이용하여 30 ㎕의 부피 (100 pM의 각 프라이머, 200 μM 각각의 dNTPs, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 0.5 U Taq 중합효소)에서 수행하였다. SphI 절단된 PCR 산물을 이어서 1.5% 아가로스 겔 상에서 크기 분리하였다. PCR 프라이머를 OsBphi252 CAPS 마커의 분석에 이용하였다: 5'-CCGTCAGGGTGCTACTAGA-3'(서열번호 1) 및 5'-GATACCCATCTCCATCACG-3'(서열번호 2).
실시예 1: BPH 반응성 유전자의 동정
우리는 이전에 테스터로서 BPH-공급된 SNBC61 및 드라이버로서 낙동벼의 cDNA를 이용한 RDA에 의해 저항성 NIL SNBC61에서 특이적으로 상향조절된 8가지 OsBphi 유전자를 분리하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547). 여기에서, 우리는 변형된 'double-RDA' 방법을 이용하여 BPH 반응성 유전자 중에서 부가적인 드문(rare) 전사체를 분리하려고 시도하였다. 이전의 RDA로부터 의 총 최종 차이 산물을 테스터로서 재이용하고, 모든 분리된 OsBphi 클론을 드라이버로서 이용하였다 (도 1). 우리는 총 78개 RDA 클론을 분리하였으며, 이를 이어서 DNA 시퀀싱에 의해 분석하였다. 5개의 클론을 제외하고, 상기 RDA는 이의 서열이 하기 등록 번호로 GenBank 데이터베이스에 등록된 3가지 unique 유전자와 동일하였다: OsBphi237에 대해 EU513006, OsBphi252에 대해 EU513009 및 OsBphi262에 대해 EU513010. 나머지 5개 클론은 이전에 동정된 OsBphi 클론 중의 하나와 동일하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547).
실시예 2: OsBphi 유전자의 서열 유사성 분석
TIGR 및 NCBI 데이터베이스에 대해 query로서 RDA 서열을 이용한 BLAST 서치를 이용하여, 2개의 OsBphi 유전자인 OsBphi252 및 OsBphi262의 유전자좌명, 전장 cDNA 및 가상적인 기능을 동정하였다 (표 2).
표 2. OsBphi 유전자의 서열 유사성 및 가상적인 기능
유전자 TIGR 유전자좌 전장 cDNA 동일성 E 값 가상적인 기능
OsBphi237 - - - - -
OsBphi252 Os12g37260 AJ270938 98% 1e-99 리폭시게나아제
OsBphi262 Os05g33400 AK070554 97% 1e-124 미지
OsBphi237 은 벼 또는 기타 생물체 유래의 임의의 공지된 DNA 서열과 부합하지 않았는데 (표 2), 이는 상기 RDA 서열이 BPH 저항성 SNBC61 및 삼강벼 게놈에 unique 하다는 것을 제시한다. 상기 분석은 OsBphi252 및 OsBphi262 가 각각 12번 및 5번 염색체 상에 위치한다는 것을 보여주었다. 2가지 OsBphi 클론은 공지된 전장 cDNA와 현저한 상동성을 나타내었다. OsBphi252 는 벼 엽록체 리폭시게나아제 유전자인 RCI -1 (rice chemically induced cDNA1)과 유사한 단백질을 코딩하는 것 같다 (Schaffrath et al. (2000) Eur J Biochem 267: 5935-5942). OsBphi262 는 알려지지 않은 기능을 갖는 단백질을 코딩하였다. 대조적으로, OsBphi237 RDA 서열은 공지된 단백질과 임의의 유사성을 보여주지 않았다.
실시예 3: OsBphi 유전자의 염색체 위치
상기 OsBphi252 및 OsBphi262 유전자에 대한 정확한 염색체 위치를 결정하기 위해, OsBphi 서열을 인디카 93-11 (Yu et al. (2002) Science 296:79-92) 및 자포니카 니폰바레 ( japonica Nipponbare) (International Rice Genome Sequencing Project 2005)의 벼 게놈 서열과 정렬하였다. 상기 분석은 OsBphi252 및 OsBphi262의 서열이 인디카 변종의 것과 높은 서열 유사성을 나타내며, 자포니카 변종의 것과 더 낮은 유사성을 나타낸다는 것을 보여주었다 (표 3).
표 3. OsBphi 유전자와 인디카 및 자포니카 벼 게놈의 서열 유사성
유전자 인디카 자포니카
Accession E 값 염색체 Accession E 값 염색체
OsBphi237 - - - - - -
OsBphi252 AAAA02034988 6e-102 12 NC_008405.1 1e-98 12
OsBphi262 AAAA02017145 5e-134 5 NC_008398.1 7e-122 5
이는 인디카 벼 품종이 자포니카 종보다 비교적 높은 수준의 BPH 저항성을 나타낸다는 사실과 일치한다. 상기 결과는 또한 분리된 OsBphi 유전자가 SNBC61의 BPH 저항성 공여자인 인디카 부모 품종 삼강벼 기원일 가능성을 제시한다.
OsBphi 유전자의 염색체 위치를 결정하고, NIL SNBC61 에서 저항성 공여자 부모 삼강벼의 유전자 이입된(introgressed) SSR 마커의 이전에 동정된 위치와 비교하였다 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547). OsBphi252 및 OsBphi262는 유전자 이입된 SSR 마커 또는 이전에 보고된 OsBphi 유전자와 가까이에 위치하는 것으로 밝혀졌으며 (도 2), 이는 우리의 RDA 방법의 효율성을 지지한다. OsBphi262 는 5번 염색체 상의 유전자 이입된 SSR 마커인 RM163 및 RM459 및 이전에 보고된 OsBphi66 근처에 맵핑되었다. OsBphi252는 12번 염색체 상의 RM28493를 포함하는 4개의 유전자 이입된 SSR 마커와 가까이에 위치하는 것 같다. 흥미롭게도, 우리는 OsBphi252는 BPH 주요한 저항성 유전자좌인 Bph1에 가까이 위치한다는 것을 밝혔다.
실시예 4: OsBphi 게놈 영역의 분자 규명
BPH 저항성 공여자인 삼강벼, BPH 감수성 변종인 낙동벼 및 NIL SNBC61에서 OsBphi 유전자의 게놈 구조를 조사하였다. 게놈 DNA 겔-블롯 실험은 SNBC61에서 모든 OsBphi 유전자의 게놈 영역이 삼강벼의 것과 동일하였으나, BPH 감수성 변종인 낙동벼의 것과는 상이하다는 것을 보여주었다 (도 3). OsBphi237 는 SNBC61 및 삼강벼의 BPH 저항성 게놈과 동일한 우성 혼성화 밴드를 나타내었다. 나머지 2개의 유전자인 OsBphi252 및 OsBphi262 는 저항성 (SNBC61 및 삼강벼) 및 감수성 (낙동벼) 품종 사이에 다형성 밴드를 나타낸 반면, 2가지 저항성 라인에서는 단형성 (monomorphic)이었다. 상기 결과는 SNBC61에서 OsBphi 게놈 영역이 저항성 부모 라인인 삼강벼의 대립유전자에 해당한다는 것을 제시한다.
실시예 5: BPH 침입에 반응하여 OsBphi 유전자의 발현 분석
BPH 공격 동안 저항성 SNBC61 및 감수성 낙동벼 품종에서 OsBphi 유전자의 발현을 조사하였다 (도 4). RT-PCR 실험은 OsBphi237 발현은 BPH 저항성 SNBC61 라인에서 상향 조절된다는 것을 보여주었다. 대조적으로, OsBphi237 전사체는 감수성 낙동벼에서는 검출되지 않았는데, 이는 유전자 특이적 프로브가 DNA 겔-블롯 분석에서 혼성화 밴드를 나타내지 않는다는 것을 보여주는 결과와 일치한다 (도 3a). OsBphi252는 BPH 공급 후 1일에 매우 상향 조절되는 것 같으며, SNBC61에서 BPH 공급 동안 높은 발현을 유지하였다 (도 4). 대조적으로, 낙동벼에서, OsBphi252 발현은 BPH 공급 후 1 내지 2일에 최대 수준에 도달한 후, 감소하였다. 또한, OsBphi262 유전자 발현은 SNBC61에서는 매우 상향 조절되었으나, 낙동벼에서는 약하게 상향 조절되었다.
실시예 6: SNBC NIL 의 CAPS 분석
공지된 Bph1 유전자좌 근처의 OsBphi252 의 염색체 위치는 OsBphi 유전자가 주요 BPH 저항성 유전자와 연관되는지를 조사하게 하였다. 삼강벼 및 낙동벼 유래의 64가지 BC5F5 역교배시킨 순계 SNBC 를 분석하였다. 모든 NIL의 저항성 표현형을 BPH 침입 동안 먼저 결정하였다. 그 결과, SNBC NIL은 33가지 저항성 및 31가지 감수성 라인으로서 분류되었다 (도 5). 큰 집단의 분석에서 효율적으로 이용될 수 있는 OsBphi252 에 대한 CAPS 마커는 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 개발하였다. 삼강벼 및 낙동벼 유래의 PCR 산물의 서열 분석은 2가지 품종 사이의 SphI 제한효소 자리를 포함하는 서열에서 변이를 나타내었다 (데이터 미제시). 이어서, SphI-절단된 PCR 산물은 저항성 품종에서는 단일 323 bp 길이 밴드를 나타내고, 감수성 품종에서는 2개의 밴드인 111 및 212 bp를 나타내었다 (도 5). OsBphi252 유전자좌에 대한 모든 유전형을 이어서 CAPS 마커를 이용하여 SNBC 라인에서 결정하였다. 결과는 모든 33가지 저항성 NIL이 OsBphi252의 삼강벼 대립유전자를 생성하고, 모든 감수성 라인이 낙동벼 대립유전자를 생성한다는 것을 나타내었다. 33가지 저항성 라인 중에서, 4가지는 저항성 및 감수성 대립유전자 양자를 나타내었다: SNBC17, 21, 54 및 64 (도 5). 이는 OsBphi252이 Bph1 저항성 유전자와 밀접하게 연관된다는 것을 강하게 제시한다.
도 1은 2단계 RDA 절차에 기초한 'double-RDA' 실험의 모식도를 보여준다. 첫번째 RDA로부터 차이 산물 (difference product) 및 모든 분리된 OsBphi 클론을 두번째 RDA에서 각각 테스터 및 드라이버서 이용하였다.
도 2는 분리된 OsBphi 유전자 (밑줄친 이탤릭체)의 염색체 위치를 보여준다. 이전에 분리된 OsBphi 유전자 (Park et al. (2007) Theor Appl Genet 115: 537-547)는 이탤릭체로 보여준다. RM 마커는 낙동벼 백그라운드와 함께 NIL SNBC61에서 저항성 공여자 부모 삼강벼의 유전자 이입된 SSR 마커를 나타낸다. Bph1 유전자좌 (채워진 박스로 보여줌)는 [Huang et al. (1997) Mol Breed 3:105-113] 및 [Sharma et al. (2003) Euphytica 129:109-117]로부터 개작(adapted) 하였다.
도 3는 삼강벼 (S), 낙동벼 (N) and SNBC61 (61)의 게놈 DNA 겔-블롯 분석을 나타낸다. EcoRI 또는 HindIII로 절단된 DNA를 OsBphi-특이적인 프로브와 혼성화하였다: (a) OsBphi237, (b) OsBphi252, 및 (c) OsBphi262
도 4는 BPH 공급 동안 저항성 SNBC61 및 감수성 낙동벼에서 OsBphi 유전자의 반정량적 RT-PCR 분석 결과이다. 총 RNA를 상이한 BPH 공급 시간 후에 벼 유묘로부터 추출하였다. 레인 1(대조군); BPH 공급 후 레인 2(2시간); 레인 3(1일); 레인 4(2일); 레인 5(4일); 레인 6(8일). 벼 Ubi5 유전자에 대한 프라이머를 내부 대조군으로서 이용하였다.
도 5는 OsBphi252 CAPS 마커 프라이머를 이용한 삼강벼 (S) 및 낙동벼 (N) 사이의 교배로부터 유래된 64가지 역교배된 순계의 CAPS 분석 결과이다. 모든 PCR 산물을 SphI으로 절단하였다. 저항성 대립유전자는 단일 밴드 (323 bp 길이)를 나타내고, 감수성 대립유전자는 2개의 밴드 (111 및 212 bp)를 나타낸다. 각 NIL에 대한 표현형은 저항성 (R) 및 감수성 (S)으로 표시한다. M, DNA 래더
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Marker for selecting brown planthopper-resistant rice cultivar <130> PN08095 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CAPS marker <400> 1 ccgtcagggt gctactaga 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CAPS marker <400> 2 gatacccatc tccatcacg 19 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 cagagaacta tttttgcgtc tgtgc 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 actgcaagcg ggcacatcag 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 atctccgcga tactcatcat cctc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 gtgctactag acacgttccc atcg 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 ggagacaaat caaccgaata ct 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 gttgtcctcc atcatgtgac 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 gactacaaca tccagaagga gtc 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 tcatctaata accagttcga tttc 24

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 이루어진, 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트.
  3. 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 증폭 산물을 제한효소로 절단한 후, 절단 산물을 겔 전기영동함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼멸구 저항성 벼 품종을 선별하기 위한 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제한효소는 SphI이며, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104342437A (zh) * 2014-09-26 2015-02-11 广西大学 水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记及其应用
CN108707674A (zh) * 2018-05-30 2018-10-26 中山大学 通过单核苷酸多态性预测褐飞虱群体对抗虫水稻品种ir36致害力水平的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101322345B1 (ko) * 2011-04-01 2013-10-28 대한민국 ＤＮＡ 마커를 포함하는 끝동매미충 저항성 유전자 Ｇｒｈ１을 가진 벼 품종 선별용 조성물 및 ＤＮＡ 마커를 이용한 끝동매미충 저항성 벼 품종 선별 방법
KR101961656B1 (ko) * 2017-11-08 2019-03-26 대한민국 가야벼 유래 ⅠｎＤｅｌ ＤＮＡ 마커를 포함하는 벼멸구 저항성 벼 품종 선별용 조성물 및 상기 ⅠｎＤｅｌ ＤＮＡ 마커를 이용한 벼멸구 저항성 벼 품종 선별 방법
CN107779522B (zh) * 2017-11-16 2020-12-08 武汉大学 水稻抗褐飞虱基因Bph15的特异性共显性分子标记及其应用
CN111621589B (zh) * 2020-06-24 2022-08-23 南京农业大学 水稻抗褐飞虱基因qBPH6的分子标记及其应用
CN113186198A (zh) * 2021-04-12 2021-07-30 武汉大学 一种抗褐飞虱基因Bph41及其编码蛋白质和应用
KR102647442B1 (ko) * 2021-08-03 2024-03-14 대한민국 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102647443B1 (ko) * 2021-08-03 2024-03-14 대한민국 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 lamp 프라이머 세트 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PNAS, Vol.104, No.52, pp16402-16409 (2007.10.)
Theor. Appl. Genet., Vol.115, pp537-547 (2007.)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104342437A (zh) * 2014-09-26 2015-02-11 广西大学 水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记及其应用
CN108707674A (zh) * 2018-05-30 2018-10-26 中山大学 通过单核苷酸多态性预测褐飞虱群体对抗虫水稻品种ir36致害力水平的方法
CN108707674B (zh) * 2018-05-30 2021-08-03 中山大学 通过单核苷酸多态性预测褐飞虱群体对抗虫水稻品种ir36致害力水平的方法

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