CN104342437A - 水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的紧密连锁分子标记及其应用。通过将水稻抗虫品系08BPH327(♂)与9311(♀)杂交获得的F₂各单株的基因型，同时结合F_2:3家系的抗褐飞虱的抗性级别进行遗传连锁分析，从抗虫品系08BPH327定位抗性主效基因qBph29(t)于分子标记RM16720和YM54之间的120K区间，发现了与qBph29(t)紧密连锁的分子标记。本发明分子标记可以有效检测抗虫品系08BPH327及其衍生品种中是否含有该主效抗性基因位点，大大提高抗褐飞虱水稻植株的选择效率，获得含有qBph29(t)的抗褐飞虱水稻品种。

Description

水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物分子遗传学领域，涉及水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记及其该分子标记在选育水稻抗褐飞虱品种中的应用。

背景技术

水稻是我国最主要的粮食作物之一，近几十年来受到大面积的病虫为害，使其生产受到严重威胁。稻褐飞虱是一种单食性害虫，其成虫和若虫以口针刺吸植株韧皮部汁液，引起水稻植株黄叶或枯死，最后导致减产或绝收。据中国农业年鉴记载，稻飞虱(主要是褐飞虱)在1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，其每季危害的面积达到水稻种植总面积的50％以上，给我国水稻生产造成了严重的损失。由于褐飞虱的危害多发生在水稻成熟灌浆期，此时大量使用杀虫剂，对环境和稻谷的污染也是非常严重的问题。利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。

水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初，至今已命名了28个主效抗虫基因(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase_submission/gene_nomenclature/)。这些抗性基因分别来自不同的野生稻种和栽培稻农家品种资源。一些早期研究的抗褐飞虱基因如Bph1、bph2和Bph3已培育成抗虫品种并在一些水稻种植区推广种植。然而，由于褐飞虱新生物型的出现，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险。例如，带有Bph1的抗虫品种，经过几年推广种植后很快就失去抗性，而携带Bph1和bph2两个基因的品种抗性表现更强并更持久。因此，水稻生产中迫切需要携带新的和多个抗性基因的抗虫品种。

由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地导入和聚合不同的抗虫基因。本发明是在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因的导入和聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记。

本发明的目的之二是提供上述分子标记的检测方法。

本发明的目的之三是提供一种使用上述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记，其是由下列引物对经PCR扩增获得，所述引物对的上游引物为Seq ID NO.1所示的序列，所述引物对的下游引物为Seq ID NO.2所示的序列；

Seq ID NO.1：5’-CTCTCCCCTCCAATCCTTTT-3’

Seq ID NO.2：5’-AGCACCCTGGAAAGCAGTAG-3’。

本发明还公开了该分子标记用于筛选水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的方法，其特征在于，包括步骤：以待检测的水稻基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，如果引物能够扩增出205bp的基因片段，说明待检测的水稻存在抗褐飞虱主效基因qBph29(t)。

本发明还公开了所述的分子标记在水稻辅助育种中的用途。

另外，本发明还公开了一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，使用权利要求1中所述的引物对，以待检测的水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，并判断是否能扩增出205bp的基因片段，如果能扩增出所述205bp片段，则标志着该待检水稻为存在抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的抗性水稻材料。

作为优选，上述方法中以待检测的水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增后，可以通过凝胶电泳检测或测序的方式，判断是否能扩增出205bp的基因片段。

本发明具备的有益效果

1、通过本发明首次用SSR分子标记精细定位了水稻品系08BPH327中的抗褐飞虱主效基因qBph29(t)。

2、通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点紧密连锁的分子标记，即可以预测水稻植株对褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗虫品种或品系用于水稻育种。其检测方法简便、快速、高通量，不受环境影响。

3、辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对水稻品种进行抗褐飞虱性状的鉴定并进行选择，操作非常复杂，同时还受环境的影响。此外，在进行抗虫鉴定之前，首先要获得虫源并饲养繁殖褐飞虱群体，同时还要求接种虫源与水稻秧苗苗龄较同步，这同样给育种工作带来麻烦，若不能有效地处理好虫源、秧苗以及环境之间的关系，抗褐飞虱的表型鉴定结果可靠性就很低。因此，抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。然而，通过检测抗褐飞虱主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其他植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率，极大地缩短水稻品种的育种周期。

附图说明

图1为水稻品系08BPH327携带的抗褐飞虱主效基因qBph29(t)在第4染色体长臂上与分子标记YM70的紧密连锁关系。图中：A-qBph29(t)初步定位；垂直线表示第4染色体；水平短线表示染色体上的分子标记；括号内的数值表示标记间的物理距离(Mb)；B-qBph29(t)精细定位。qBph29(t)定位于RM16720和YM54之间120kb的区域，分子标记YM70与抗性基因紧密连锁。n表示筛选的F₃重组单株总数。

图2为分子标记YM70在不同水稻材料中扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测带型。图中：第1孔为168S；第2孔为9311；第3孔为08BPH327；第4至29点样孔为9311和08BPH327杂交育种后代单株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

以下实施例中使用的仪器、试剂、试剂盒均可由市售得到；YM70为实施例中所述分子标记。

实施例1：分子标记的获取

(一)186S/08BPH327F₂群体构建及表型鉴定

(1)前期研究中，广西大学李容柏研究员从大量的广西普通野生稻材料中筛选获得一批高抗褐飞虱的野生稻材料，通过与栽培稻品种的杂交、回交转育，结合抗褐飞虱鉴定，将抗性性状转育到栽培稻材料中，经过多代自交及抗虫鉴定，筛选获得高抗稻褐飞虱且农艺性状稳定的水稻品系。其中，新抗源08BPH327是抗褐飞虱的普通野生稻与西乡糯杂交、回交转育的后代材料，抗虫鉴定实验表明，08BPH327对采自南宁郊区稻田中的褐飞虱群体具有高抗性。为了寻找简单有效且与qBph29(t)紧密连锁的分子标记，本发明分别以感虫品系186S为母本，以抗褐飞虱水稻品系08BPH327为父本杂交，得到的F₁再自交，从而构建了F₂分离群体；每个F₂单株通过自交获得相应的F_2:3家系。

(2)采用苗期接虫处理对亲本、F_2:3家系进行抗虫性鉴定。为确保亲本和F_2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)各50粒种子播种于一个长45cm、宽35cm、高8cm，且盛有5cm厚营养土的铁质托盘中。每盘每个材料播种2个重复，其中随机播种亲本和TN1(感性对照)各2个重复。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到两叶一芯期时，按8头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网。当感虫品种TN1全部死亡时，参照Qiu等(Qiu et al.2010High-resolutionmapping of the brown planthopper resistance gene Bph6in rice and characterizingits resistance in the 9311and Nipponbare near isogenic backgrounds.Theor ApplGenet 121:1601-1611)的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价(表1)，对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，上述抗虫鉴定重复两次，取平均值作为抗性级别并推测此单株基因型。

表1 水稻抗褐飞虱性能鉴定的分级标准

(二)186S/08BPH327F₂群体的分子标记分析

(1)用CTAB法(Murray&Thompson，1980Rapid isolation ofhigh-molecular-weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325)提取亲本及F₂群体各单株的叶片基因组DNA。

(2)根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的SSR标记按照较均匀的遗传距离选择一定数目分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，参考水稻品种日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。其中，SSRIT设置参数为：最小基序长度为3聚体，最小重复数为5，搜索所有的SSR基序。选择所有大于15个碱基(基序长度×重复数)的SSR基序，最后，基于该基因最后定位区段，比较该区段在水稻品系(种)9311及日本晴相应的基因组序列，在两者具有差异的区段设计STS标记用于最后期的精细定位。

(3)SSR标记的分析参照邱永福的方法(邱永福，水稻抗褐飞虱基因定位与遗传效应分析，武汉大学，博士论文)。

反应体系组分如下：

本实验所用的SSR和STS引物的扩增产物长度一般介于100-300bp之间，采用的PCR反应程序为：

不同引物所用的条件可能有差异，主要体现在退火温度的不同，有时需要针对每对引物调整适宜的退火温度，而具体的温度可以参照GRAMENE网站公布以及引物设计软件给出的的数值进行设定。

扩增产物用6％的变性PAGE胶分离，通过银染显色(Zhu et al,2004Identification and characterization of a new blast resistance gene located on ricechromosome 1through linkage and differential analyses.Phytipathology94:515-519)记录扩增的DNA条带。亲本间有多态的引物在F₂群体中进行分析，获取群体基因型资料。

(4)根据F₂单株的抗虫级别，分别选择12个极端抗虫单株和12个极端感虫单株的叶片基因组DNA混合构建抗、感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗感DNA池并获得有多态性的分子标记，该类多态性标记表明很可能与抗性是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选F₂分离群体的各个单株，PCR程序同上，获得群体基因型资料。根据连锁交换规律，利用软件JoinMap 3.0将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合F₂群体各个单株的分子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别，利用MapQTL 5.0软件复合区间作图法，对目标染色体进行QTL位点扫描。

(三)利用分子标记筛选186S/08BPH327和9311/08BPH327F₃重组单株精细定位基因qBph29(t)。

根据QTL的定位结果，用初步定位两侧的SSR标记RM16720和RM16763筛选F₃单株，获得两个标记间发生重组的单株。同时在初步定位区段内筛选更多在亲本间具有多态性的引物，结合重组单株的基因型和表型，考察标记与抗性表型共分离的情况。

(四)结果与分析

苗期集团法接虫鉴定结果表明08BPH327和186S的平均抗虫级别分别为2.9和8.9，这表明08BPH327高抗褐飞虱而9311高感褐飞虱。132个F_2:3家系对褐飞虱的平均抗虫级别频率分布呈连续分布，最小值为1.03，最大值为9.0。通过重组单株的基因型和相应家系的平均抗虫级别(见图2)。

根据对褐飞虱的抗虫级别将F_2:3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表型，而相应的F₂单株的基因型则分别记为RR(纯合抗虫)、Rr(杂合抗虫)和rr(纯合感虫)三种。F₂群体对褐飞虱的抗感分离符合1:2:1的比例(χ_c ²＝1.02＜χ² _0.05,2＝5.99)(表2)

表2 186S/08BPH327F₂分离群体132个株系对褐飞虱抗感分离比

^aRR，纯合抗虫；Rr杂合抗虫；rr，纯合感虫；^b1RR:2Rr:1rr适合性检测值χ²＝1.00，χ² _0.05＝3.84；^c抗虫级别值：RS，Resistance Score(抗虫级别)

根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的标记按照比较均匀的遗传距离选择合成一定数目的分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，比较水稻品系(种)9311及日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)来寻找SSR基序，或者根据9311与日本晴序列对比情况设计STS分子标记。

用亲本间有多态性的SSR标记分析F₂单株的基因型，同时结合各单株的抗性值进行QTL扫描。结果表明第4染色体长臂RM16720和RM16763间存在一个QTL位点，LOD值为20.7，抗性贡献率为44.5％。

分子标记RM16720和RM16763在测序的粳稻品种日本晴基因组序列中的物理距离约1.3Mb，为了寻找与qBph29(t)连锁更紧密的标记，本发明用RM16720和RM16763筛选了6000个F₃单株。同时在初步定位区段内筛选更多在亲本间具有多态性的引物。利用这两个标记之间的其他标记检测筛选获得的76个重组单株的基因型，并结合其抗虫鉴定结果，最后将qBph29(t)定位于RM16720和YM54之间，并与标记YM70紧密连锁(图1)，参考日本晴基因组序列可知，RM16720和YM54之间的物理距离约120kb。在将该抗性基因杂交转育到其它品种材料后，利用分子标记YM70检测抗性基因存在的准确率均达到95％以上，因此，利用两者之间的分子标记YM70来鉴定qBph29(t)的存在具有非常高的效率，这样也大大提高抗褐飞虱水稻品种的育种进度。

实施例2：分子标记的验证

1、材料和方法

1.1材料

阴性品种：30份，感虫品系(种)186S、9311、日本晴、台中本地1号、白毛和白R54，均为本实验室保存的常规水稻材料，186S×08BPH327或9311×08BPH327杂交组合后代中的感虫家系24份。

阳性品种：高抗虫品系08BPH327、186S×08BPH327或9311×08BPH327杂交组合后代中的抗虫家系共29份。

YM70是基于08BPH327和9311基因组相应序列设计开发的一个分子标记。

扩增分子标记的引物对的上游引物为Seq ID NO.1所示的序列，引物对的下游引物为Seq ID NO.2所示的序列；

Seq ID NO.1：5’-CTCTCCCCTCCAATCCTTTT-3’

Seq ID NO.2：5’-AGCACCCTGGAAAGCAGTAG-3’。

1.2方法

CTAB抽提法提取水稻样品叶片基因组DNA，用分子标记YM70扩增样品DNA，扩增产物用6％的变性PAGE胶分离，通过银染显色记录扩增的DNA条带。(方法同实施例1)

2、结果：

用上述方法，分别对水稻品系186S、9311、08BPH327等60份不同样本的基因组DNA进行PCR扩增(图2)。结果表明，在阳性样本中均能扩增出相应的205bp片段，而在阴性样本中均不能扩增出这些片段。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱主效基因的样本，从而大大提高抗虫水稻材料的选择效率。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (5)

1.水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的分子标记，其是由下列引物对经PCR扩增获得，所述引物对的上游引物为Seq ID NO.1所示的序列，所述引物对的下游引物为Seq ID NO.2所示的序列；

Seq ID NO.1：5’-CTCTCCCCTCCAATCCTTTT-3’

Seq ID NO.2：5’-AGCACCCTGGAAAGCAGTAG-3’。

2.权利要求1所述分子标记用于筛选水稻抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的方法，其特征在于，包括步骤：以待检测的水稻基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，如果引物能够扩增出205bp的基因片段，说明待检测的水稻存在抗褐飞虱主效基因qBph29(t)。

3.权利要求1所述的分子标记在水稻辅助育种中的用途。

4.一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其特征在于，使用权利要求1中所述的引物对，以待检测的水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，并判断是否能扩增出205bp的基因片段，如果能扩增出所述205bp片段，则标志着该待检水稻为存在抗褐飞虱主效基因qBph29(t)的抗性水稻材料。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：以待检测的水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增后，可以通过凝胶电泳检测或测序的方式，判断是否能扩增出205bp的基因片段。