KR101429231B1

KR101429231B1 - 벼 현미 종피색으로부터 안토시아닌을 함유하는 흑미 선별용 프라이머 및 이를 이용한 흑미 품종 선별 방법

Info

Publication number: KR101429231B1
Application number: KR1020120110742A
Authority: KR
Inventors: 황운하; 김상민; 박수권; 권택민; 박동수; 이종희; 조준현; 신동진; 김상열; 이지윤; 한상익; 여운상; 송유천; 강항원; 남민희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-10-05
Filing date: 2012-10-05
Publication date: 2014-08-13
Also published as: KR20140046570A

Abstract

본 발명은 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행함으로써 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 영양생장 후 출수 및 등숙이 이루어진 이후에 종피의 색을 확인할 수 있는 기존의 선발방법에 비해 흑미여부 판별을 유묘상태에서 가능하게 해주며, 또한 형질의 동형/이형 판별을 가능케 하여 흑미의 조기선발 및 최소자원을 활용한 육종효율을 증진시키는 장점이 있다.

Description

벼 현미 종피색으로부터 안토시아닌을 함유하는 흑미 선별용 프라이머 및 이를 이용한 흑미 품종 선별 방법{Primer Sets for Selecting Discriminating Color of Anthocyanin in Rice Pericarp and the Selecting Method thereof}

본 발명은 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행함으로써 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하는 방법에 관한 것이다.

최근 생활수준이 높아지고 건강에 대한 관심이 증가하는 가운데 쌀 소비량은 매년 하락하는 추세를 보이고 있다. 이러한 상황에서 쌀 산업은 기존의 생산량 위주에서 품질 위주로 변화되고 있다. 최근 쌀 생산량 증가와 소비량 감소, MMA물량의 수입에 의해 쌀의 재고가 남아돌고 있는 상황에서 소비자의 기호 및 취향에 맞추며 건강기능성까지 함유하는 기능성 벼, 특히 항산화물질로 각광받는 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미의 개발 및 재배는 쌀의 소비 확대 및 새로운 수요 창출이라는 측면에서 바람직할 것이다.

그러나, 새로운 품종을 개발하여 생산하기 위해서는 일반적으로 8-10년 이상의 시간이 소요되며 계통 전개 및 선발을 위한 넓은 재배면적이 필요하다.

우리나라에서 재배되고 있는 벼 품종들은 대부분 현미의 색깔이 옅은 황백색을 띠고 있으나, 최근 항산화물질로 그 효능이 인정받는 안토시아닌 색소를 함유한 식품에 대한 선호가 증가하는 추세이므로 이를 다량 함유하는 흑미품종의 품종개량에 대한 요구가 증가하고 있다.

이러한 요구에 따라, 흑미의 개발 및 생산을 위한 효율적 육종을 위해서는 유모 상태의 벼에서 현미 종피의 색을 판별하여 흑미 여부를 조기에 판별, 육종에 필요한 흑미 개체들을 선발, 재배함으로써 현미 종피색을 선발하기까지의 시간을 줄이고 계통전개에 따른 포장 면적을 줄여 육종 효율을 증진시키는 기술이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하기 위한 프라이머 세트를 제작하고, 이를 사용하여 흑미와 백미의 교배 후대집단의 벼에서 추출한 genomic DNA에 대하여 PCR을 수행하고 이를 각 개체의 이삭에 달린 벼 종피와 비교한 결과, PCR 증폭산물의 분석을 통하여 흑미 종피색을 판별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 안토시아닌 색소를 종피에 함유하는 흑미와 그 외의 현미 종피색을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 판별하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트

로 이루어진 군으로부터 선택되는 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 판별용 프라이머쌍을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터

선택되는 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 판별용 분자 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은

(i) 벼 시료에서 DNA를 분리하는 단계;

(ii) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

(iii) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;

를 포함하는 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 판별 방법을 제공한다.

본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명의 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 선발하는 방법을 이용하면, 안토시아닌 유전자의 위치와 아주 밀접하게 연관된 마커를 이용하여 효율적으로 판단할 수 있으며, 이를 유묘 상태에서도 판별 가능하다

(ii) 본 발명에 따른 상기 분자 마커는 형질의 동형/이형 판별을 가능케 하여 흑미품종의 조기선발 및 최소자원을 활용한 육종효율을 증진시키는 장점이 있다.

도 1은 자포니카/인디카 계통의 흑미와 백색미 품종의 Ra gene 염기서열 분석결과 흑미와 백미 사이에 공통적으로 나타나는 유전자염기서열상의 차이를 나타내는 도이다. 흑미와 백색미의 genomic DNA의 Ra gene 7kb 근방에서 각각 2bp, 1bp의 결손이 나타난다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트에 의한 흑미벼와 백미벼의 증폭산물 크기차이를 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR 결과와 육안검정의 결과를 비교해 놓은 검정표의 예시이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 판별하기 위한 프라이머 세트;

바람직하게는, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안토시아니딘"은 식물의 꽃이나 과실 껍질 등에서 고운 빛깔을 가지는 부분에 많이 존재하는 성분으로 주로 적색이나 청색, 자색 등을 나타낸다. 이것은 당 중에서 특정한 히드록시기와 각종 알코올, 페놀, 알데히드 등의 작용기가 에테르형 결합을 하여 이루어진 화합물이다. 보통 산을 가하면 적색으로 변하고 빨리 퇴색하는 성질이 있다. 꽃이 천차만별로 아름다운 색조를 나타내는 것은 이 안토시안이 식물체 속에서 칼륨, 마그네슘 등인 금속염과 여러 가지 복잡한 착물을 형성하기 때문인 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 백색미의 종피색은 백색, 유색미의 종피색은 흑색 또는 갈색일 수 있다.

본 발명에서 용어, "현미 종피"는 현미의 표면을 둘러싼 '과피' 내부의 얇은 막으로, 종피 안쪽이 식물학적으로 종자에 해당한다. 현미의 종피는 자방내의 주피가 발달한 엷은 조직으로, 완숙립에서는 세포조직이 붕괴되어 하나의 막 모양을 형성한다. 안쪽에는 주심에서 유래한 엷은 외배유가 있으며, 현미 종피의 안토시아니딘계 색소 유무에 따라 백색미와 안토시아니딘계 유색미로 판별되며, 안토시아니딘계 유색미의 경우 유전자의 발현에 따라 흑색미와 갈색미로 판별할 수 있다.

본 발명에서 용어, "올리고뉴클레오티드"는 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN) 또는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 또는 올리고리보뉴클레오티드라고도 하며, 1 내지 수백 염기의 길이를 갖는 비교적 짧은 길이의 핵산을 의미한다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3발단 수산화기(free 3' htdroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.

백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색 을 판별하기 위하여, 본 발명의 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 사용할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 백색미, 흑색미의 종피색을 결정하는 유전자인 Ra 서열을 분석하여 제작된 것으로, 대립유전자의 조성에 따라 PCR 증폭산물이 달리 생성되도록 하는 프라이머 세트로서 PCR 증폭산물의 분석을 통하여 벼 현미 종피색을 판별할 수 있다.

구체적으로, 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용하여 백색미와 유색미를 판별할 수 있다.

또한, 교배후대에서 Ra 형질의 동형/이형 여부를 확인하기 위해서 서열번호 1, 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 1, 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용할 수 있다.

선택되는 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은

(i) 벼 시료에서 DNA를 분리하는 단계;

(iii) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;

상기 (i)단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Pla nt Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., N uc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

또한 상기 (ii)단계에서 본 명세서에 기술된 용어“증폭하는 단계”는 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR(24), 핫 스타트(hot start) PCR(25, 26), 네스티드(nested) PCR(2) 및 부스터(booster) PCR(27)이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 벼 시료에서 추출된 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함 한다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5 ~ 2. 5mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg²⁺가 과량인 경우는 비 특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg² ⁺가 부족한 경우 PCR산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충 용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94 ~ 95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변 성 및 증폭은 94 ~ 95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있다. 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 55 ~ 60℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 60초를 35 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.

상기 (iii) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게 는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치 (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. PCR 증폭 결과는 바람직 하게는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)과 형광염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 방법은 상기 PCR 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 있어서 중합효소연쇄반응은 멀티플렉스(multiplex) PCR을 통해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 형광 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행할 수 있다. 멀티플렉스 PCR을 수행하면 PCR 시간 및 반응을 단축할 수 있는 장점이 있다.

이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합 효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확 인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(1) 실시예 1. 본 발명의 프라이머 세트의 디자인

다른 식물체에서 안토시아닌 합성을 조절하는 유전자와 서열비교를 통해, 안토시아닌을 함유하는 흑미의 종피색을 결정하는 유전자는 4번 염색체에 위치하는 putative anthocyanin regulatory Lc protein (Ra) gene일 것이라 예측되어 왔다.

또한 농림기술개발보고서 ‘고항산화활성활성물질 함유 쌀 생산기술 개발’(정일민, 2002)에 따르면 염색체 4번에 존재하는 RM317 분자마커가 종피에 C3G가 축적되는 흑자색적자색 계통의 분자마커로 쓰일 수 있음을 밝혔으므로, 위 RM317 마커의 염색체상 위치와 putative anthocyanin regulatory Lc protein (Ra) gene의 염색체 상 위치를 비교해볼 때 유전자지도상에서 상당히 근접해 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 여러 품종의 흑미벼와 백미벼의 Ra gene을 염기서열 분석하여 각 품종의 유전자 중 흑미와 백미 품종에 따라 공통적으로 차이가 나는 염기서열부위를 찾아내었고(도 1), 위 염기서열상의 차이를 이용하여 흑미와 백미에 따른 PCR증폭의 차이를 나타내는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트를 제작하였다(표 1).

백미의 경우 위 프라이머세트로 서열번호 1 및 서열번호 2를 PCR증폭할 경우 약 450bp의 증폭산물이, 흑미의 경우 서열번호 1 및 서열번호 3을 PCR 증폭할 경우에는 약 215bp의 증폭산물이 생성되며, 대립유전자가 hetero로 존재할 경우 두 가지 사이즈의 증폭산물이 동시에 증폭되는 것을 확인하였다(도 2).

Primer name		염기서열(5' to 3')	비고
Rice seed coat multiplex 5'	서열번호 1	GTTTCTGCAGGAGCGAAGAG	-
multiplex 3' for black rice (정방향)	서열번호 2	AAAGGTACCAAAGATCGCAGAA	증폭산물 약 215bp
multiplex 3' for other color (역방향)	서열번호 3	GGAGAGCTTCTGTAATCATCAA	증폭산물 약 450bp

(2) 실시예 2: 벼 현미종피색에 안토시아닌을 함유하는 흑미여부 판별을 위한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR 분석

2-1) 실험방법

1) 식물재료

흑미 판별마커를 검정하기 위해 표 2와 같은 교배후대집단 중 200개체를 선정하여 잎을 채취하고 이후 등숙한 이삭을 채취하여, 본 발명의 프라이머 세트를 가지고 잎에서 추출한 genomic DNA를 증폭하여 결과를 분석하고, 이삭에서 현미를 채취하여 종피색을 육안으로 판별하여 각각의 결과를 비교하였다.

검정계통	밀양244/보석흑찰 F2
모본	밀양244호(백색미)
부본	보석흑찰(흑미)

2) genomic DNA 추출

Lee et al. 2008 JSCS. 40(3):286-290에 개시된 Modified CTAB DNA Method에 따라 벼에서 에서 DNA를 추출하였다.

잎 0.2 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 퀵프랩 버퍼(200 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 1.5 mL과 함께 튜브에 넣은 후, 60 ℃에 1 시간 반응시켰다. 10,000 X g에서 10 분 원심분리하여 상층액 400 ㎕를 새 튜브에 넣고,isopropanol 300 ㎕를 첨가 후 잘 섞은 후 -80 ℃에서 30 분 반응시켰다. 20,000 X g에서 10 분 원심분리하여 상층액을 제거하고, 70% ethanol를 넣고 가볍게 씻어준 후 30 분 건조시켰다. DNA 추출버퍼(10 mM NH4OAC, 0.25 mM EDTA) 150 ㎕를 첨가 후 잘 섞어주었다. 60 ℃에서 1 시간 반응 후 10,000 X g에서 10 분 원심분리하여 상층액 100 ㎕를 새 튜브에 넣었다. 이렇게 추출한 DNA를 이용하여 본 발명에 관련된 실험을 수행하였다.

3) PCR 반응

본 발명의 프라이머 세트로 상기 2)에서 추출한 genomic DNA를 증폭하고, 증폭산물을 분석함으로써 벼 현미의 안토시아닌 함유 여부를 판별하기 위하여 다음의 PCR조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR 프라이머로 상기 표 1의 프라이머 세트를 사용하고, 3'-5' 엑소 뉴클레아제 활성이 없는 Taq polymerase를 사용하여 94 ℃ 30초, 56.5 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다.

PCR 반응 방법으로 DNA는 각 50 ng을 사용하였으며, SSR 마커 프라이머쌍은 각각 10 pmol를 사용하였으며, PCR 증폭에 관련하여 폴리머라제 및 PCR 완충액이 혼합되어 있는 premix(Cat. No. G2002, (주) 제넷바이오)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 증폭 조건으로는 추출된 각 계통의 50 ng의 게놈 DNA를 이용하여 30 ㎕ 의 부피 (100 pM의 각 프라이머, 200 μM 각각의 dNTPs, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 0.5 U Taq 중합효소) 조건에서 94.5 ℃, 5 분, 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분, 40 번 반복 반응한 후 마지막으로 72 ℃에서 10 분간 반응한 후 증폭하였다.

PCR 증폭 후, 서열번호 1번, 서열번호 2번 및 서열번호 3번의 프라이머 세트를 사용하여 증폭한 증폭산물은 1 %의 아가로즈 겔(EtBr 0.5 ㎍/ml 함유) 상에서 U.V.로 확인하였다.

2-2) 실험결과

1) PCR 을 이용한 벼 현미의 안토시아닌 함유 여부 판별

서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트를 사용하면 흑미의 경우 Ra 유전자부위가 약 215bp 크기로 증폭되며, 백미의 경우 약 450bp 크기로 증폭되는 것을 확인하였으며, 흑미의 genomic DNA와 백미의 genomic DNA를 섞은 경우, 각각의 크기의 증폭산물이 동시에 생성됨을 확인하였다.(도 2).

서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트를 사용하여 백색미와 흑색미의 교배후대 집단에서 추출한 genomic DNA에 대한 증폭반응을 수행하고, 그 결과를 도 3 에 나타내었다.

2) 현미 종피의 안토시아닌 함유 여부 육안판별

백색미와 흑색미의 교배후대 집단에서 채취한 이삭에서 현미를 얻은 후 종피색을 육안으로 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 백색미와 유색미를 판별하기 위한 프라이머로 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 세트를 제작하고, 이를 사용하여 백색미(밀양244호), 흑색미(보석흑찰)에서 추출된 genomic DNA에 대하여 PCR 하였다. 그 결과, 증폭산물의 크기 분석을 통하여 백색미인 밀양244호에서는 450bp의 증폭산물이 발현되는 것을 확인하였고, 흑색미인 보석흑찰에서는 215bp의 증폭산물이 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

지금까지 흑미의 경우 두 개의 보족유전자에 의해 F2 후대의 경우 흑미:갈색미:백미의 분리비가 9:3:4임이 알려져 왔으나, 본 실험에서는 현미의 종피에 안토시아닌을 함유하는지의 여부만을 판별하기 위하여 갈색미를 흑미에 포함하여 육안검정하였다.

이와 같이, 3종의 프라이머 세트로 genomic DNA를 증폭하고, 벼 이삭에서 채취한 현미의 종피를 육안으로 확인한 결과 두 결과가 모두 일치하여, 프라이머를 이용한 벼 종피의 안토시아닌 함유 여부 판단이 가능함을 확인하였다(도 3).

<110> Republic of Korea (Management: Rural Development Administration) <120> Primer Sets for Selecting Discriminating Color of Anthocyanin in Rice Pericarp and the Selecting Method thereof <130> DP-2012-2010 <140> 10-2012-0110742 <141> 2012-10-05 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rice seed coat multiplex 5' <400> 1 gtttctgcag gagcgaagag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multiplex 3' for black rice: forward primer for Selecting Discriminating Color of Anthocyanin in Rice Pericarp <400> 2 aaaggtacca aagatcgcag aa 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multiplex 3' for other color: reverse primer for Selecting Discriminating Color of Anthocyanin in Rice Pericarp <400> 3 ggagagcttc tgtaatcatc aa 22

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색을 판별하기 위한 프라이머 세트.
청구항 1에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트.
청구항 1에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트.
청구항 1에 있어서, 상기 백색미의 종피색은 백색, 유색미의 종피색은 흑색 또는 갈색인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색 판별용 키트.
1) 벼에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 DNA를 주형으로, 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 상기 PCR 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 백색미와 안토시아니딘계 색소를 종피에 함유하는 유색미의 현미 종피색 판별방법.
청구항 6 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이며, 상기 벼 현미 종피색은 백색 또는 유색인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이며, 상기 벼 현미 종피색은 흑색 또는 갈색인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.