KR102228064B1 - 흑미 품종을 판별을 위한 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑미를 판별하기 선별하기 위한 프라이머 세트. 이를 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 흑미를 판별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 영양생장 후 출수 및 등숙이 이루어진 이후에 종피의 색을 확인할 수 있는 기존의 선발방법에 비해 흑미 여부 판별을 유묘상태에서 가능하게 해주며, 또한 형질의 동형/이형 판별을 가능케 하여 흑미의 조기선발 및 최소자원을 활용한 육종효율을 증진시키는 장점이 있다.

Description

흑미 품종을 판별을 위한 마커 및 이의 용도{Marker for discriminating of black rice and use thereof}

본 발명의 흑미 품종 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 흑미 품종 판별용 키트 및 이를 이용한 흑미 품종 판별 방법에 관한 것이다.

식물 유래의 파이토케미컬은 다양한 약품, 산업, 농업 등에 이용되기에 파이토케미컬의 생산증진과 개발에 관한 연구가 진행되고 있다. 특히 안토시아닌 색소는 식물의 다양한 조직(잎, 과실, 꽃)에 축적되어서 종자수분, 병원균에 대한 방어, 빛에 대한 식물보호의 기능을 가지며, 또한 뛰어난 항산화, 항염, 항암의 효과를 지니고 있어서 오랜 기간 주목받고 있다.

최근 생활수준이 높아지고 건강에 대한 관심이 증가하는 가운데 쌀 소비량은 매년 하락하는 추세를 보이고 있다. 이러한 상황에서 쌀 산업은 기존의 생산량 위주에서 품질 위주로 변화되고 있다. 최근 쌀 생산량 증가와 소비량 감소, MMA 물량의 수입에 의해 쌀의 재고가 남아돌고 있는 상황에서 소비자의 기호 및 취향에 맞추며 건강기능성까지 함유하는 기능성 벼, 특히 항산화물질로 각광받는 안토시아닌 색소를 함유하는 흑미의 개발 및 재배는 쌀의 소비 확대 및 새로운 수요 창출이라는 측면에서 바람직할 것이다.

그러나 새로운 품종을 개발하여 생산하기 위해서는 일반적으로 8-10년 이상의 시간이 소요되며 계통 전개 및 선발을 위한 넓은 재배면적이 필요하다. 우리나라에서 재배되고 있는 벼 품종들은 대부분 현미의 색깔이 옅은 황백색을 띠고 있으나, 최근 항산화물질로 그 효능이 인정받는 안토시아닌 색소를 함유한 식품에 대한 선호가 증가하는 추세이므로 이를 다량 함유하는 흑미 품종의 품종개량에 대한 요구가 증가하고 있다.

이러한 요구에 따라, 흑미의 개발 및 생산을 위한 효율적 육종을 위해서는 유모 상태의 벼에서 현미 종피의 색을 판별하여 흑미 여부를 조기에 판별, 육종에 필요한 흑미 개체들을 선발, 재배함으로써 현미 종피색을 선발하기까지의 시간을 줄이고 계통전개에 따른 포장 면적을 줄여 육종 효율을 증진시키는 기술이 요구되고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0105663호

본 발명의 하나의 목적은 서열번호18의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 흑미 품종 판별용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 흑미 품종 판별용 마커를 증폭하는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 흑미 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다

본 발명의 또 다른 목적은 벼에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 흑미 품종의 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로 서열번호18의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 흑미 품종 판별용 마커를 제공한다.

본 발명의 흑미 품종 판별용 마커는 서열번호18의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에서 흑미 품종 판별용 마커는 Kala3 유전자 프로모터 영역에서 백미 및 적미에서는 발견되지 않으나, 흑미 품종에서 특이적으로 삽입된 유전자 염기서열을 의미한다.

본 발명의 실시예에서 백미, 적미, 흑미에서 분리한 Kala3 유전자 프로모터 영역을 염기서열을 분석한 결과, 백미 또는 적미는 서열번호17의 1769 bp로 분석되었으며, 흑미의 경우 백미 또는 적미보다 331 bp를 더 포함하는 서열번호18의 염기서열로 분석되었다. 구체적으로 서열번호18의 Kala3 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위 -649번째 내지 -318번째에 서열번호20의 331 bp의 염기서열을 포함함을 확인하였다.

따라서 상기 마커는 서열번호20의 염기서열을 포함할 수 있으며, 상기 서열번호20은 구체적으로 서열번호18의 Kala3 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위의 -649번째 내지 -318번째에 위치한 염기서열일 수 있다.

상기 마커는 실험에 사용된 품종의 Kala3 유전자 프로모터 영역을 비교 분석하는 방법을 통해 Kala3 유전자 프로모터 영역에 특정 유전자가 삽입(insertion)된 영역을 탐색하고, 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 흑미 품종의 밴드와 비교하여 밴드크기가 동일한 경우, 사용됨 품종을 흑미 품종으로 판단할 수 있다.

본 발명에서 Kala3 유전자는 안토시아닌 생산과 관련한 R2R3 MYB 유전자의 일종으로, 서열번호3의 염기서열을 가지며, 서열번호4의 아미노산 서열을 암호화한다.

본 발명의 프로모터는 상기 Kala3 유전자의 프로모터를 의미한다.

상기 프로모터는 구체적으로 흑미 품종의 벼에서 분리된 Kala3 유전자 프로모터로, 서열번호18의 염기서열로 표시되며, 더욱 구체적으로 상기 흑미는 흑남일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 6품종의 벼(백미: HwS (화성), 흑미: HH (흑향), HK (흑광), HN (흑남), JSHC (조생흑찰), 적미: HoJJ (홍진주))에서 분리된 Kala3 유전자가 서열번호3의 염기서열을 가지며, 서열번호4의 아미노산 서열을 암호화함을 확인하였으며, 6품종의 벼에서 분리한 Kala3 는 R2R3 MYB 도메인을 지니는 단백질로 확인하였다.

상기에서 분리한 R2R3 MYB 전사인자인 Kala3는 bHLH 전사인자군인 OsB1과 OsB2와 강한 상호작용을 가짐을 확인하였다. 기존에 잎 및 엽귀와 같은 조직에서 안토시아닌 생합성을 조절하는 것으로 보고된 R2R3 MYB 전사인자인 OsC1은 OsB1과 상호작용함을 확인하였다. 또한 Kala3 단백질은 강한 autoactivation activity를 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 R2R3 MYB 전사인자인 Kala3 는 기존에 보고된 종자내의 안토시아닌 색소 생합성과 관련하는 bHLH 전사인자군인 OsB1과 OsB2와의 상호작용으로 종자내의 안토시아닌 색소 생성과 관련한다는 것을 알 수 있었다.

다음으로 벼 식물체에서 Kala3 유전자의 염기서열은 동일하나, 종자색에서 차이가 보이는 원인을 알아보고자 백미(동진, 일미) 및 흑미(흑남) 벼에서 Kala3 유전자의 프로모터 영역을 증폭하고 비교 분석하였다. 분석결과, 백미계통인 일미와 동진은 rice genome annotation project에서 예상된 프로모터 영역인 서열번호17(1,769 bp)과 동일한 길이의 염기서열이 확인되었고, 일미와 동진의 프로모터의 염기서열은 일치하였다. 그러나 흑미 계통인 흑남은 서열번호18(2,100 bp)의 염기서열이 확인되었다. 구체적으로 서열번호18의 흑남 유래 Kala3 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위 -649번째 내지 -318번째 331bp의 염기서열(서열번호20)이 삽입되어 있음을 확인하였고, 그 외의 염기서열은 일미, 동진과 일치됨을 확인하였다.

또한, Kala3 유전자 프로모터 영역의 구조를 분석한 결과, 백미인 일미, 동진은 repeat unit을 하나만 가지고 있으나, 흑남의 경우 2개의 repeat unit을 지니는 것으로 확인되었다. 구체적으로 repeat unit을 비교해 본 결과, repeat unit 1은 317 bp로 구성되어 있으며, repeat unit 2은 331 bp으로 구성되어 있으며, 이러한 프로모터 영역의 repeat unit 2의 삽입이 벼의 종자색의 차이를 나타내었다.

이를 확인하고자 Kala3 유전자 프로모터 영역에 특이적인 서열번호19의 정방향 프라이머 및 서열번호16의 역방향 프라이머를 이용하여 백미, 적미 및 흑미 계통의 25개의 벼 품종에서 PCR을 수행하였다.

분석결과 백미와 적미계열 품종에서는 1,459 bp의 PCR 산물이 확인되었으며, 흑미 계열 품종에서는 1,790bp의 PCR 산물이 확인되었다. 이러한 결과를 통해 Kala3 유전자의 프로모터 영역의 차이가 벼 종피색 생성에 관여할 뿐 아니라, Kala3 유전자의 프로모터 영역 repeat unit 2의 차이를 검출하여 종자가 맺히기 전에 조기에 벼 종자색을 구분하는 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다(도 7).

따라서 Kala3 유전자 프로모터에서 repeat unit 2의 염기서열, 즉 서열번호18의 흑남 유래 Kala3 유전자 프로모터 또는 상기 Kala3 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위의 -649번째 내지 -318번째의 331bp의 염기서열(서열번호20)을 검출하여 흑미 품종 판별에 이용할 수 있다.

본 발명에서 “흑미”는 현미의 과피 또는 종피색이 흑색이나 흑자색을 띠는 것은 유색미의 일종으로, 검은쌀 또는 검정쌀로 불리며, 다량의 안토시아닌계 색소가 함유하고 있다. 흑미에 다량 함유된 안토시아닌(anthocynin)은 수용성의 플라보노이드계 천연색소로, cyanidin-3-glucoside, malvidin-3-glucoside와 같은 배당체를 주성분으로 구성되어 있어 강력한 천연 항산화물질로 작용하며, α-tocopherol(비타민 E)과 유사한 항산화능을 지니고 있을 뿐만 아니라 항균활성, 항변이원성, 혈전 용해 활성, 항염증 활성, 노화방지, 면역력증진, 위암과 대장암 세포의 증식을 억제하며 지방세포의 분화를 억제하여 항비만 효과를 나타낸다.

본 발명에서 상기 흑미는 구체적으로 흑향, 흑진주, 흑광, 흑남, 조생흑찰, 피루루통(pirurutong), 수원493, 수원505로 이루어진 군에서 선택되는 품종을 포함한다.

본 발명의 다른 양태로 상기 흑미 품종 판별용 마커를 증폭하는 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 흑미, 마커에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에서 상기 프라이머 세트에 포함되는 프라이머는 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있고, 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

전술한 실시예에서 Kala3 유전자 프로모터 영역에 특이적인 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호16의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 백미계통인 일미와 동진은 서열번호17(1,769 bp), 흑미 계통인 흑남은 서열번호18(2,100 bp)의 염기서열이 확인되었다. 또한, Kala3 유전자 프로모터 영역에 특이적인 서열번호19의 정방향 프라이머 및 서열번호16의 역방향 프라이머를 이용하여 백미, 적미 및 흑미 계통의 25개의 벼 품종에서 PCR을 수행한 결과, 백미와 적미계열 품종에서는 1,459 bp의 PCR 산물이 확인되었으며, 흑미 계열 품종에서는 1,790 bp의 PCR 산물이 확인하였다.

따라서 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호15로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호16으로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하거나, 서열번호19로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호16으로 표시되는 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로 상기 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 흑미 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에서 프라이머 세트, 흑미에 관한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 키트에서, 상기 프라이머 세트 이외에 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 구체적으로 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태로 벼에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 흑미 품종의 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 벼 시료는 벼의 종자, 뿌리, 잎, 줄기 또는 화기(꽃), 이삭을 포함하는 식물체의 조직에서 유래한 모든 기관 및 세포, 캘러스, 식물 조직의 선발, 배양 및 식물체의 재분화를 위해 형질전환된 조직을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 DNA 추출은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 표적서열을 증폭하는 단계는 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호15 및 16으로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호16 및 19로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 표적서열을 증폭 시키는 것이다.

본 발명에서 표적서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.

본 발명에서 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5, Cy-3 또는 6-FAM을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 마커 조성물은 흑미를 백미 및 적미와 구분할 수 있어, 종자가 맺치기 전에 벼의 종자 색을 구분할 수 있고, 안토시아닌을 함유하는 기능성 쌀인 흑미를 조기 선발할 수 있어 육종연한의 단축 및 교배자원의 권리 보호에 유용하다.

도 1은 백미인 HwS (화성); 흑미인 HH (흑향), HK (흑광), HN (흑남), JSHC (조생흑찰); 및 적미인 HoJJ (홍진주)의 6개 벼 품종에서 Kala3 유전자의 다중 염기서열 분석 결과한 결과이다.
도 2는 벼 유래 안토시아닌 생합성 조절 인자들의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 분석한 결과로, (좌) 효모 세포내의 DEST22 및 32 운반체의 도입 확인한 것이며, (우) 효모세포 내에서 MBW 단백질군들간의 상호작용 분석한 것이다.
도 3은 Kala3 전자의 프로모터 영역의 PCR 산물 전기영동 결과이다(1: 일미, 2: 동진, 3: 흑남).
도 4는 Kala3 유전자의 프로모터 영역의 다중염기서열 분석결과이다.
도 5는 Kala3 유전자의 프로모터 영역의 구조를 분석한 결과이다.
도 6은 Kala3 유전자의 프로모터 영역의 repeat unit 1과 2의 서열 비교한 결과이다.
도 7은 백미, 흑미, 적미의 벼 품종의 종자색과 종피색 특이 프라이머를 활용한 PCR 검정 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예1: 벼 종자 색 생성에 관여하는 R2R3 MYB(Kala3) 유전자의 분리

벼 식물체에서 기능성 플라보노이드의 생성은 MBW 유전자군에 의해서 조절되어진다고 보고되고 있다. 벼 종자발달 시기별 RNA-seq 분석결과 유색벼 종자에서 높은 발현을 나타낸 R2R3 MYB 유전자들 중에서 LOC_Os03g29614인 Kala3 유전자를 분리하였다.

rice genome annotation project (rice.plantbiolgy.msu.edu)를 바탕으로 프라이머 Kala3-F(full) 와 Kala3-R(full)를 제작하여 이용하였다(표 1).

프라이머 명칭	염기서열
Kala3-F(full) 서열번호1	5’-ATGGGGAGGAAGCCGTGCTGCTCCAAGGAGGG-3’
Kala3-R(full) 서열번호2	5’-CTACTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’

상기 F는 forward 프라이머, R은 reverse 프라이머를 의미한다.

6품종의 벼(백미: HwS (화성), 흑미: HH (흑향), HK (흑광), HN (흑남), JSHC (조생흑찰), 적미: HoJJ (홍진주))의 잎에서 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하고 이를 주형(template)으로 사용하여서 PCR을 수행하였다. 기존에 보고된 벼 Kala3은 서열번호3의 966 bp의 염기서열을 가지며, 서열번호4의 321개의 아미노산을 암호화한다고 보고되어 있다.

상기 6품종의 벼의 Kala3의 아미노산 서열의 다중염기서열 분석 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이 모두 다 일치되는 서열을 나타냈다. 즉, 상기 6품종의 벼 (백미: HwS (화성), 흑미: HH (흑향), HK (흑광), HN (흑남), JSHC (조생흑찰), 적미: HoJJ (홍진주))의 Kala3의 서열은 기존에 보고된 Kala3와 핵산 서열 및 아미노산 서열에서 100% 일치하였다.

또한, 상기 6품종의 벼에서 분리한 Kala3는 R2R3 MYB 도메인을 지니는 단백질로 확인하였다.

실시예2: 벼 유래 안토시아닌 생합성 조절인자들의 상호작용 확인

안토시아닌 생합성 관련 유전자군들은 R2R3 MYB, bHLH 전사인자, WD40 repeat을 지니는 단백질들이 MBW 유전자군을 형성하여 안토시아닌 생합성을 조절하는 것으로 보고되고 있다.

벼에서 안토시아닌 생합성을 조절하는 것으로 보고된 R2R3 MYB 유전자( OsC1), bHLH 전사인자(OsB1 및 OsB2), WD40 repeat을 지니는 단백질(OsTTG1)과 본 연구에서 새롭게 분리된 Kala3 유전자와의 상호작용을 확인하기 위해서 이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid, Y2H) 분석을 수행하였다. Y2H 분석을 위해 먼저 각각의 종자에서 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하고 이를 주형(template)으로 표 2의 프라이머를 이용하여 각각의 유전자의 PCR을 수행하여, 각가의 유전자를 증폭하였다.

프라이머 명칭	염기서열
pENTR-OsB1-F 서열번호5	5’-CACCATGGAAGAGACCCCTCTGC-3’
pENTR-OsB1-R 서열번호6	5’-CTAGCTAGCTAGCTTGCTATAGCTTTCCGGAG-3’
pENTR-OsB2-F 서열번호7	5’-CACCATGGCATCTGCTCCTCCAGTTCAG-3’
pENTR-OsB2-R 서열번호8	5’-TTACGGCGCCTTCCCCTGTCCAATTTCGGTT-3’
pENTR-OsC1-F 서열번호9	5’-CACCATGGGGAGGAGAGCTTGCTG-3’
pENTR-OsC1-R 서열번호10	5’-TCACGCACACAAGTTCCAGGCG-3’
pDONR-Kala3-F 서열번호11	5’-AAAAAGCAGGCTTTATGGGGAGGAAGCCGT-3’
pDONR-Kala3-R 서열번호12	5’-AGAAAGCTGGGTTCTACTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’
pENTR-OSTTG1-F 서열번호13	5’-CACCATGGAGCAGCCCAAGCCGCCGTCGGT-3’
pENTR-OSTTG1-R 서열번호14	5’-TCAGACCCTGAGAAGCTGGACCTTG-3’

PCR을 수행하여 OsB1, OsB2, OsC1, OsTTG1은 pENTR, Kala3는 pDONR 운반체에 BP 반응을 시켜 운반체에 각각의 유전자를 도입하였고, 유전자의 염기서열을 분석하였다. pENTR와 pDONR에 유전자가 도입된 운반체를 GAL4 DNA 바인딩 도메인(binding domain)과 GAL4 DNA 활성화 도메인(activation domain)을 포함하고 있는 pDEST32와 pDEST22 벡터에 LR 반응을 시켜 최종적으로 Y2H용 운반체를 제작하였다. 제조된 Y2H용 운반체를 STRATAGEN사의 Yeast transformation protocol 방법을 따라 형질전환하고, 각 유전자가 도입된 형질전환 효모를 이용하여 단백질간의 상호작용을 분석하였다.

도 2의 좌측에서 효모세포에 pDEST32와 pDEST22 운반체가 모두 도입되었음을 확인하였고 도 2의 우측에서 선발배지(SD/-LTH +10mM 3AT)조건에서 MBW 유전자군간의 상호작용을 확인하였다.

도 2에서 R2R3 MYB 전사인자인 Kala3는 bHLH 전사인자군인 OsB1과 OsB2와 강한 상호작용을 가짐을 확인하였다. 기존에 잎 및 엽귀와 같은 조직에서 안토시아닌 생합성을 조절하는 것으로 보고된 R2R3 MYB 전사인자인 OsC1은 OsB1과 상호작용함을 확인하였다. 또한 Kala3 단백질은 강한 autoactivation activity를 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 R2R3 MYB 전사인자인 Kala3는 기존에 보고된 종자내의 안토시아닌 색소 생합성과 관련하는 bHLH 전사인자군인 OsB1과 OsB2와의 상호작용으로 종자내의 안토시아닌 색소 생성에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예3: R2R3 MYB 유전자의 프로모터 서열 비교

벼 식물체에서 Kala3 유전자의 염기서열은 동일하나, 종자색에서 차이가 보이는 원인을 알아보고자 rice genome annotation project (rice.plantbiolgy.msu.edu)를 바탕으로 프로모터 영역을 증폭할 수 있는 Kala3-pro-F와 Kala3-pro-R를 제작하였다 (표 3).

프라이머 명칭	염기서열
Kala3-pro-F 서열번호15	5’-TCCGGTTTCTCTTCTGTTCG-3’
Kala3-pro-R 서열번호16	5’-CGATCGAAGGCAAAGCTAGA-3’

프로모터 영역을 증폭하기 위해서 벼 3 품종 (백미: IM (일미), DJ (동진), 흑미: HN (흑남))의 genomic DNA를 분리하여 PCR을 수행한 결과 도 3에서처럼 백미계통인 일미와 동진에서는 1.9 Kb의 PCR 산물이 흑미 계통인 흑남에서는 2.2 Kb의 PCR 산물이 증폭되었다.

다음으로 각 벼 품종의 프로모터 영역의 증폭된 산물의 핵산염기서열을 분석하고자 pTOPO 운반체에 도입하여 양방향으로 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 백미계통인 일미와 동진은 rice genome annotation project에서 예상된 프로모터 영역인 서열번호17(1,769 bp)과 동일한 길이의 염기서열이 확인되었고, 일미와 동진의 프로모터의 염기서열은 일치하였다. 그러나 흑미 계통인 흑남은 서열번호18(2,100 bp)의 염기서열이 확인되었다 (표 4).

벼 품종별로 분리된 Kala3 유전자의 프로모터 염기서열을 다중염기서열 분석결과, 도 4에서처럼 백미계통인 일미와 동진의 경우 rice genome annotation project에서 예상된 프로모터의 염기서열은 100% 일치하였다. 반면 흑남 유래의 프로모터 유전자(서열번호18)의 Kala3 프로모터 유전자의 전사 시작부위(+1)를 기준으로 업스트림(upstream) 부위 -318 내지 -649 위치의 331bp의 삽입 영역이 확인되었고, 그 외의 염기서열은 일미, 동진과 일치됨을 확인하였다.

Kala3 유전자의 프로모터 영역을 구조분석해서 나타내면 도 5와 같다. 일미, 동진은 repeat unit을 하나만 가지고 있으나, 흑남의 경우 2개의 repeat unit을 지니는 것으로 확인되었다. repeat unit을 비교해 본 결과, repeat unit 1은 317 bp로 구성되어 있으며, repeat unit 2은 331 bp으로 구성되어 있으며, 염기서열의 상동성 검정결과 88%의 유사성을 나타내고 있다(도 6). 이러한 프로모터 영역의 차이가 종자색의 차이를 나타내는 것에 영향이 있는 것으로 생각된다.

실시예4: 종자색 구분마커 개발

Kala3 유전자의 프로모터 서열을 바탕으로 종피색 구분 마커를 개발하고자, Kala3_pro-F1(서열번호 19) : 5’-CAGCGTGGTTTGATTTTTCA-3’, Kala3-pro-R(서열번호 16): 5’-CGATCGAAGGCAAAGCTAGA-3’를 이용하여 표 5의 25개의 벼 품종으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR 검정을 수행하였다.

번호	약자	품종명	종류
1	DJ	동진	백미 (WHITE)
2	HY	화영
3	IM	일미
4	T65	T65
5	A58	A58
6	BR	블루라이스
7	HD	흑대구
8	PC	퍼플 체크 (Purple check)
9	HH	흑향	흑미 (BLACK)
10	HJJ	흑진주
11	HK	흑광
12	HN	흑남
13	HS	흑설
14	JSHC	조생흑찰
15	PR	피루루통 (pirurutong)
16	SW493	수원493
17	SW505	수원505
18	AM	앵미	적미 (BROWN)
19	CR1	고령1
20	HoJJ	홍진주
21	HYJ	한양조
22	JJJ	적진주
23	JKD	자광도
24	SCM	시가 차타 모치 (Siga chata mochi)
25	SSJ	수상조

그 결과 도 7에서처럼, 백미와 적미계열 품종에서는 1,459bp의 PCR 산물이 확인되었으며, 흑미 계열 품종에서는 1,790bp의 PCR 산물이 확인되었다. 이러한 결과를 통해 Kala3 유전자의 프로모터 영역의 차이가 벼 종피색 생성에 관여할 뿐 아니라, Kala3 유전자의 프로모터 영역 repeat unit 2(서열번호 20, 표 6)의 차이를 검출하여 종자가 맺히기 전에 조기에 벼 종자색을 구분하는 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.

	염기서열
repaet unit2 서열번호20	ataagaagtt ttgcaatagg ttttgccgaa agtctgtcgc ctgacaccga cacttatact 60 gtagatccgc ccctaaccac ggcaccaatg attgtatctg gttagtggag taattgagac 120 gaccaaatcc atccccttga gataaccaca tcatctaaga acggaatgcc ttgtgcaaat 180 tggagtcact acatatgaca tagccagacg tgtctcctgc tctctgcttg agatcaacaa 240 gagagagaga gagagcaaga gagacgctgc cgccatttat cgatgtcata atatgttaat 300 tatgcctaga ttatagtgtt atagtatatg g

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Marker for discriminating of black rice and use thereof <130> DP20190253 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kala3-forward primer(full) <400> 1 atggggagga agccgtgctg ctccaaggag gg 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kala3-reverse primer(full) <400> 2 ctactggtgg tggtggtggt ggtggtggtg gt 32 <210> 3 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kala3 gene <400> 3 atggggagga agccgtgctg ctccaaggag gggctgaaca ggggggcatg gacggcaatg 60 gaggacgaca tcctggtgtc ctacatcgcc aagcacgggg agggcaaatg gggagccctc 120 cccaagagag ccgggctgaa gcggtgcggg aagagctgcc ggctgcggtg gctcaactac 180 ctgcggccgg ggatcaagag gggcaacatc tccggcgacg aggaggagct catcctcagg 240 ctccacactc tcctcggcaa cagatggtcg ctgatagccg ggaggctgcc ggggcgaaca 300 gacaatgaaa tcaagaacta ctggaacagc accctcagca agcgggtcgc catgcaacgg 360 accgccgccg ccaccagcat gccggcggcg gccaccacca gcagcaatgc cgacgccgcc 420 ggcgctgctg cacgacgccg gcgatcgccg gagccccgca cggtcgtcgt cagcccaatc 480 cggaccaagg cgctgcggtg caacaacaac agcagcagcg ggatagtggt ggtgcagcag 540 gcaggcgcct gcagccacgg cggccgtccg ccggagagcg gcgcgccggg agacgcggcg 600 gctgataagg tggccacgcc gcaggcggtg cagcagcagc agcagcaaga gctggccgga 660 gcggaggatg acgacgacct gccggtgccg gccgtctgta tcgaccttga cttggacgac 720 atcgagctgg gaggactcga cggcttcctg atcagcccgt ggcgcggcgg cggccacgac 780 gacggtaacg ccgccgccgg agcggtgccg aatctgccga tgccgattgg ctatgagctc 840 ggcggcgccg gtggcggtgg cgaggctgga gctgttgacc tggaggcgtt gctggggcag 900 ctggaagcag aggaagacga cgacggtgac caccaccacc accaccacca ccaccaccac 960 cagtag 966 <210> 4 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kala3 protein <400> 4 Met Gly Arg Lys Pro Cys Cys Ser Lys Glu Gly Leu Asn Arg Gly Ala 1 5 10 15 Trp Thr Ala Met Glu Asp Asp Ile Leu Val Ser Tyr Ile Ala Lys His 20 25 30 Gly Glu Gly Lys Trp Gly Ala Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Lys Arg 35 40 45 Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Gly 50 55 60 Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Gly Asp Glu Glu Glu Leu Ile Leu Arg 65 70 75 80 Leu His Thr Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu 85 90 95 Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser Thr Leu 100 105 110 Ser Lys Arg Val Ala Met Gln Arg Thr Ala Ala Ala Thr Ser Met Pro 115 120 125 Ala Ala Ala Thr Thr Ser Ser Asn Ala Asp Ala Ala Gly Ala Ala Ala 130 135 140 Arg Arg Arg Arg Ser Pro Glu Pro Arg Thr Val Val Val Ser Pro Ile 145 150 155 160 Arg Thr Lys Ala Leu Arg Cys Asn Asn Asn Ser Ser Ser Gly Ile Val 165 170 175 Val Val Gln Gln Ala Gly Ala Cys Ser His Gly Gly Arg Pro Pro Glu 180 185 190 Ser Gly Ala Pro Gly Asp Ala Ala Ala Asp Lys Val Ala Thr Pro Gln 195 200 205 Ala Val Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Leu Ala Gly Ala Glu Asp Asp 210 215 220 Asp Asp Leu Pro Val Pro Ala Val Cys Ile Asp Leu Asp Leu Asp Asp 225 230 235 240 Ile Glu Leu Gly Gly Leu Asp Gly Phe Leu Ile Ser Pro Trp Arg Gly 245 250 255 Gly Gly His Asp Asp Gly Asn Ala Ala Ala Gly Ala Val Pro Asn Leu 260 265 270 Pro Met Pro Ile Gly Tyr Glu Leu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Glu 275 280 285 Ala Gly Ala Val Asp Leu Glu Ala Leu Leu Gly Gln Leu Glu Ala Glu 290 295 300 Glu Asp Asp Asp Gly Asp His His His His His His His His His His 305 310 315 320 Gln <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OsB1-Forward primer <400> 5 caccatggaa gagacccctc tgc 23 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OsB1-Reverse primer <400> 6 ctagctagct agcttgctat agctttccgg ag 32 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OsB2-Forward primer <400> 7 caccatggca tctgctcctc cagttcag 28 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OsB2-reverse primer <400> 8 ttacggcgcc ttcccctgtc caatttcggt t 31 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OsC1-forward primer <400> 9 caccatgggg aggagagctt gctg 24 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OsC1 reverse primer <400> 10 tcacgcacac aagttccagg cg 22 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDONR-Kala3-Forward primer <400> 11 aaaaagcagg ctttatgggg aggaagccgt 30 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDONR-Kala3-reverse primer <400> 12 agaaagctgg gttctactgg tggtggtggt ggtggtggtg gtggtggtgg t 51 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OSTTG1-Forward primer <400> 13 caccatggag cagcccaagc cgccgtcggt 30 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pENTR-OSTTG1-Reverse primer <400> 14 tcagaccctg agaagctgga ccttg 25 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kala3-promoter-Forward primer <400> 15 tccggtttct cttctgttcg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kala3-promoter reverse primer <400> 16 cgatcgaagg caaagctaga 20 <210> 17 <211> 1769 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilmi rice or dongjin rice Kala3 promoter <400> 17 tccggtttct cttctgttcg gttttttaca gtttttctaa agatgtataa gtaccaagtt 60 tatattcgta tgtataccaa atttatattc atacgtatag aaattttata tacgcgtata 120 tatacaaatt atatatgcgt atataaactt tctatacacg tatacaaacg cgtatacgaa 180 gtttgtatac gcgtatacaa actttatata cgcgtataca aactttatat acgcgtatac 240 aaactttata tacgcgtata caaactttct atacgtgatg tattttttat tttttttatt 300 tttagtgcgt atacaaactt tgtgtatgtg tgtatatatt ttttctgcat tgaaatatat 360 taaaccaaag cgatcacaac agctgcacgc taccactttg ccaaggtgaa gatgtatcaa 420 attcatcaaa gtataacgtt tagtttgtta ataacgtcaa aacaaattga agggtaatgc 480 acagagagaa gaattaacca gcgtggtttg atttttcaca acatgtaaac ccgtgtgagc 540 taaaacagat ggtcaattac ctaattataa tgtactaggg tgtatttata tttagtacta 600 cttattcacg taagtgaaaa aaaatattaa ccaatatcac tagacctatt atcaaaacaa 660 gagtgttata ggggagccta gctaagaccc tgttattttt tttattctag attttggatt 720 tttatttgca cgcttcccaa gctatgatac ttttcgtgaa aaatactata taattatttt 780 ggtatacttt tctataacaa attctcaact ttgtaaaagt taattgattt gtttataccc 840 tcaaatagcc attatacaaa tcatatgatc atagaaacaa actactctct tcgtcctata 900 atataagtat ttttggattt cgacataatt tttagatgct actttggtta acaatatata 960 taaaagtaag atgttttaaa taaagggagt tgcattttat gatagtttat tcaatgataa 1020 atctactagt aacattaatt ttaactgatt gatcttttta ttttttttct attaatagtc 1080 aaagttaaaa atgtttgaat tgacactatt ttaaaaatac ttatattttg gaacgggtgg 1140 agtataattt taagttcaac cgtacaaata cccgcgcata caggtcacct tcccagtttt 1200 gttaaagaag attccctaaa aaattccagg cgccgtttgg ttaaagtggt cggttgcgta 1260 aggcacgaac agttgggtta aagagttaaa ttggttggta ttaaccgctg atggtgaatg 1320 ccaacctcag aatctgtatg tggtcactct gcaaatcaaa gctactacgg atccagaaaa 1380 tcgattcgtt ggcatgtcta tcgatgtcat aatatgttaa ttatgcctag attatagtgt 1440 tatagtatat ggataagaag ttttgcaata ggttttgccg aaagtctgtc gcctgacacc 1500 gacacttata ctgtagatcc gcccctaacc acggcaccaa tgattgtatc tggttagtgg 1560 agtaattgag acgaccaaat ccatcccctt gagataacca catcatctaa gaacggaatg 1620 ccttgtgcaa attggagtca ctacatatga catagccaga cgtgtctcct gctctctgct 1680 tgagatcaac aagagagaga gagagagaga gcaagagaga cgctgccgcc attggcattg 1740 tttgtaggcg atcgatcgag caatcgtgg 1769 <210> 18 <211> 2100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> black rice Kala3 promoter <400> 18 tccggtttct cttctgttcg gttttttaca gtttttctaa agatgtataa gtaccaagtt 60 tatattcgta tgtataccaa atttatattc atacgtatag aaattttata tacgcgtata 120 tatacaaatt atatatgcgt atataaactt tctatacacg tatacaaacg cgtatacgaa 180 gtttgtatac gcgtatacaa actttatata cgcgtataca aactttatat acgcgtatac 240 aaactttata tacgcgtata caaactttct atacgtgatg tattttttat tttttttatt 300 tttagtgcgt atacaaactt tgtgtatgtg tgtatatatt ttttctgcat tgaaatatat 360 taaaccaaag cgatcacaac agctgcacgc taccactttg ccaaggtgaa gatgtatcaa 420 attcatcaaa gtataacgtt tagtttgtta ataacgtcaa aacaaattga agggtaatgc 480 acagagagaa gaattaacca gcgtggtttg atttttcaca acatgtaaac ccgtgtgagc 540 taaaacagat ggtcaattac ctaattataa tgtactaggg tgtatttata tttagtacta 600 cttattcacg taagtgaaaa aaaatattaa ccaatatcac tagacctatt atcaaaacaa 660 gagtgttata ggggagccta gctaagaccc tgttattttt tttattctag attttggatt 720 tttatttgca cgcttcccaa gctatgatac ttttcgtgaa aaatactata taattatttt 780 ggtatacttt tctataacaa attctcaact ttgtaaaagt taattgattt gtttataccc 840 tcaaatagcc attatacaaa tcatatgatc atagaaacaa actactctct tcgtcctata 900 atataagtat ttttggattt cgacataatt tttagatgct actttggtta acaatatata 960 taaaagtaag atgttttaaa taaagggagt tgcattttat gatagtttat tcaatgataa 1020 atctactagt aacattaatt ttaactgatt gatcttttta ttttttttct attaatagtc 1080 aaagttaaaa atgtttgaat tgacactatt ttaaaaatac ttatattttg gaacgggtgg 1140 agtataattt taagttcaac cgtacaaata cccgcgcata caggtcacct tcccagtttt 1200 gttaaagaag attccctaaa aaattccagg cgccgtttgg ttaaagtggt cggttgcgta 1260 aggcacgaac agttgggtta aagagttaaa ttggttggta ttaaccgctg atggtgaatg 1320 ccaacctcag aatctgtatg tggtcactct gcaaatcaaa gctactacgg atccagaaaa 1380 tcgattcgtt ggcatgtcta tcgatgtcat aatatgttaa ttatgcctag attatagtgt 1440 tatagtatat ggataagaag ttttgcaata ggttttgccg aaagtctgtc gcctgacacc 1500 gacacttata ctgtagatcc gcccctaacc acggcaccaa tgattgtatc tggttagtgg 1560 agtaattgag acgaccaaat ccatcccctt gagataacca catcatctaa gaacggaatg 1620 ccttgtgcaa attggagtca ctacatatga catagccaga cgtgtctcct gctctctgct 1680 tgagatcaac aagagagaga gagagagcaa gagagacgct gccgccattt atcgatgtca 1740 taatatgtta attatgccta gattatagtg ttatagtata tggataagaa gttttgcaat 1800 aggttttgcc gaaagtctgt cgcctgacac cgacacttat actgtagatc cgcccctaac 1860 cacggcacca atgattgtat ctggttagtg gagtaattga gacgaccaaa tccatcccct 1920 tgagataacc acatcatcta agaacggaat gccttgtgca aattggagtc actacatatg 1980 acatagccag acgtgtctcc tgctctctgc ttgagatcaa caagagagag agagagagag 2040 agcaagagag acgctgccgc cattggcatt gtttgtaggc gatcgatcga gcaatcgtgg 2100 2100 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kala3_promoter-Forward primer1 <400> 19 cagcgtggtt tgatttttca 20 <210> 20 <211> 331 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> repaet unit2 <400> 20 ataagaagtt ttgcaatagg ttttgccgaa agtctgtcgc ctgacaccga cacttatact 60 gtagatccgc ccctaaccac ggcaccaatg attgtatctg gttagtggag taattgagac 120 gaccaaatcc atccccttga gataaccaca tcatctaaga acggaatgcc ttgtgcaaat 180 tggagtcact acatatgaca tagccagacg tgtctcctgc tctctgcttg agatcaacaa 240 gagagagaga gagagcaaga gagacgctgc cgccatttat cgatgtcata atatgttaat 300 tatgcctaga ttatagtgtt atagtatatg g 331

Claims (10)

1. 서열번호18의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 흑미 품종 판별용 마커.
2. 제1항에서, 상기 마커는 서열번호20의 염기서열을 포함하는 것인 마커.
3. 제 1항 또는 2항의 흑미 품종 판별용 마커를 증폭하는 프라이머 세트.
4. 제 3항에서 상기 프라이머 세트는 서열번호15로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호16으로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하거나, 서열번호19로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호16으로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는, 프라이머 세트.
5. 제 3항에서 상기 흑미는 흑향, 흑진주, 흑광, 흑남, 조생흑찰, 피루루통(pirurutong), 수원493, 수원505로 이루어진 군에서 선택되는 품종인 것인 프라이머 세트.
6. 제 3항의 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 흑미 품종 판별용 키트.
7. 제 6항에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
8. 벼에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 흑미 품종의 선별하는 방법.
9. 제 8항에서 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인, 방법.
10. 제 8항에서 상기 표적서열은 서열번호20의 염기서열을 포함하는 것인, 방법.

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