KR20110105663A - 멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템을 이용한 여성 생식기 병원체 검출 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 14종의 여성 생식기 병원체를 동시에 검출하는 방법 및 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 키트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 분석하고자 하는 시료로부터 14종의 여성 생식기 병원체 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; 1차 증폭된 유전자 산물을 상기 프라이머 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자로 2차 PCR 증폭하는 단계; 2차 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계; 상기 반응물을 형광물질이 부착된 표지자의 특이적 결합제로 반응시키는 단계; 및 형광값을 측정하여 14종의 여성 생식기 병원체를 검출하는 단계를 포함하는 방법 및 14종의 여성 생식기 병원체에 특이적인 프라이머 및 검출용 프로브를 포함하는 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 다양한 여성 생식기 질환을 유발하는 원인 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있다.
Description
본 발명은 14종의 여성 생식기 병원체를 동시에 검출하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 분석하고자 하는 시료로부터 14종의 여성 생식기 병원체 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; 1차 증폭된 유전자 산물을 상기 프라이머 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자로 2차 PCR 증폭하는 단계; 2차 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계; 상기 반응물을 형광물질이 부착된 표지자의 특이적 결합제로 반응시키는 단계; 및 형광값을 측정하여 14종의 여성 생식기 병원체를 검출하는 단계를 포함하는 방법 및 14종의 여성 생식기 병원체에 특이적인 프라이머 및 검출용 프로브를 포함하는 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 키트에 관한 것이다.
여성의 비뇨 생식계 염증은 가장 흔한 질환으로서 이러한 염증은 세균성에서부터 기생충, 바이러스에 이르기까지 매우 다양한데, 소양감, 심한 염증과 악취를 동반하며 심하게는 불임을 유발하며 임신 중의 이러한 감염은 유산 및 신생아의 유전적 이상을 초래하는 등 심각한 질병을 유발하므로 적절한 예방 및 진단은 물론, 치료로서 치명적 합병증을 막는 것이 매우 중요하다. 대표적인 여성 생식기(외음부, 질, 자궁경부 등)의 감염으로는 세균성 바지노시스(bacterial vaginosis) 트리코모나스 질염, 외음부 및 질 칸디다증, 만성 외음부 칸디다증, 일반 염증성 질염, 위축성 질염 및 자궁경 질염 등이 있다. 이러한 비뇨 생식계 염증은 성교를 통해 감염 (Sexually transmitted disease ; STD)되는 경우가 많아 성인의 약 50% 이상이 최소한 한번 이상 감염될 정도로 흔한 질병이므로 STD 병원체 검사 제품의 수요가 더욱 많아질 것으로 예상된다.
그러나, 현재 미국 FDA 승인을 받아 상용중인 STD 병원체 검사 제품들은 PCR방법이나 Hybrid capture, Hybridization protection assay의 방법으로서 단지 2종의 STD 병원체 (C. trachomatis, N. gonorrhoeae)에 대해 단일 또는 다중으로 검사하는 정도이다. 그러나 이 두 종 이외의 다른 STD 또는 비뇨생식계 염증 유발 병원체들 역시 불임증이나 신생아의 유전적 이상을 초래하는 등 심각한 질병을 유발할 수 있으며 상당수의 성병은 무증상이고 감염자의 30%가 감염 사실을 모른 채 생활하고 있기 때문에 병원체의 확산을 막고 적절한 치료를 하기 위해 가능한 많은 병원체를 동시에 검사하는 방법이 절실히 필요한 실정이다.
질환의 치료나 진단에 있어 증상별로 접근하는 것이 편리하기는 하나, 효과적인 치료를 위해서는 병원체를 정확히 동정하는 것이 필요하다. 임상소견으로 병원체를 진단하기도 하지만, 정확한 동정을 위하여 도말, 배양 등의 전통적인 방법, 당이용법, 면역형광법, 공응집법 (co-agglutination) 및 단일군 항체 검사법 등이 행하여지고 있다. 최근에는 병원체의 RNA 또는 DNA 등를 검출하는 방법이 개발되고 있다.
최근 국내 바이오벤처에서 멀티플렉스 PCR기법을 이용하여 4-9종의 STD 병원체에 대한 검사 키트를 개발하여 판매하고 있으나, 이들은 멀티플렉스 PCR을 한 후 전기영동으로 증폭된 밴드의 크기를 보고 감염 여부를 판별하여야 하기 때문에 멀티플렉스 PCR에 포함시킬 수 있는 병원체의 수가 제한적일 수밖에 없고 같은 크기로 증폭된 비특이적 산물과 특이적 산물과의 구별이 어려우며 분석시 비슷한 크기로 증폭이 될 경우 판독자의 오류가 생길 수도 있다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 14종의 여성 생식기 병원체의 감염 여부와 정도를 분석하는 방법 및 그 조성물을 포함하는 키트를 개발하여 STD 병원체를 포함하는 비뇨 생식계 염증을 유발하는 주요 원인 병원체 14 종 및 양성대조군인 GAPDH를 높은 민감도와 정확도로 동시에 검출할 수 있는 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 포함하는 병원체를 동시에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브 및 상기 14종의 여성 생식기 병원체에 특이적인 프라이머를 포함하는 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기 기술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 일 양태로 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 포함하는 병원체를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
1) 분석하고자 하는 시료로부터 상기 14종의 여성 생식기 병원체 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계;
2) 상기 1차 증폭된 유전자 산물을 상기 프라이머 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자로 2차 PCR 증폭하는 단계;
3) 상기 2차 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계;
4) 상기 반응물을 형광물질이 부착된 표지자의 특이적 결합제로 반응시키는 단계; 및
5) 형광값을 측정하여 상기 14종의 여성 생식기 병원체를 검출하는 단계.
본 발명은 단계 1) 내지 5)로 진행되는 일련의 과정을 진행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있다.
단계 1)은 상기 14종의 여성 생식기 병원체 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 시료 내 DNA를 1차 PCR 증폭하는 단계로, 이 단계에서 시료 내 DNA 중에 있는 상기 14종의 여성 생식기 병원체 유전자는 지수적으로(exponential) 증폭된다.
본 발명에서 용어, "병원체"는 병을 일으키는 미생물 등을 말하는 것으로 세균, 바이러스, 리케차, 원충, 스피로헤타 및 곰팡이 등을 포함하며, 바람직하게는 병원성 세균 또는 곰팡이, 보다 바람직하게는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도 모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)을 포함하는 14종의 병원성 세균 또는 곰팡이를 가리킨다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 각 병원체의 16S 유전자 부위에 다중서열정렬(multiple ailingment)을 수행한 결과를 바탕으로 합성될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)로부터 얻어진 순방향의 프라이머는 서열번호 1, 역방향의 프라이머는 서열번호 2의 프라이머를 사용하였고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)로부터 얻어진 순방향의 프라이머는 서열번호 3, 역방향의 프라이머는 서열번호 4의 프라이머를 사용하였다. 특히 양성대조군인 GAPDH에 대한 순방향의 프라이머는 서열번호 5, 역방향의 프라이머는 서열번호 6의 프라이머를 사용하였다(표 1).
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 용어, "PCR(polymer chain reaction)"은 살아있는 유기체 없이 간단한 합성 효소 반응을 이용하여 주형이 되는 핵산으로부터 특정 DNA를 대량으로 증폭시키는 분자 기술로 정의된다. PCR은 주형이 되는 핵산, 프라이머, DNA 폴리머라제(DNA polymerase) 및 dNTP(Deoxynucleotide triphosphate)를 이용하여 핵산의 변성(denaturation), 프라이머의 결합(annealing) 및 DNA의 신장(extention)의 세 단계를 거쳐 진행된다. 각 단계에 적용되는 온도, 시간 및 반복 횟수는 PCR의 종류와 주형 DNA, 프라이머 또는 PCR 기기 등에 따라 달라질 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.
단계 2)는, 단계 1)에서 종 특이적으로 증폭된 유전자 산물을 프로브에 상보적인 가닥으로 증폭시키는 프라이머로 2차 PCR 증폭하는 단계로서, 프로브에 상보적인 가닥만이 선택적으로 증폭되므로 프로브와 유전자 산물과의 교잡 효율이 증가하게 된다.
본 발명에서 용어, "표지자"는 프라이머 표지 가능한 표지 물질로써 표지자가 표지된 dNTP 존재하에 PCR을 수행하여 유전자를 표지자로 표지하기 위한 것이다. 프로브와 유전자 산물과의 교잡을 방해하지 않고 유전자 표지를 위해 사용할 수 있는 것이라면 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 표지자로서 바이오틴을 사용하였고, 표지자의 특이적 결합제로서 스트렙타비딘을 사용하였으나 이에 제한되지 않으며, 다양한 흡수 파장을 갖는 다양한 형광 표지자 외에 기타 다양한 방사성 반감기를 갖는 방사성 표지자가 사용될 수도 있다. 표지자로 표지된 가닥으로의 증폭을 위하여 순방향 또는 역방향의 표지자로 표지된 프라이머를 사용한다. 교잡반응을 하는 프로브가 안티센스 가닥일 경우 순방향의 프라이머에 표지자를 표지하여 센스 가닥을 증폭시키고, 교잡반응을 하는 프로브가 센스 가닥일 경우 역방향의 프라이머에 표지자를 표지하여 안티센스 가닥을 증폭시키도록 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 역방향 프라이머를 사용하였다.
특히, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 시그널이 매우 낮은 문제를 해결하기 위해 2차 단일 가닥 PCR 표지화(labeling) 방법을 도입하여, 기존에 얻을 수 있었던 최대 MFI (mean fluorescence intensity, 시그널의 정도)값이 약 100 정도였던 것에 반하여, MFI 값이 약 1,000정도의 강한 시그널을 얻을 수 있었다. 2차 단일 가닥 PCR 표지화의 장점은 형광으로 표지된 대상이 비대칭 PCR(asymmetrical PCR)에서 얻어지는 것보다 많다는 데 있다. 두 PCR 방법 모두 선형 증폭(linear amplification)에 의하여 표지가 되나 비대칭 증폭의 경우 표지된 대상이 다시 이중나선을 합성할 수 있으므로 실제 비드 어레이에 결합될 확률이 급격히 감소한다.
단계 3)은, 상기 2차 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브가 고정된 마이크로스피어 비드와 교잡 반응하는 단계로서, 프로브가 고정되는 비드의 종류는 특별히 제한되지 않으며 비드 어레이 제조는 당 분야에 공지된 일반적인 방법에 따른다.
본 발명에서 용어, "프로브"는 상보적 염기서열을 가지는 핵산과 특이적으로 결합하므로 결합 여부에 따라 이로써 해당 핵산의 존재 여부를 알려줄 수 있는 핵산을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 프로브는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제작할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 각 병원체의 16S 유전자 부위에 대해 다중서열정렬 방법을 수행한 결과를 바탕으로 제작하였다. 상기 프로브를 사용하여 시료와 교잡 반응시, 14종의 여성 생식기 병원체를 특이적으로 검출할 수 있으면 어떤 서열의 프로브라도 모두 포함되며, 바람직하게는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브로서 각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 사용하였다(표 2).
본 발명의 구체적인 실시예에서 프로브는 2차 PCR을 통해 바이오틴-dCTP로 표지된 시료 유전자와 특이적 반응을 할 수 있도록 마이크로스피어 비드에 화학적으로 고정된 형태로 제공되었다.
교잡 반응시 사용되는 버퍼, 시간 및 온도 조건은 조절될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서 버퍼는 Hybrisol 버퍼를 사용하였고, 반응 온도는 95℃에서 5분, 40℃에서 30분으로 교잡 반응을 하였다.
단계 4) 및 5)는, 상기 프로브와 상기 방법으로 준비된 시료와의 반응 정도를 형광값으로 확인하는 단계이다. 본 단계에 사용되는 형광물질은 바람직하게는, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 피코에트린을 사용하였다.
본 발명에서 용어 "멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템(multiplex liquid array system)" 본 발명의 방법을 수행하기 위한 형광값 검출 방법으로서, 이러한 서스펜션 어레이의 특징은 한 튜브(Tube)안에서 교잡반응이 일어나는 3차원적 방법으로 반응 후 Luminex 100® (Luminex사, 미국)시스템에서 동시에 532nm과 633nm파장을 측정함으로써 형광값을 얻는다는 데에 있다. 633nm 파장에서 측정된 형광 값은 마이크로스피어 비드(microsphere bead)를 식별하며, 532nm 파장에서 측정된 형광값은 각 프로브와 반응한 PCR 산물이 스트렙타비딘-Cy3 또는 스트렙타비비딘-피코에리쓰린 결합으로 나타난 값이다 (Keji et al., Cytometry 33:31 8-323, 1998). 서스펜션 어레이는 프로우메트리(Fluorometry)기술을 이용한 Luminex 100® 시스템을 사용함으로써 고속측정이 가능하며, 1회 측정으로 100-300개의 마이크로스피어 비드의 형광값의 최대빈도를 확인하기 때문에 정확한 분석이 가능하며, 형광반응의 결과가 수치로 나타남으로써 정량 분석 및 자동화 시스템 적용이 용이하다 (Armstrong et al., Cytometry 40:102- 108,2000). 즉, 형광 액상다중분석기기인 Luminex 100®을 이용하면, PCR기법과 혼성화 기법을 이용한 기존의 키트에 비해 정확도와 민감도가 높으며, 마이크로스피어 비드 최대 100종에 각 병원체 특이적인 염기서열에 상보적인 염기서열을 가진 프로브를 결합시켜 검출하는 방식으로서 병원체 수를 최대 100 종류까지 동시에 검출 가능하므로 키트 내에 포함시킬 수 있는 병원체 수에 크게 제한을 받지 않고, 또한 소프트웨어 프로그램에 의해 지정된 마이크로스피어 비드 종류에 따라 형광 값이 수치로 표시되기 때문에 전기영동 사진 분석에 의한 오류를 배제시킬 수 있으며, 감염 여부뿐만 아니라 감염량의 많고 적음까지도 알 수 있기 때문에 정성 및 정량 분석도 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 종래 기술보다 특이도와 민감도가 높은 멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템을 이용하여 3차원적 교잡 반응 후에 Luminex 100®으로 두 종류의 파장을 동시에 측정하여 형광값을 얻었다. 각각 마이크로스피어 비드를 식별하는 형광값 (633nm) 및 시료와 특이적 결합제와의 결합의 정도를 측정하는 형광값(532nm)을 고속으로 측정하여 정성 및 정량 분석하였다. 이에 따라 상기 14종의 여성 생식기 병원체 감염 여부를 판정할 수 있었다.
다른 양태로 본 발명은 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)을 포함하는 병원체 검출용 프로브 및 병원체에 특이적인 프라이머를 포함하는 병원체 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따라 분석감도, 측정범위, 특이도, 교차반응성, 및 재현성에 있어서 현저한 효과를 나타내는 병원체 검출용 키트는 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있게 했다.
이미 기술한 내용과 반복되는 사항은 반복을 피하기 위하여 생략한다.
다른 양태로 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 포함하는 병원체를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
1) 분석하고자 하는 시료로부터 상기 14종의 여성 생식기 병원체 유전자 에 특이적인 프라이머 세트 및 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계;
2) 상기 1차 증폭된 유전자 산물을 상기 프라이머 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자로 2차 PCR 증폭하는 단계;
3) 상기 2차 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브 및 GAPDH 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계;
4) 상기 반응물을 형광물질이 부착된 표지자의 특이적 결합제로 반응시키는 단계; 및
5) 형광값을 측정하여 상기 14종의 여성 생식기 병원체 및 GAPDH 유전자를 검출하는 단계.
본 발명은 GAPDH유전자를 내부 대조군(internal control)로서 상기 기술한 본 발명의 방법에 사용한다.
GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 human chromosome 12번에 위치하는 유전자로서 세포에서 필수적인 대사과정인 glycolysis에 관여하는 효소이며, 세포내에서 항상 발현되면서 그 발현량이 잘 변하지 않는 유전자이다.
GADPH 프라이머는 시료 내의 내재 유전자로서 항상 발현되는 GADPH 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있도록 고안된 것이며, GADPH 유전자를 검출하기 위한 GAPDH 유전자 검출용 프로브는 상기 병원체 검출용 프로브와 동시에 교잡시킨다. 이 과정을 통해 PCR 반응이 성공적으로 일어나는지 여부를 비드 어레이 분석기 내에서 곧바로 확인할 수 있으므로 PCR 증폭 실패에 따른 불검출 경우의 수를 대폭 낮출 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 양성대조군인 GAPDH에 대한 순방향의 프라이머는 서열번호 5, 역방향의 프라이머는 서열번호 6의 프라이머를 사용하였고, GAPDH에 대한 순방향 프로브는 서열번호 20, 역방향 프로브는 서열번호 21의 프로브를 사용하였다.
상기 방법의 다양한 변형 및 응용이 가능하고, 이는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 따르면 비임균성 요도염, 연성하감, 급성 성병, 화농성 국소 림프절증, 자궁경관염 및 내막염, 난관염과 골반염, 외음부 및 질 칸디다증, 임질, 요로 감염, 골반염증, 매독, 자궁경부 이형증을 포함하는 다양한 여성 생식기 질환을 유발하는 원인 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 기술 및 제품은 1차 검색 또는 확진 및 치료방침의 결정을 위해 널리 사용될 수 있으며, 기존의 배양 또는 염색 및 단일 PCR 또는 다중중합효소연쇄반응법 등 기존의 DNA검사 키트를 대체하여 STD 또는 비뇨 생식계 질환 유발 병원체의 진단에 직접적으로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기술은 감염증 및 당뇨병, 암과 같은 다른 질병의 유전자 진단에도 응용이 가능할 것이다.
도 1a 및 도 1b는 프라이머 및 프로브 위치를 조사하기 위해 수행한 다중서열정렬(multiple ailingment)을 나타낸 것이다.
도 2은 멀티플렉스 비드 어레이의 기본원리를 모식도로 나타낸 것이다.
도 3는 핵산 비드 결합의 원리를 나타낸 모식도이다.
도 4은 PCR 기초실험 결과로서, 1.5% 아가로스 젤에 표준시료 (미생물 14종의 게놈 DNA)에 대한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 조건을 확인한 것이다.
도 5는 비드 어레이에서의 기초실험 결과로서, 각 비드 어레이가 반응하는 조건을 확인한 것이다.
도 2은 멀티플렉스 비드 어레이의 기본원리를 모식도로 나타낸 것이다.
도 3는 핵산 비드 결합의 원리를 나타낸 모식도이다.
도 4은 PCR 기초실험 결과로서, 1.5% 아가로스 젤에 표준시료 (미생물 14종의 게놈 DNA)에 대한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 조건을 확인한 것이다.
도 5는 비드 어레이에서의 기초실험 결과로서, 각 비드 어레이가 반응하는 조건을 확인한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
1.
프라이머
및
프로브
제작
선정된 병원체의 16S 유전자 부위에 대해 다중서열정렬(multiple ailingment)을 수행하고 그 결과를 바탕으로 특이적인 프라이머 및 프로브 위치를 조사한 후 그 결과를 <도 1>에 도시하였다.
실시예 2. STD 병원체로부터의 게놈 DNA를 추출
Intron biotechnology사의 G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit (Cat. No. 17121)를 이용하여 STD 병원체로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
실시예
3.
PCR
을 통한 병원체 게놈
DNA
증폭
실시예 2.에서 얻어진 주형 DNA 5 ul(2ng), 실시예 1.에서 얻어진 프라이머 각각 0.5 uM, 2.5 mM dNTP mix, 7.5mM 10×PCR buffer (Ultratools, Spain) 5 ul, Taq polymerase (Ultratools, Spain) 1U으로 준비된 PCR 반응혼합물을 95℃에서 5분 동안 변형(denature)시킨 후 95℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1분 동안 40번 반복하여 신장(extension)시키고, 72℃에서 7분간 최종 신장시켰다.
실시예
4.
바이오틴
--
dCTP
를 이용한 2차 단일 가닥
PCR
을 통해 상보적인 단일 가닥 형성
실시예 3.에서 만들어진 PCR 산물을 주형으로 5 ul, 비드 어레이 프로브에 상보적인 가닥을 만드는 역방향 프라이머 (0.5 uM), 2.5 mM dATP, dGTP, dTTP mix, 0.4 mM biotin-dCTP (Invitrogen) 2 ul, 10×PCR buffer (Ultratools, Spain) 5 ul, Taq polymerase (Ultratools, Spain) 1U으로 준비된 PCR 반응혼합물을 95℃에서 5분동안 변성시킨 후 94℃ 에서 30 초, 58℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1분 동안 35번 반복하여 단일 가닥을 증폭했다.
실시예 5. 프로브가 고정된 마이크로스피어 비드의 제작
제작된 프로브 (GAPDH를 포함하여 총 15종)를 각각 100 uM씩 준비하고, 각 반응시키고자 하는 비드를 번호를 맞추어 잘 혼합한 후 40 ul(4~5×105 beads/ul)씩 취해 각 비드에 0.1 M MES (pH 4.5) 20 ul를 섞은 후, 준비된 프로브 20 uM을 덜어서 비드와 섞었다. 그 다음, 새로 만든 10 mg/ml EDC 용액 1 ul를 넣은 후 어두운 곳에서 약 30분간 잘 흔들어 반응시켰다. 여기에 10 mg/ml EDC 용액을 1 ul 더 추가로 넣은 후 어두운 곳에서 약 20분간 잘 흔들어 반응시켰다. 그 다음, 각 튜브에 500 ul의 0.02% Tween-20 용액을 넣어서 잘 섞어주고, 비드와 상층액을 원심분리하여 상층액을 제거했다. 다시 500ul 의 0.1% SDS 용액으로 잘 혼합하고, 비드와 상층액을 원심분리하여 상층액을 제거했다. 마지막으로, 150 ul의 TE(pH 8.0) 버퍼를 넣고 잘 섞은 후, 4℃ 암실에서 보관했다.
실시예
6.
마이크로스피어
비드와
교잡 반응
바이오틴-dCTP로 표지된 시료 유전자를 Hybrisol 버퍼에 녹인 후 프로브가 결합된 마이크로스피어 비드와 교잡반응을 (95℃ 에서 5분, 40℃ 에서 30분) 실시했다.
실시예
7.
Luminex
100
®
기계를 이용하여 시그널 검
출
Luminex 100®으로 총 14종류의 마이크로스피어 비드를 읽었으며, 마이크로스피어 비드의 MFI 값으로 각각의 미생물의 검출 여부를 결정했다. 여러 개의 비드 어레이 키트에서 유전형 분석이 잘 이루어지고 있으며, 이를 통해 감염 여부를 판정할 수 있음을 확인하였다.
<110> Gyngen Bio CO., LTD.
<120> Methods for detection of female genital pathogens using multiplex
liquid array system and the kit for thereof
<130> PA100061KR
<160> 21
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward master primer
<400> 1
actcctacgg gaggcwgcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse master primer
<400> 2
agggtatcta atcctrttyg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Candida albicans and Trichomonas vaginalis
<400> 3
aaggaattga cggaagggca 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Candida albicans and Trichomonas vaginalis
<400> 4
agggcaggga cgtwtcaac 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for GAPDH
<400> 5
gggcagcccc ttcataccct ca 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for GAPDH
<400> 6
cccaagggag ccacaccatc ct 22
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Ureaplasma urealyticum
<400> 7
tttttttttt tttttacgct aaaataggaa atgatttt 38
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Candida albicans
<400> 8
tttttttttt tttttcactt cttagaggga ctatcgatt 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Trichomonas vaginalis
<400> 9
tttttttttt tttttaagtt ctaattggga ctccctgcg 39
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Clostridium innocum
<400> 10
tttttttttt ttttttggcg tactaagtct gtagta 36
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Escherichia coli
<400> 11
tttttttttt tttttgagta aagttaatac ctttgctc 38
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Staphylococcus Saprophyticus
<400> 12
tttttttttt tttttggttt cggctcgtaa aactc 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Staphylococcus aureus
<400> 13
tttttttttt ttttttgtgc acatcttgac ggtac 35
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Staphylococcus pyogenes
<400> 14
tttttttttt ttttttgatg gtgggagtgg aaaatcc 37
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Clostridium perfringens
<400> 15
tttttttttt tttttctttg gggaagataa tgacggt 37
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Bacillus subtilis
<400> 16
tttttttttt tttttcaagt gccgttcgaa taggg 35
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Enterobacter cloacae
<400> 17
tttttttttt ttttttgttg tggttaataa ccgcagcaa 39
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Pseudomonas aeruginosa
<400> 18
tttttttttt tttttaagtt gggaggaagg gcagt 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Neisseria gonorrhoeae
<400> 19
tttttttttt tttttgttgc caatatcggc ggccg 35
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Aeromonas hydrophila
<400> 20
tttttttttt ttttttgcat ttaaaactgt ccagc 35
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for GAPDH
<400> 21
tttttttttt tttttaatcc catcaccatc ttcca 35
Claims (11)
- 하기 단계를 포함하는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 포함하는 병원체를 동시에 검출하는 방법:
1) 분석하고자 하는 시료로부터 상기 14종의 여성 생식기 병원체 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계;
2) 상기 1차 증폭된 유전자 산물을 상기 프라이머 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자로 2차 PCR 증폭하는 단계;
3) 상기 2차 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계;
4) 상기 반응물을 형광물질이 부착된 표지자의 특이적 결합제로 반응시키는 단계; 및
5) 형광값을 측정하여 상기 14종의 여성 생식기 병원체를 검출하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 2) 단계의 단일 가닥의 유전자의 표지자 표지를 위하여 표지자 표지된 dNTP 존재하에 PCR을 수행하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 표지자는 비오틴이고 상기 표지자의 특이적 결합제는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)의 순방향 프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 가지고 역방향 프라이머는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 상기 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)의 순방향 프라이머는 서열번호 3의 염기서열을 가지고 역방향 프라이머는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브는 각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브가 비드에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 형광물질이 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기 단계를 포함하는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 포함하는 병원체를 동시에 검출하는 방법:
1) 분석하고자 하는 시료로부터 상기 14종의 여성 생식기 병원체 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계;
2) 상기 1차 증폭된 유전자 산물을 상기 프라이머 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자로 2차 PCR 증폭하는 단계;
3) 상기 2차 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브 및 GAPDH 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계;
4) 상기 반응물을 형광물질이 부착된 표지자의 특이적 결합제로 반응시키는 단계; 및
5) 형광값을 측정하여 상기 14종의 여성 생식기 병원체 및 GAPDH 유전자를 검출하는 단계.
- 제8항에 있어서, 상기 GAPDH 유전자에 특이적인 순방향 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 가지고 역방향 프라이머는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 GAPDH 유전자 검출용 프로브는 서열번호 21의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열번호 5 내지 18의 염기서열을 가지는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)을 포함하는 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브 및 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 가지는 상기 14종의 여성 생식기 병원체에 특이적인 프라이머를 포함하는 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 키트.
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