KR20130032700A - 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩 - Google Patents

비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩 Download PDF

Info

Publication number
KR20130032700A
KR20130032700A KR1020110096450A KR20110096450A KR20130032700A KR 20130032700 A KR20130032700 A KR 20130032700A KR 1020110096450 A KR1020110096450 A KR 1020110096450A KR 20110096450 A KR20110096450 A KR 20110096450A KR 20130032700 A KR20130032700 A KR 20130032700A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
seq
nos
primer set
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
KR1020110096450A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101272017B1 (ko
Inventor
박현규
정예림
정원영
박기수
정철희
신성철
조대연
황상준
박효원
Original Assignee
한국과학기술원
주식회사 랩 지노믹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원, 주식회사 랩 지노믹스 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020110096450A priority Critical patent/KR101272017B1/ko
Priority to CN201180075006.XA priority patent/CN103958988A/zh
Priority to PCT/KR2011/009150 priority patent/WO2013042824A1/ko
Priority to US14/361,678 priority patent/US9434998B2/en
Publication of KR20130032700A publication Critical patent/KR20130032700A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101272017B1 publication Critical patent/KR101272017B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 비뇨생식기 감염 질환 진단을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것이다.
본 발명에 따른 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩은 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다양한 검체를 대상으로 복합감염까지 포함하여 14종의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 신속 정확하게 분석할 수 있어 비뇨생식기 감염 질환에 대한 1차 진료기관의 진단 및 처치에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

비뇨생식기 감염 질환 진단용 ＤＮＡ칩{DNA Chip for Diagnosing Urogenital Infection Disease}
본 발명은 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것이다.
전통적으로 감염 질환의 진단을 위해서는 도말 및 염색에 의한 현미경적 검사, 세균 배양 및 항생제 감수성 검사, 항원항체검사, 면역학적 검사법 등의 여러 방법이 사용되고 있다. 그러나 실제 이러한 전통적 진단법은 많은 한계가 있는 것이 사실이다. 기존 방법을 이용할 경우, 상당수의 세균은 검색이 불가능하거나 어렵고, 시간과 비용 및 인력이 너무 많이 소요되며, 한 번에 처리할 수 있는 검체 수에 한계가 있고, 흔히 한 번의 검사로 한 가지 밖에 검사를 못 하고, 판독이 자동화가 되어 있지 않아서 임상 적용에 어려움이 많다. 또한 살아 있는 균을 대상으로 하므로, 검사할 때까지 균을 살려야 하며, 이에 따라 검체 처리와 이송에 어려움이 따르며, 그 비용도 만만치 않다.
이에 따라 최근에는 감염 질환의 진단에 분자유전학적 분석방법이 사용되기 시작하였으며, 기존 진단법을 급속하게 대체해 나가는 추세이다. 특히, 다수 검체의 자동 분석이 가능한 DNA 마이크로어레이 또는 DNA칩이 각광을 받고 있으며, 유전자 분석을 이용한 감염진단은 기존의 감염진단법에 비해 장점이 많고, 기존 방법의 문제점을 해결할 수 있어서 보조 검사법 내지 대체 검사법으로 이용이 증가하고 있다. 유전자 진단법은 DNA 및 RNA 염기서열의 분석을 통해 대상 세균의 주형과 아형도 명확하게 알 수 있으며, 검체 처리와 이송에 까다로움이 없이 죽은 세균도 검색이 가능하고, PCR 증폭을 통해 표적 유전자를 증폭시켜 검색하므로 민감도가 높을 뿐 아니라 극소량의 검체만 있어도 진단이 가능하다. 또한, 민감도 뿐 아니라 특이도와 재현성 등 모든 부분에서 우수하다. 대부분의 경우 24시간 이내에 신속하고 정확하게 결과를 알 수 있으며, 인력과 비용도 더 절감된다. 아울러 DNA칩을 이용하면 다수의 검체를 신속하게 다량으로 검색할 수 있는 장점이 있다.
상기 PCR 증폭방법으로는 여러 개의 중합효소연쇄반응을 한 튜브에서 수행하는 Multiplex PCR 방법이 개발되어 감염균 진단에 널리 쓰이고 있다 (McNulty et al., Sex . Transm . Infec ., 80:207, 2004).
한편, 비뇨생식기 감염 질환은 감염성 질환 중 호흡기 감염 다음으로 가장 빈번한 세균 감염 질환으로서 전 세계적으로 매년 7천 8백만 ~ 3억 3천만 건이 새롭게 진단되고 있으며(Lee et al ., J. Microbiol ., 45:453, 2007), 이러한 감염 질환 중 일부는 법정전염병 제 3군인 성병에 속하며, 간헐적으로 유행할 가능성이 있어서 지속적으로 그 발생을 감시하고 방역 대책의 수립이 필요한 전염병으로 분류되고 있다. 특히, 성병은 표본 감시를 행하고 있는데, 과거에는 특정 질환을 지칭하였으나 최근들어 무수히 많은 질병들이 성행위 또는 성적 접촉에 의하여 매개되는 사실이 밝혀짐에 따라 국소적 의미의 성병 대신에 전신적 의미를 내포하는 성전파성 질환(Sexually transmitted disease, STD)이라고 총칭하게 되었다.
즉, 성전파성 질환(STD)이란 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말로서 STD의 원인균으로는 남자의 경우, 요도염, 전립선염 또는 부고환염을 일으키고, 여자의 경우에는 자궁경부염이나 질염, 골반염증성질환(pelvic inflammatory disease)을 일으키는 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움, 마이코플라스마 호미니스, 트리코모나스 바지날리스 및 헤르페스심플렉스바이러스가 있으며, 외성기에 궤양을 일으키는 매독균(트레포네마 팔리둠), 헤르페스심플렉스바이러스, 헤모필루스 듀클레이가 있다. 또한, 외성기에 사마귀(wart)나 자궁경부, 홍문, 음경 등에 암을 야기하는 인체유두종바이러스(HPV)가 있으며, 이와 함께 정확한 의미에서 STD는 아니나 STD와 유사하게 질염 등의 병태를 나타내므로, 감별해야 할 균으로서 대장균, 가드네렐라 바지날리스와 진균인 칸디다 알비칸스가 있다.
미국의 경우 매년 1,500명 이상이 STD에 새로 감염이 되며, 6,500만명 이상이 바이러스성 STD에 이환되어 있다고 보고되고 있다. 이렇게 비뇨생식기 감염 질환은 높은 유병률에도 불구하고 흔히 증상이 없어서 모르고 지내는 경우가 많으며, 진행되면 불임이나 전립선염, 부고환염, 면역결핍, 암 등의 합병증을 야기할 수 있다. 특히, 바이러스성 STD는 유효한 치료법이 없는 경우가 많아서 STD는 정확한 진단과 예방이 무엇보다 중요하며, 아울러 무증상의 환자를 찾아서 치료하고 감염 확산을 방지하는 것이 중요하다 (Campbell - Walsh Urology , 2007).
이에, 본 발명자들은 유병률이 높은 비뇨생식기 감염 질환 원인균들을 동시에 다중 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종과 혼성화가 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 DNA칩을 제조함으로써, 다양한 검체를 대상으로 복합감염까지 포함하여 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종의 감염 여부를 신속 정확하게 분석할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 비뇨생식기 감염 질환 원인균을 검출할 수 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩; 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA 및 시험 검증군인 베타-글로빈을 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 혼성화 검증군과 상보적인 염기서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 포함하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩은 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다양한 검체를 대상으로 복합감염까지 포함하여 14종의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 신속 정확하게 분석할 수 있어 비뇨생식기 감염 질환에 대한 1차 진료기관의 진단 및 처치에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 신규 프로브 선정을 위한 스크리닝 테스트용 DNA 칩의 모식도(a) 및 각 원인균의 증폭산물을 이용한 스크리닝 테스트의 형광 스캐닝 결과(b)를 나타낸 것이다.
도 2는 T-linker를 통해 형광 신호세기의 안정성이 향상되는 것을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 DNA칩의 형태 및 프로브의 고정화 양상을 모식도로 나타낸 것이다.
도 4는 실제 GV, UU, HSV2 및 TV의 복합감염자 환자의 샘플에서 추출한 원인균 유전자를 이용한 멀티플렉스 PCR 증폭산물의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 DNA칩 혼성화 반응 이후 형광 스캐닝한 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출을 위한 멀티플렉스 PCR, DNA칩 혼성화 및 형광 스캐닝의 전체 분석 과정을 개략도로 나타낸 것이다.
도 7은 최소 검출 한계를 확인하기 위하여 0-107 카피 범위의 GV 표준물질에대한 형광스캐닝 사진 및 SV값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 PCR을 이용한 검출방법과 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출방법의 민감도 및 특이도를 비교한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 9는 이미 공지되어 있는 프로브와 본 발명에 따른 프로브의 민감도를 비교한 실험결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브는 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA와 하이브리다이제이션(hybridization)되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 비뇨생식기 감염 질환 원인균은 대장균(EC, Escherichia coli), 클랩시엘라 프네우모니아이(KP, Klebsiella pneumoniae), 스태필로코쿠스 아우레우스(SA, Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 페칼리스(EF, Enterococcus fecalis), 임질균(NG, Neisseria gonorrhea), 클라미디아 트라코마티스(CT, Chlamydiae trachomatis), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(UU, Ureaplasma urealyticum), 마이코플라즈마 호미니스(MH, Mycoplasma hominis), 마이코플라즈마 제니탈리움(MG, Mycoplasma genitalium), 트리코모나스 바지날리스(TV, Trichomonas vaginalis), 칸디다 알비칸스(CA, Candida albicans), 가드넬라 바지날리스(GV, Gardnerella vaginalis), 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1(HSV 1, Herpes simplex virus - type1) 및 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2(HSV 2, Herpes simplex virus - type2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 시험 검증군(Internal Control) 및 혼성화 검증군(Position Marker)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 '시험 검증군(IC, Internal Control)'이란 DNA칩의 혼성화 반응 이전의 PCR 등과 같은 시험 과정들이 제대로 이루어졌는지를 검증하기 위해 칩 위에 고정되어 있는 프로브를 의미하며, 본 발명에서, 상기 시험 검증군은 세균 감염 여부와 관계없이 모든 사람에게서 항상 검출되는 베타-글로빈과 하이브리다이제이션이 가능한 서열번호 15의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, '혼성화 검증군(PM, Position Marker)'이란 혼성화 반응이 제대로 이루어졌는지 검증하기 위해 칩 위에 고정되어 있는 프로브를 의미하며, Cy3-dUTP가 달려있고 상기 혼성화 검증군과 상보적인 서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 혼성화 반응 직전에 정해진 양을 첨가하여 혼성화 반응을 진행하여 양성인 것을 확인함으로써 혼성화 반응이 제대로 이루어졌는지 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼성화 검증군은 서열번호 16의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서, 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 특이성이 우수한 신규의 프로브를 개발하기 위하여, 먼저, 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 타겟 부위를 선정하였으며, 이를 위하여, 계통 파악에 흔히 사용되는 16S rRNA (진핵생물인 Candida albicans는 18S rRNA) 및 23S rRNA 유전자의 원인균 특이적인 서열에서 프로브의 서열을 1차적으로 결정하고, 이 부위에 적절한 서열이 없을 경우에는 원인균에 특이적인 유전자와 염기서열을 타겟 부위로 선택하였다. 각 원인균에 해당하는 타겟 부위의 유전자와 염기서열의 GenBank 번호는 하기 표 1과 같다.
각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 타겟 부위
원인균 타겟 부위 GenBank 번호
1 엔테로코커스
페칼리스
(EF)		 D-alanine ligase-related protein (ddl) gene U00457.1
2 칸디다 알비칸스
(CA)		 18S rRNA gene FJ159646
3 마이코플라즈마 호미니스
(MH)		 16S rRNA gene AJ002268.1
4 가드넬라 바지날리스
(GV)		 23S r RNA gene CP002104.1
5 클라미디아 트라코마티스
(CT)		 cryptic plasmid pLGV440 X06707.3
6 대장균(EC) 16S rRNA gene AB609595.1
7 스태필로코쿠스 아우레우스
(SA)		 thermonuclease precursor (nuc) gene EF529606.1
8 마이코플라즈마 제니탈리움
(MG)		 MgPa operon gene GU226196
9 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1
(HSV1)		 RL1 gene FJ593289.1
10 트리코모나스 바지날리스
(TV)		 beta-tubulin (btub1) gene L05468.1
11 임질균(NG) cryptic plasmid pJD1 M10316.1
12 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(UU) serovar 13 urease complex component AF085729.2
13 클랩시엘라 프네우모니아이(KP) beta-lactamase SHV-103 (blaSHV-103) gene EU032604
14 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2
(HSV2)		 RL1 gene Z86099.2
타겟 부위 선정 후, BLAST engine을 통해 확보한 각 원인균 및 베타글로빈의 염기 서열을 Primer 3 (Whitehead Institude/MT Center for Genome Research) 프로그램을 사용하여 디자인한 프라이머들의 염기서열과 cross-checking 한 후, 각 원인균마다 비특이적 혼성화를 최소화 할 수 있는 최적의 프로브 후보 2 종 이상을 OligoArray 2.0 프로그램을 이용하여 35mer 길이로 설계한 다음, 이러한 후보 프로브들의 목적 원인균 진단 능력을 평가하기 위해 실제 DNA칩 혼성화 반응을 통한 스크리닝 테스트를 수행하여 14종의 원인균 및 시험 검증군에 대해 표 2와 같은 염기서열을 가지는 최적의 프로브를 선정하였다. 이 때, 각 프로브는 9개 T로 이루어진 linker가 앞쪽에 있고, 뒤에 35개의 STD 원인균 특이적 프로브 서열이 붙어 있는 형태로 이루어져 있으며, T-linker는 스페이서로 삽입되어 PCR 산물과 프로브 간의 혼성화반응의 효율을 높이는 역할을 한다.
본 발명은 다른 양태에서, 표 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 16의 염기서열을 가지는 각각의 프로브를 마이크로스팟터를 작동시켜 SMP3 핀을 이용하여 알데히드가 코팅되어 있는 유리 기판 위에 스팟팅하여 각각의 프로브를 고정화시킨 다음, 프로브가 고정화된 유리 기판 위에 반응 웰 역할을 하는 반응 챔버와 증발방지 목적의 투명 필름커버를 부착하여 DNA칩을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA칩은 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 유전자별로 3 개의 동일한 스팟(spot)을 포함하며, 중간 위치에 시험 검증군 및 혼성화 검증군의 반복적인 스팟을 포함하는 전체 프로브가 집적된 구간을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, 전체 프로브가 집적된 구간을 4번 포함하는 4-플렉스(plex) 형태의 DNA칩을 제조하여 4 개의 검체를 동시에 적용 가능하도록 하였으나, 동시에 적용하고자 하는 검체 수에 따라 전체 프로브가 집적된 구간의 개수는 유동적일 수 있다.
각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 유전자와 하이브리다이제이션되는 프로브의 염기서열
서열번호 Probe Name Start Length TM * Sequence 진단균
1 CA_1 214 9+35 70.1 TTT TTT TTT ATT ACT TAA TAG TCA AAA CTT TCA ACA ACG GAT CT 칸디다 알비칸스
2 CT_1 112 9+35 67.2 TTT TTT TTT ACC CCA CCA TTT TTC CGG AGC GAG TTA CGA AGA CA 클라미디아
트라코마티스
3 GV_1 203 9+35 67.7 TTT TTT TTT GGG CTT TGA TCC GAG GAT TTC CGA ATG GGG AGA CC 가드넬라
바지날리스
4 HSV1_2 23 9+35 71.0 TTT TTT TTT TAC GTG GGT CAT TGG CGT GGG GGG TTA CAG CGA CA 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1
5 MG_2 173 9+35 61.2 TTT TTT TTT GTT GAG AAA TAC CTT GAT GGT CAG CAA AAC TTT GC 마이코플라즈마 제니탈리움
6 MH_2 137 9+35 69.5 TTT TTT TTT CGG GTC GAG AGA CTG AAC GGC CAC ATT GGG ACT GA 마이코플라즈마 호미니스
7 NG_3 186 9+35 65.5 TTT TTT TTT CGC CAA TAT ACC TAC CAA GCT CCA CTG ATA GGG CT 임질균
8 SA_3 89 9+35 58.9 TTT TTT TTT ATC CTA AAA AAG GTG TAG AGA AAT ATG GTC CTG AA 스태필로코쿠스 아우레우스
9 UU_0 725 9+35 61.6 TTT TTT TTT TTA TGG ACG TCG TTT CGA TAT TCC ATC AGG TAC TG 유레아플라즈마 유레아라이티쿰
10 EF 913 752 9+35 60.7 TTT TTT TTT TAT TAT GTT AGA TGG AAG TGG CTT AAG TCG CTG TG 엔테로코커스
페칼리스
11 TV 913 31 9+35 64.1 TTT TTT TTT GCT TCC GTA CAC TCA AGC TCA CAA CAC CAA CAT AC 트리코모나스
바지날리스
12 KP 120_1 36 9+35 79.44 TTT TTT TTT ATC TGG TGG ACT ACT CGC CGG TCA GCG AAA AAC AC 클랩시엘라
프네우모니아이
13 HSV2 913 57 9+35 71.6 TTT TTT TTT GTC GCC GGG CAC CAC CAC GCC GTA TTG GTA TTC GT 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2
14 EC 913 383 9+35 60.3 TTT TTT TTT GTA AAG TTA ATA CCT TTG CTC ATT GAC GTT ACC CG 대장균
15 IC_2 101 9+35 63.0 TTT TTT TTT CTT TGT TCC CTA AGT CCA ACT ACT AAA CTG GGG GA 시험 검증군
16 PM N/A 15+22 59.0 TTT TTT TTT TTT TTT TCA CGG TTA TCG CTG AAC TCG G 혼성화 검증군
(*TM은 T-linker가 포함되지 않은 probe 서열의 melting temperature이다.)
본 발명은 다른 관점에서, 상기 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩; 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA 및 시험 검증군인 베타-글로빈을 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 혼성화 검증군과 상보적인 염기서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 포함하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 엔테로코커스 페칼리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 염기서열을 가지는 칸디다 알비칸스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 호미니스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 염기서열을 가지는 가드넬라 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 가지는 클라미디아 트라코마티스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 염기서열을 가지는 대장균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 염기서열을 가지는 스태필로코쿠스 아우레우스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 제니탈리움 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 43 및 44의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 45 및 46의 염기서열을 가지는 임질균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 염기서열을 가지는 유레아플라즈마 유레아라이티쿰 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 49 및 50의 염기서열을 가지는 클랩시엘라 프네우모니아이 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 51 및 52의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트 및 서열번호 53 및 54의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 5' 말단에 상기 DNA칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, FAM, TAMRA, Alexa Fluor 및 Texas Red로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서, 실제 환자의 샘플에서 추출한 원인균의 유전자를 표 3에 나타난 바와 같이, 각 원인균의 유전자에 특이적인 프라이머 세트들을 이용하여 3 개의 그룹으로 나누어 멀티플렉스 PCR을 수행하여 증폭시킨 다음, 상기 증폭 산물을 본 발명에 따른 DNA칩과 혼성화시키고, 형광 스캐너를 이용하여 DNA칩 위의 각 스팟에 대하여 SV 값 및 SBR 값을 얻었다.
본 발명에서, 'SV(spot vlaue)'란 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소 값의 차이로, Cy3 사용인 경우 532 nm 파장으로 스캐닝한 값을 기준으로 532 nm median pixel intensity 값에서 532 nm background pixel intensity 값을 제외한 값을 의미하며, 마이크로어레이 데이터 파일인 gpr 파일의 'F532median-B532median' 항목이 이에 해당한다. 또한, 'SBR(Signal to Background Ratio)'란 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소값의 비로 532 nm median pixel intensity / 532 nm background median pixel intensity를 의미하며, gpr파일의 F532 median의 항목과 B532 median항목을 이용하여 프로그램 내에서 F532 median / B532 median 값을 계산하여 분석에 적용할 수 있다. 표지 수단으로 Cy5를 사용할 경우에는 532 nm 대신에 635 nm 파장을 이용하여 SV 및 SBR를 얻을 수 있다.
멀티플렉스 PCR을 위한 3개의 하위 그룹 및 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균 DNA 증폭용 프라이머의 염기서열
Target 서열번호 Primer sequence (5'-3‘) Size
EF 17 F CCACAAGTACCATTCGTGCC 509 Group1
18 R CCAGGCATGGTGTTCAATTC
CA 19 F TCA TTA CTG ATT TGC TTA ATT GCA C 301
20 R AAC GTC CAC CAC GTA TAT CTT C
MH 21 F CAATGGCTAATGCCGGATACGC 334
22 R GGTACCGTCAGTCTGCAAT
GV 23 F TATCAATTTCAACCGGCTCC 275
24 R CCACAAAAACTGTGGTGTACC
CT 25 F CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA 200
26 R TCCTCAGAAGTTTATGCACT
Beta globin 27 F CAGGCTGCCTATCAGAAAGT 155
28 R GCTCAAGGCCCTTCATAATA
Beta globin 29 F TGG GTT AAG GCA ATA GCA A 579
30 R TGT ATT TTC CCA AGG TTT GAA
EC 31 F ATACCGCATAACGTCGCAAG 554 Group2
32 R CCACCGGTATTCCTCCAGAT
SA 33 F CTCAGCAAATGCATCACAAA 395
34 R CCAAGCCTTGACGAACTAAA
MG 35 F AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG 281
36 R CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC
HSV1 37 F TGGGACACATGCCTTCTTGG 147
38 R ACCCTTAGTCAGACTCTGTTACTTACCC
HSV1 39 F ATC CTC GCT TTA GGA ACA ACT 249
40 R CCA ACT GCC CCC TTA TCT A
TV 41 F CATTGATAACGAAGCTCTTTACGAT 112
42 R GCATGTTGTGCCGGACATAACCAT
TV 43 F TCT CCA AAG GTT TCT GAT ACA GT 356
44 R GTG AGC TCT GGG ACT GTA AGA
NG 45 F GCTACGCATACCCGCGTTGC 390 Group3
46 R CGAAGACCTTCGAGCAGACA
UU 47 F CAAGTTGGATCACATTTCCA 210
48 R GCCGTTTACACCTCAAACTT
KP 49 F AAGATCCACTATCGCCAGCAGG 231
50 R ATTCAGTTCCGTTTCCCAGCGG
HSV2 51 F GGTTTGTTGTGAGGAGCCA 114
52 R CCTGGAAAATCTCCTTAGCC
HSV2 53 F CCA TGC ACG TAA AAC ACG 345
54 R GTG TGC CG TTT TTC GAG T
본 발명은 다른 양태에서, 분석 통과 기준(cut-off value)을 이용하여 각각의 스팟에 대하여 양성인지 음성인지를 구분하였다.
여기서, '분석 통과 기준(cut-off value)'이란 각 스팟에 대하여 양성인지 음성인지를 판별하는 기준을 의미하며, 분석 통과 기준에 적용되는 값은 상기 SV 및 SBR 두 항목이며, 어떠한 스팟의 SV 값이 1000 이상, SBR 값이 2.5 이상이면 그 스팟은 양성스팟으로 판단하고, 어떠한 스팟의 SV 값이 1000 미만이거나, SBR 값이 2.5 미만이면 그 스팟은 음성스팟으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태에서, 상기와 같은 분석 통과 기준을 이용하여 각각의 스팟이 양성인지 음성인지를 확인한 다음, 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균 별로 동일한 스팟 3개에 대하여 양성스팟 또는 음성스팟의 개수를 확인하여 결과적으로 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 판정하였다.
본 발명에 있어서, 상기 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부는 DNA칩 위에 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대한 동일한 스팟 3개 모두가 양성스팟일 경우, 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 있다고 판정하고, 동일한 프로브 스팟 3개 모두가 음성스팟일 경우에는 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 없다고 판정하되, 동일한 스팟 3개 중 1개 또는 2개만 양성스팟일 경우에는 재진단하여 감염 여부를 판정할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩은 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균 별로 3개의 동일한 스팟을 포함하고 있어 민감도, 특이도 및 재현성을 극대화할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출방법의 임상유효성을 확인하기 위하여, PCR기법으로 결과를 확인 한 양성 샘플 70개와 음성 샘플 5개를 대상으로 시퀀싱을 기준으로 하여 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출 결과의 정확성을 분석한 결과, 민감도 50%, 특이도 80%의 PCR 검출방법에 비해 STD DNA 칩은 민감도 95%, 특이도 100%로 그 유효성이 매우 높은 것을 확인하였으며, 또한, 본 발명에 따른 프로브와 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브와의 비교 실험을 통해 본 발명에 따른 프로브가 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브보다 민감도가 우수한 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 특이성이 우수한 신규 프로브의 제조
각 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 특이성이 우수한 신규의 프로브를 개발하기 위하여, 먼저, 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 타겟 부위를 선정하였으며, 이를 위하여, 계통 파악에 흔히 사용되는 16S rRNA (진핵생물인 Candida albicans는 18S rRNA) 및 23S rRNA 유전자의 원인균 특이적인 서열에서 프로브의 서열을 1차적으로 결정하고, 이 부위에 적절한 서열이 없을 경우에는 원인균에 특이적인 유전자와 염기서열을 타겟 부위로 선택하였다. 각 원인균에 해당하는 타겟 부위의 유전자와 염기서열의 GenBank 번호는 표 1과 같다. 타겟 부위 선정 후, BLAST engine (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 확보한 각 원인균 및 베타글로빈의 염기 서열을 Primer 3 (Whitehead Institude/MT Center for Genome Research) 프로그램을 사용하여 디자인한 프라이머들의 염기서열과 cross-checking 한 후, 각 원인균마다 비특이적 혼성화를 최소화 할 수 있는 최적의 프로브 후보 2 종 이상을 OligoArray 2.0 (http://berry.engin.umich.edu/oligoarray) 프로그램을 이용하여 35mer 길이로 설계하였다.
이러한 후보 프로브들의 목적 원인균 진단 능력을 평가하기 위해 실제 DNA칩 혼성화 반응을 통한 스크리닝 테스트를 수행하였다. 도 1의 (a)와 같이 설계된 DNA칩을 이용하여 각 원인균의 증폭산물과 각각 혼성화 시킨 결과, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이, 14종의 원인균에 대한 각각의 후보 프로브들 중 EC, EF, GV, MH의 후보 프로브인 EC_2, EF_1, GV_1 및 MH_1이 다른 원인균 유전자의 증폭산물과 비특이적으로 혼성화하는 것을 확인하였으며, 이러한 비특이적 혼성화를 야기하는 프로브들은 제거하고, 각 목적 원인균 및 베타글로빈의 증폭산물에 대한 후보 중 더 강한 형광 세기를 보이는 프로브들을 선택하여 14종 원인균 및 시험 검증군에 대해 표 2와 같은 염기서열을 가지는 최적의 프로브를 선정하였다. 이 때, 각 프로브는 9개 T로 이루어진 linker가 앞쪽에 있고, 뒤에 35개의 STD 원인균 특이적 프로브 서열이 붙어 있는 형태로 이루어져 있으며, T-linker는 스페이서로 삽입되어 PCR 산물과 프로브 간의 혼성화반응의 효율을 높이는 역할을 한다.
T-linker의 유무에 따른 혼성화 반응의 효능을 확인하기 위하여, GV에 단일 감염된 임상검체를 이용하여 PCR 검출 방법으로 GV 단일 밴드를 확인한 후, T-linker가 없는 GV 프로브 및 T-linker가 있는 GV 프로브가 고정되어 있는 DNA 칩과 혼성화 반응을 시켜 T-linker가 없는 프로브와 T-linker가 있는 프로브의 칩 반응의 형광 신호세기 값을 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, T-linker의 존재 유무와 상관없이 모두 SV값 및 SBR값에 대한 컷오프 수치를 넘어 양성으로 판정되었다. 그러나, 칩의 신호세기 값은 T-linker가 없는 프로브의 경우, 1016, 1765로 두 동일 스팟 간의 신호세기의 편차가 크고 불안정하게 나타난 반면, T-linker가 있는 프로브의 경우에는 1517, 1575로 두 스팟 간에 안정된 신호세기 값을 재현성 있게 보여주었다. 따라서, 프로브에 T-linker가 있는 경우, 혼성화 반응의 효율을 높여 재현성 있는 형광 신호세기를 나타내는 것을 확인하였다. 이는, DNA칩을 이용한 병원체 검출 방법을 컷오프 수치를 적용하여 임상진단에 적용할 경우, 판정 단계의 오류를 줄일 수 있음을 의미한다.
DNA칩의 제조방법, 유전자 증폭방법, DNA칩 혼성화 방법 및 혼성화 검출방법은 하기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였으며, 목적 원인균 유전자 증폭은 표 3의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하였다.
DNA 칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출
(1) DNA칩의 제조
DNA칩을 제조하기 위하여, 프로브를 집적시킬 슬라이드로 알데히드가 코팅되어 있는 유리 기판을 사용하였으며, 고압의 먼지 제거기를 이용하여 표면의 먼지를 제거한 다음 집적기기인 마이크로스팟터(Microspotter)의 슬라이드 장착 위치에 장착하였다. 그리고 SMP3 핀을 3차 증류수가 담긴 초음파기에서 세척한 다음 건조시켜 마이크로스팟터의 핀 장착 부위에 장착하였다. 집적용 핀과 슬라이드를 장착한 후 25℃ 및 70% 습도에서 마이크로스팟터를 작동시켰다.
각각의 프로브는 25pmol/μl, 50% DMSO 농도로 제조한 다음, -20℃에서 16시간 이상 안정화시켰으며, 각 프로브의 염기서열은 표 2에 나타난 바와 같다. 그 다음, 마이크로스팟터를 작동시켜 상기 SMP3 핀을 이용하여 각각의 프로브를 3회씩 4-플렉스(plex) 형태로 상기 알데히드가 코팅되어 있는 유리 기판 위에 스팟팅하여 고정하였다 (도 3). 그 다음, 프로브가 고정된 유리 기판 위에 반응 웰 역할을 하는 반응 챔버와 증발방지 목적의 투명 필름커버를 부착하였다.
(2) DNA의 증폭
검출하고자 하는 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA를 증폭하기 위하여, 표 3에 나타난 바와 같이, 3개의 그룹으로 나누어 멀티플렉스(mutiplex) PCR을 수행하였으며, 시험 검증군으로 베타-글로빈을 이용하였다. 베타-글로빈을 증폭하기 위해 사용된 전방향(F) 프라이머 및 역방향(R) 프라이머의 염기서열, 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA를 증폭하기 위하여 사용된 전방향(F) 프라이머 및 역방향(R) 프라이머의 염기서열 및 상기 프라이머 세트(전방향(F) 프라이머 및 역방향(R) 프라이머)를 이용하여 증폭되는 산물의 크기는 표 3과 같으며, 상기 제조된 DNA칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위하여, 각각의 역방향 프라이머의 5' 말단은 Cy3로 표지하였다.
계속해서, 실제 GV, UU, HSV2 및 TV의 복합감염자 환자의 샘플에서 추출한 원인균 유전자를 이용하여 상기와 같이 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 실제 환자의 샘플에서 추출한 원인균 유전자, 0.2 μM의 프라이머 세트, 1X PCR reaction buffer(30 mM Tris-HCl, 30 mM KCl, 30 mM (NH4)2SO4 , 2 mM MgCl2), 0.4 mM dNTPs 및 1.0 U i-star Taq polymerase (iNtRON Biotechnology, Korea)을 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, Perkin-Elmer 9200 thermo-cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 이용하여 DNA를 증폭시켰다. PCR의 조건은 이중가닥 DNA를 denaturation 시키기 위하여 94℃에서 5분간 heating한 다음, 94℃에서 50초, 57ㅀC에서 45초, 72℃에서 50초의 사이클을 38번 반복한 뒤, 72℃에서 10분간의 마지막 extension 과정을 거쳤으며, 상기 PCR 산물은 아가로오스 전기영동 (agarose gel electrophoresis)을 이용하여 PCR 여부와 사이즈를 확인하였다 (도 4).
(3) DNA칩 혼성화
DNA칩 혼성화 반응을 수행하기 위하여, 먼저 혼성화 반응을 수행하기 30분 전에 -20℃ 냉동고에 보관되어 있는 혼성화 용액(Hybridization solution; 5X SSC, 25% formamide, 25ug/ml Human HybMasker Cot-1 DNA, 10% Dextran sulfate, 0.1% SDS)을 꺼내어 42℃ 반응조에 넣어 Pre-warming시키고, -20℃ 냉동고에 보관되어 있는 Anti PM(100nM)을 꺼내어 녹인 후, 6000xg에서 10초간 원심분리하여 용액을 튜브 바닥에 모은 후 얼음에 박아 두었다.
마이크로 튜브에 상기 3개의 그룹에 대한 PCR 증폭 산물을 각각 10μl씩 총 30μl의 PCR 증폭 산물을 첨가한 후 피펫을 이용하여 잘 섞어 준 다음, 95℃에서 5분간 방치하였다. 그리고 상기 튜브에 Pre-warming된 혼성화 용액(hybridization solution) 40μl를 피펫을 이용하여 첨가하고, Anti PM 1μl를 첨가하였다. 그 다음, 71μl 중에서 혼성화 반응액으로 70μl를 DNA칩 표면에 부착된 필름 커버에 있는 주입구에 천천히 주입한 다음 혼성화 챔버를 조립하였다. 이때, 칩과 반응 웰 사이에 기포가 있으면 글러브를 낀 손으로 기포를 밀어내듯이 쓸어내어 기포를 제거하였다. 그 다음, 42℃ 반응조에서 2시간 동안 혼성화 반응시킨 후, 반응조에서 혼성화 챔버를 꺼내 해체하여 칩을 꺼내고 칩의 반응 챔버와 투명 필름커버를 제거하였다.
세척용 용기로 50ml 튜브를 이용하여 세척액 1(2X SSC, 0.1% SDS)을 칩이 잠길 수 있게 튜브에 부은 다음, 칩을 넣고 핀셋을 이용하여 위아래로 1초에 2회 왕복속도로 10~15회 흔든 후 세척액 1과 칩이 담겨있는 상기 50ml 튜브를 50℃ 반응조에 넣고 5분간 방치하였다. 계속해서, 새 50ml 튜브에 세척액 2(0.1X SSC)를 칩이 잠길 수 있게 부은 다음, 칩을 넣고 핀셋을 이용하여 위아래로 1초에 2회 왕복속도로 10~15회 흔들어 준 다음 실온에서 1분간 방치 후 사용한 세척액 2를 버리고 새로운 세척액 2를 이용하여 상기와 같이 1회 더 반복하여 칩을 세척하였다.
세척 후 칩에 남아 있는 물기를 제거하기 위하여 물기가 없는 50ml 튜브에 칩을 넣고 100xg에서 5분간 원심분리하여 칩에 남은 세척액을 제거하였다.
계속해서, 상기 칩을 형광 스캐너 GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 형광 스캐닝하고 (도 5), 스캔한 칩의 영상으로부터 결과판정을 위한 각 스팟의 시그날(intensity) 값을 분석하여 각 스팟에 대한 SV(Spot value) 및 SBR(Signal to Background Ratio) 값을 얻었다.
여기서, SV값이란 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소 값의 차이로 532 nm 파장으로 스캐닝한 값을 기준으로 532 nm median pixel intensity 값에서 532 nm background pixel intensity 값을 제외한 값을 의미하며, 마이크로어레이 데이터 파일인 gpr 파일의 'F532median-B532median' 항목이 이에 해당한다. 또한, SBR값은 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소값의 비로 532 nm median pixel intensity / 532 nm background median pixel intensity를 의미하며, gpr파일의 F532 median의 항목과 B532 median항목을 이용하여 프로그램 내에서 F532 median / B532 median 값을 계산하여 분석에 적용할 수 있다.
(4) 결과판정
비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 확인하기 위하여, 각각의 스팟에 대하여 양성인지 음성인지를 판단하였으며, 이를 위한 분석 통과 기준(cut-off value)은 다음과 같다:
양성스팟 : SV값이 1000 이상, SBR 값이 2.5 이상
음성스팟 : SV값이 1000 미만이거나 SBR 값이 2.5 미만
상기와 같은 분석 통과 기준을 이용하여 각각의 스팟이 양성인지 음성인지를 확인하였으며, 동일한 스팟 3개 모두가 양성스팟일 경우, 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 있다고 판정하였으며, 동일한 스팟 3개 모두가 음성스팟일 경우, 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 없다고 판정하였다. 또한, 동일한 스팟 3개 중 1개 또는 2개만 양성스팟으로 확인된 경우에는 신뢰성 있는 판단을 내리기에 충분치 않다고 판정하고 재진단하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 해당하는 스팟에 대한 SV값 및 SBR값을 얻었으며, GV의 경우, 3개의 스팟의 SV값은 각각 1688, 1674, 1763을 나타내었고, SBR값은 9.75, 9.81, 10.23을 나타내어 3개의 스팟 모두 상기 분석 통과 기준을 통해 양성스팟으로 확인되었으며, GV가 검출되었다고 판정하였다. 같은 방법으로 나머지 13종의 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 확인한 결과, UU, HSV2, TV가 검출된 것을 확인할 수 있었으며, 나머지 원인균은 검출되지 않은 것을 확인하였다.
비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출을 위한 멀티플렉스 PCR, DNA칩 혼성화 및 형광 스캐닝의 전체 분석 과정을 나타낸 개략도는 도 6에 나타내었다.
DNA칩 혼성화 반응 이후 각 스팟의 SV 및 SBR 값
SV SBR SV SBR
GV 1688 9.75 CA 13 1.07
1674 9.81 24 1.12
1763 10.23 18 1.08
MH 105 1.55 EF 108 1.54
116 1.61 95 1.47
113 1.58 93 1.47
CT 17 1.09 EC 17 1.09
12 1.06 28 1.14
11 1.06 92 1.44
SA 93 1.47 TV 5820 30.39
107 1.54 5744 30.46
109 1.54 4599 24.46
HSV1 86 1.43 MG 23 1.12
108 1.52 29 1.15
97 1.46 35 1.18
NG 18 1.09 UU 10289 53.23
18 1.09 9116 47.51
17 1.09 8228 42.98
KP 105 1.54 HSV2 2520 14.13
111 1.57 2474 13.75
101 1.52 2205 12.25
또한, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출방법의 검출 한계를 확인하기 위하여, GV 에 대한 최소 검출 한계를 10-107 카피 범위에서 SV(Singnal value) 값을 확인한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 최소 검출 한계가 102 카피임을 확인하였다. 또한, GV 이외의 나머지 13종 원인균에 대해서도 표적 유전자 부위의 클론을 이용하여 최소검출 한계를 확인한 결과, 102 ~103 카피 범위에서 모든 검출이 가능한 것을 확인하였다.
DNA 칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출의 민감도 및 특이도
본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출방법의 임상유효성을 확인하기 위하여, PCR기법으로 결과를 확인 한 양성 샘플 70개와 음성 샘플 5개를 대상으로 시퀀싱을 기준으로 하여 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출 결과의 정확성을 분석하였다.
도 8은 PCR과 DNA 칩의 민감도 비교를 위해 임상샘플을 이용하여 실험한 결과의 일 예를 나타낸 것이며, 도 8에 나타난 바와 같이, 위음성의 예로서, PCR 검출방법으로는 아가로오즈 전기영동을 통해 GV, MG, UU, IC의 검출이 확인되었으며, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출방법으로는 GA, MG, UU, IC와 함께 CA 병원체가 추가로 확인이 되었다. 이러한 두 검출방법의 민감도 차이를 염기서열 분석방법을 시행하여 확인한 결과, 임상샘플 상에 GV, MG, UU, IC와 CA가 함께 존재하는 것을 확인하였으며, 이는 민감도가 높은 DNA칩을 통한 시험으로 극소량 감염된 병원체의 검출도 가능하다는 것을 의미한다.
또한 위양성의 임상 예로서, PCR 검출 방법으로는 CT, SA, UU, IC를 확인한 반면, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출 방법으로는 SA, UU, IC이 검출 되었고, 염기서열 분석 방법을 이용하여 확인 한 결과, PCR 검출방법에서 확인된 CT는 위음성으로 확인되었다. 이는 아가로오즈 전기영동을 통한 판독 단계에서 비특이적인 PCR 산물에 대해 자칫 검사자가 위양성의 결과를 양성으로 판단하게 되는 오류를 범할 수 있으므로 그 특이도 또한 DNA 칩이 우수함을 확인할 수 있다.
이러한 실험들을 반복한 결과, 민감도 50%, 특이도 80%의 PCR 검출방법에 비해 본 발명에 따른 DNA 칩은 민감도 95%, 특이도 100%로 그 유효성이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
공지되어 사용되고 있는 프로브의 염기서열
서열번호 Probe name 염기서열 Tm % GC 진단균
55 C_NG1 gatatttttc cgtaacgtct ctaagtct 59.8 48 임질균
56 C_NG2 gtctctaagt ctgctttcgt ttgttg 61.7 41.66 임질균
57 C_CT1 ttttcttcgt cagttaaacc ttccc 59.9 40 클라미디아
트라코마티스
58 C_CT2 gataggacat ggctctacaa cgaac 59.8 40.9 클라미디아
트라코마티스
59 C_MH atttgcaata ggaaatgatt gcaga 59.8 32 마이코플라즈마 호미니스
60 C_MG ccattactga cgcttaggct tga 59.4 48 마이코플라즈마 제니탈리움
61 C_CA tgacaatggc ttaggtctaa ccaaa 59.9 40 칸디다 알비칸스
62 C_UU gtgcaaatgt gatccaactt gg 63.2 45 유레아플라즈마 유레아라이티쿰
63 C_TV gcaaaggcag tccttgacaa c 60 52 트리코모나스
바지날리스
64 C_GV aggctaaacc gagtacgtgt ga 57.6 50 가드넬라
바지날리스
65 C_HSV1 agggcggcga ctttgacga 65.2 76 헤르페스심플렉스 바이러스 유형 1
66 C_HSV2 gggaggaagg cgcggagggg 69 82 헤르페스심플렉스 바이러스 유형 2
또한, 본 발명에 따른 신규 프로브들이 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브 서열들과 비교하여 민감도 및 특이도가 우수하다는 것을 입증하기 위하여, 표 5에 나타난 바와 같이, 이미 공지되어 있는 프로브로서, 진단키트 제조회사로 알려진 굿젠에서 출원한 대한민국 공개특허 제10-2010-0058919호에 기재되어 있는 프로브 염기서열을 이용하여 제조된 프로브와 본 발명에 따른 신규 프로브를 각각 2번씩 반복 스팟팅하여 실시예 2와 동일한 방법으로 DNA 칩을 제조하였으며(도 9), 이미 공지되어 있는 프로브에 대한 PCR은 대한민국 공개특허 제10-2010-0058919호에 명시되어있는 프라이머를 사용하였으며, Cy3-dCTP를 이용한 바디 레이블링 방법을 이용하여 대한민국 공개특허 제10-2010-0058919호에 명시되어있는 PCR 조건에 맞추어 수행하였다. 그 다음, DNA칩 혼성화 및 결과판정은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. 이 때, 샘플은 12종의 검출 여부를 확인할 수 있도록 단일 PCR 검사 및 시퀀싱으로 감염이 확인된 임상샘플의 혼합체를 사용하였다.
그 결과, 도 9 및 표 6에 나타난 바와 같이, DNA칩의 형광 신호세기 값에서 차이가 많이 나는 것을 볼 수 있으며 대부분의 경우에서 본 발명에 따른 프로브는 양성 스팟으로 판정된 반면, 이미 공지되어 있는 프로브는 음성 스팟으로 판정된 것을 확인하였다.
비뇨생식기 감염 원인균별 DNA칩 스팟의 신호세기 값
Name SV SBR Name SV SBR Name SV SBR
C_NG1 779 3.50 PM 65206 199.19 C_CA 1 1.00
754 2.86 17 1.06
NG_3 2482 6.98 CA_1 5681 20.26
2404 6.39 5918 21.20
C_NG2 2024 8.20 　 0 1.00 C_UU 195 1.64
1923 7.59 199 1.68
　 -5 0.98 UU_0 3588 13.29
-5 0.99 3810 13.70
C_CT1 86 1.25 PM 65204 197.9909 C_TV 117 1.35
25 1.08 114 1.36
CT_1 4849 15.78 TV 913 3412 12.45
5120 16.24 3630 13.10
C_CT2 15 1.04 　 -14 0.957704 C_GV 8 1.02
26 1.08 24 1.07
　 -5 0.98 GV_1 20366 67.12
1 1.00 21555 72.14
C_MH 2417 7.71 PM 65192 191.0641 C_HSV1 132 1.41
2329 7.73 25 1.08
MH_2 4896 15.49 HSV1_2 25053 81.04
4634 14.63 25703 85.55
C_MG 116 1.30 　 3 1.009494 C_HSV2 138 1.46
42 1.12 152 1.52
MG_2 547 2.64 HSV2 913 22927 79.25
569 2.76 23008 78.73
표 6은 각 스팟의 신호세기 값을 나타낸 것으로, MH의 경우, 이미 공지되어 있는 프로브의 신호세기 값은 SV 값이 2417, 2329 이고 SBR 값은 7.71, 7.73의 값을 나타낸 반면, 본 발명에 따른 프로브의 신호세기 값은 SV 값이 4896, 4634이고, SBR 값은 15.49, 14.63의 값을 나타내는 것을 확인하였으며, 이를 통해, 두 프로브 모두 분석 통과 기준 수치를 넘어 양성 스팟으로 판정되었으나, 본 발명에 따른 프로브의 신호세기 값이 더 높게 나타났으므로 본 발명에 따른 프로브의 민감도가 더 우수한 것을 확인하였으며, MG의 경우에는 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브 경우에서는 신호세기 값이 낮게 나와 음성 스팟으로 판정된 반면, 본 발명에 따른 프로브에서는 양성스팟으로 판정된 것으로 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 프로브와 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브와의 비교 실험을 통해 본 발명에 따른 프로브가 높은 민감도를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 첨가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> DNA Chip for Diagnosing Urogenital Infection Disease <130> P10-B318 <160> 66 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttttttttta ttacttaata gtcaaaactt tcaacaacgg atct 44 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ttttttttta ccccaccatt tttccggagc gagttacgaa gaca 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tttttttttg ggctttgatc cgaggatttc cgaatgggga gacc 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tttttttttt acgtgggtca ttggcgtggg gggttacagc gaca 44 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tttttttttg ttgagaaata ccttgatggt cagcaaaact ttgc 44 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tttttttttc gggtcgagag actgaacggc cacattggga ctga 44 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tttttttttc gccaatatac ctaccaagct ccactgatag ggct 44 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttttttttta tcctaaaaaa ggtgtagaga aatatggtcc tgaa 44 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tttttttttt tatggacgtc gtttcgatat tccatcaggt actg 44 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tttttttttt attatgttag atggaagtgg cttaagtcgc tgtg 44 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tttttttttg cttccgtaca ctcaagctca caacaccaac atac 44 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttttttttta tctggtggac tactcgccgg tcagcgaaaa acac 44 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tttttttttg tcgccgggca ccaccacgcc gtattggtat tcgt 44 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tttttttttg taaagttaat acctttgctc attgacgtta cccg 44 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tttttttttc tttgttccct aagtccaact actaaactgg ggga 44 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tttttttttt ttttttcacg gttatcgctg aactcgg 37 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ccacaagtac cattcgtgcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ccaggcatgg tgttcaattc 20 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tcattactga tttgcttaat tgcac 25 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aacgtccacc acgtatatct tc 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 caatggctaa tgccggatac gc 22 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggtaccgtca gtctgcaat 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tatcaatttc aaccggctcc 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccacaaaaac tgtggtgtac c 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ctaggcgttt gtactccgtc a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcctcagaag tttatgcact 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 caggctgcct atcagaaagt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gctcaaggcc cttcataata 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tgggttaagg caatagcaa 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tgtattttcc caaggtttga a 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ataccgcata acgtcgcaag 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ccaccggtat tcctccagat 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ctcagcaaat gcatcacaaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ccaagccttg acgaactaaa 20 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 agttgatgaa accttaaccc cttgg 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ccgttgaggg gttttccatt tttgc 25 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 tgggacacat gccttcttgg 20 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 acccttagtc agactctgtt acttaccc 28 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 atcctcgctt taggaacaac t 21 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ccaactgccc ccttatcta 19 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cattgataac gaagctcttt acgat 25 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gcatgttgtg ccggacataa ccat 24 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tctccaaagg tttctgatac agt 23 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gtgagctctg ggactgtaag a 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gctacgcata cccgcgttgc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgaagacctt cgagcagaca 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 caagttggat cacatttcca 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gccgtttaca cctcaaactt 20 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 aagatccact atcgccagca gg 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 attcagttcc gtttcccagc gg 22 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ggtttgttgt gaggagcca 19 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 cctggaaaat ctccttagcc 20 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ccatgcacgt aaaacacg 18 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gtgtgccgtt tttcgagt 18 <210> 55 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gatatttttc cgtaacgtct ctaagtct 28 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gtctctaagt ctgctttcgt ttgttg 26 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ttttcttcgt cagttaaacc ttccc 25 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 gataggacat ggctctacaa cgaac 25 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 atttgcaata ggaaatgatt gcaga 25 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ccattactga cgcttaggct tga 23 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 tgacaatggc ttaggtctaa ccaaa 25 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gtgcaaatgt gatccaactt gg 22 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gcaaaggcag tccttgacaa c 21 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 aggctaaacc gagtacgtgt ga 22 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 agggcggcga ctttgacga 19 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 gggaggaagg cgcggagggg 20

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브는 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA와 하이브리다이제이션(hybridization)되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  3. 제2항에 있어서, 상기 비뇨생식기 감염 질환 원인균은 대장균(Escherichia coli), 클랩시엘라 프네우모니아이(Klebsiella pneumoniae), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus fecalis), 임질균(Neisseria gonorrhea), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydiae trachomatis), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 가드넬라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1(Herpes simplex virus - type1) 및 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2(Herpes simplex virus - type2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  4. 제1항에 있어서, 시험 검증군 및 혼성화 검증군을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  5. 제4항에 있어서, 상기 시험 검증군은 베타-글로빈과 하이브리다이제이션이 가능한 서열번호 15의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  6. 제4항에 있어서, 상기 혼성화 검증군(Position Marker)은 서열번호 16의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA칩은 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 유전자당 3 개의 동일한 스팟(spot)을 포함하며, 중간 위치에 시험 검증군 및 혼성화 검증군의 반복적인 스팟을 포함하는 전체 프로브가 집적된 구간을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  8. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 DNA칩 기판에 고정화되기 위하여 5'말단에 T-링커를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 DNA칩; 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA 및 시험 검증군인 베타-글로빈을 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 혼성화 검증군과 상보적인 염기서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 포함하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 엔테로코커스 페칼리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 염기서열을 가지는 칸디다 알비칸스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 호미니스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 염기서열을 가지는 가드넬라 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 가지는 클라미디아 트라코마티스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 염기서열을 가지는 대장균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 염기서열을 가지는 스태필로코쿠스 아우레우스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 제니탈리움 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 43 및 44의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 45 및 46의 염기서열을 가지는 임질균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 염기서열을 가지는 유레아플라즈마 유레아라이티쿰 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 49 및 50의 염기서열을 가지는 클랩시엘라 프네우모니아이 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 51 및 52의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트 및 서열번호 53 및 54의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
  11. 제9항에 있어서, 상기 프라이머는 5' 말단에 상기 DNA칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, FAM, TAMRA, Alexa Fluor 및 Texas Red로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
KR1020110096450A 2011-09-23 2011-09-23 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩 KR101272017B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110096450A KR101272017B1 (ko) 2011-09-23 2011-09-23 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩
CN201180075006.XA CN103958988A (zh) 2011-09-23 2011-11-29 用于诊断泌尿生殖感染性疾病的dna芯片
PCT/KR2011/009150 WO2013042824A1 (ko) 2011-09-23 2011-11-29 비뇨생식기 감염 질환 진단용 dna칩
US14/361,678 US9434998B2 (en) 2011-09-23 2011-11-29 DNA chip for diagnosis of genitourinary infections

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110096450A KR101272017B1 (ko) 2011-09-23 2011-09-23 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130032700A true KR20130032700A (ko) 2013-04-02
KR101272017B1 KR101272017B1 (ko) 2013-06-07

Family

ID=47915650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110096450A KR101272017B1 (ko) 2011-09-23 2011-09-23 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9434998B2 (ko)
KR (1) KR101272017B1 (ko)
CN (1) CN103958988A (ko)
WO (1) WO2013042824A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160069867A (ko) * 2014-12-09 2016-06-17 주식회사 랩 지노믹스 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013165537A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Real-time pcr for the detection of pathogens
US9976181B2 (en) 2016-03-25 2018-05-22 Karius, Inc. Synthetic nucleic acid spike-ins
CN107099618A (zh) * 2017-05-03 2017-08-29 上海速创诊断产品有限公司 一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的lamp引物组合物及其相关应用
CN108660254B (zh) * 2018-05-30 2023-07-28 杭州千基生物科技有限公司 生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法
CN109825615A (zh) * 2019-01-09 2019-05-31 中生方政生物技术股份有限公司 沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN110283921A (zh) * 2019-07-12 2019-09-27 中生方政生物技术股份有限公司 加德纳杆菌、白色念珠菌双重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法
CN111455075B (zh) * 2020-04-10 2022-12-23 天津红日药业股份有限公司 检测生殖道致病微生物的lamp引物组、微流控芯片和试剂盒
CN112941215B (zh) * 2021-02-07 2024-03-15 华东医院 泌尿系统真菌感染检测体系及其试剂盒和应用
CN113046488A (zh) * 2021-05-17 2021-06-29 四川华汉三创生物科技有限公司 检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法
CN117106938B (zh) * 2023-08-31 2024-05-28 苏州创澜生物科技有限公司 一种用于检测阴道炎病原体的试剂、试剂盒及应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
KR100532664B1 (ko) * 2002-09-09 2005-12-02 주식회사 바이오메드랩 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트, 및 이를 이용한 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법
KR100590901B1 (ko) 2003-02-24 2006-06-19 김철민 Ｑｃ 프로브를 포함하는 마이크로어레이 및 그 제조방법
KR100619189B1 (ko) 2004-10-08 2006-08-31 굿젠 주식회사 성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩,분석키트 및 유전형 분석방법
KR20070076532A (ko) 2006-01-18 2007-07-24 메디제네스(주) 각막이영양증 진단용 ｄｎａ 칩
KR100819634B1 (ko) 2006-11-23 2008-04-04 김연수 성 전파 질환 검사를 위한 신규한 올리고뉴클레오티드프로브와 이를 이용한 성 전파 질환 검사용 ｄｎａ칩,분석키트 및 그 제조 방법
KR101038519B1 (ko) * 2008-02-27 2011-06-02 굿젠 주식회사 인체 감염성질환 병원체 감별진단 및 이의 항생제 내성 유무 판별방법, 멀티플렉스 키트 그리고 이를 포함하는 칩
KR101101880B1 (ko) * 2008-11-25 2012-01-05 문우철 성교전파성질환 원인균의 탐지, 유전자형 분석 및 항생제 내성 유전자형의 분석용의 ｄｎａ 칩, 키트, 및 이것을 이용한 탐지 및 유전자형의 분석방법
KR101225522B1 (ko) * 2009-10-16 2013-01-23 (주)지노첵 성적인 접촉에 의해 감염되는 질병을 일으키는 병원성 미생물 검사용 프로브, 그리고 이를 이용한 병원성 미생물 검사 칩, 검사키트 및 검사방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160069867A (ko) * 2014-12-09 2016-06-17 주식회사 랩 지노믹스 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013042824A1 (ko) 2013-03-28
US20140336082A1 (en) 2014-11-13
CN103958988A (zh) 2014-07-30
US9434998B2 (en) 2016-09-06
KR101272017B1 (ko) 2013-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101272017B1 (ko) 비뇨생식기 감염 질환 진단용 ｄｎａ칩
US10584392B2 (en) Method for simultaneous detection and discrimination of bacterial, fungal, parasitic and viral infections of eye and central nervous system
JP5196853B2 (ja) プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2007159411A (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP2008278864A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278869A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278866A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278867A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278870A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び遺伝子検査方法
KR101225522B1 (ko) 성적인 접촉에 의해 감염되는 질병을 일으키는 병원성 미생물 검사용 프로브, 그리고 이를 이용한 병원성 미생물 검사 칩, 검사키트 및 검사방법
KR100832860B1 (ko) 호흡기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 ｄｎａ칩
KR101623489B1 (ko) 성인성 질환의 원인균 탐지용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 키트
KR101335483B1 (ko) 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법
CN113502341A (zh) 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
WO2022143115A1 (zh) 眼科临床微生物快速检测用探针、芯片、引物、试剂盒和应用
JP5121281B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP5137442B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP5137443B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
WO2008011715A1 (en) Microorganism identification and characterization using dna arrays
KR20120038430A (ko) 성적인 접촉에 의해 감염되는 질병을 일으키는 병원성 미생물 검사용 프로브, 그리고 이를 이용한 병원성 미생물 검사 칩, 검사키트 및 검사방법
JP5078409B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
CN117230224A (zh) 一种人型支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
JP5137441B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP2006280273A (ja) 新規ポリヌクレオチド、それを用いた深在性輸入真菌症原因菌ヒストプラズマ属菌（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属菌には、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕｌａｔｕｍｖａｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕｌａｔｕｍｖａｒ．ｆａｒｃｉｍｉｎｏｓｕｍ，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕｌａｔｕｍｖａｒ．ｄｕｂｏｉｓｉｉと有性世代の菌名であるＥｍｍｏｎｓｉｅｌｌａｃａｐｓｕｌａｔａを含む）の検出用マーカ、プローブ、プライマー、検出方法およびキット
JP2007289170A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170405

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190510

Year of fee payment: 7