KR100819634B1 - 성 전파 질환 검사를 위한 신규한 올리고뉴클레오티드프로브와 이를 이용한 성 전파 질환 검사용 ｄｎａ칩,분석키트 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 성 전파성 질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균 (Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium), 질염 원인균(Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans), 성기궤양 원인균(Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi) 및 요도염 원인균(Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Corynebactrium) 등 총 18종 감염 세균의 존재여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 DNA 칩 및 유형 분석키트와 이에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브, 및 상기 분석키트를 사용하여 상기 18종 세균의 존재여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유형 분석키트 및 분석방법은 STD 진단에 있어 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다양한 검체를 대상으로 18종의 세균을 신속 정확하게 분석할 수 있는 효과가 있다.

성교전파성질환(STD), 질염, 성기궤양, 요도염, 중합효소연쇄반응, DNA 칩

Description

성 전파 질환 검사를 위한 신규한 올리고뉴클레오티드 프로브와 이를 이용한 성 전파 질환 검사용 ＤＮＡ칩, 분석키트 및 그 제조 방법{Novel Oligonucleotide Probes, DNA Chip and Detection Kit for Diagnosing Sexual Transmitted Disease and Method of Manufacturing Thereof}

도 1a 내지 도 1l은 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 18조의 프로브를 사용하여 다양한 성전파질환 원인균을 함유한 플라즈미드를 대상으로 하여 DNA 칩 분석을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다.

도 2a 내지 도 2g는 각각 본 발명의 다른 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 18조의 프로브를 사용하여 임상 검체 DNA를 표적으로 하여 DNA 칩 분석을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다.

본 발명은 성 전파성 질환(sexually transmitted diseases, “STD”라 한다) 원인 균을 검출할 수 있는 진단 키트 및 그 키트의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 남녀 모두를 대상으로 성 전파성 질환과 밀접한 관련이 있는 성 전파성 질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균 (Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium), 질염 원인균(Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans), 성기궤양 원인균(Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi) 및 요도염 원인균(Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Corynebactrium)에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프로브와 상기 프로브를 이용하여 STD 원인균을 신속 정확하게 검출할 수 있는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 STD 원인균 진단 키트 및 키트 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 DNA 칩을 이용하여 시료 내 상기 18종 세균의 존재여부를 신속 정확하게 분석할 수 있는 분석키트 및 분석방법에 관한 것이다.

본 발명은 기존의 STD DNA 칩이 프로브의 말단을 아민기로 변형시킨 뒤 글라스 상의 알데히드기와의 시프 염기반응에 따라 고정된 것을 특징으로 하고 있는 반면 본 발명의 STD DNA Chip은 다른 작용기가 필요 없기 때문에 9개의 구아닌 염기를 포함한 올리고 DNA가 녹아있는 용액을 칩 base위에 도포하면 구아닌 염기가 자발적으로 칩 위에 고정화되는 것을 특징으로 한다. 이처럼 기존의 칩 base를 변형시킨 본 STD DNA 칩의 특징은 다음과 같다. 1) 본 발명의 STD DNA 칩은 guanine을 인식하여 생체분자를 표면에 고정화 하는 기술로 다른 작용기가 필요 없기 때문에 저 비용으 로 probe DNA 제조 가능. 2) 종전의 DNA Chip에 비해 10-30분 정도의 짧은 hybridization 시간과 간단한 세척과정만 필요하기 때문에 30단계에 이르는 SNP 판별과정을 5단계로 조정할 수 있음. 3) 기존의 칩에서는 결합과 세척과정에서 정해진 온도를 1℃ 정도만 벗어나도 염기서열이 맞지 않는 DNA는 잘 떨어지지 않아 에러를 얻는데 비해, 본 STD DNA 칩은 5℃ 이상의 온도차에서도 SNP(single nucleotide polymorphism)를 쉽게 확인 할 수 있음. 4) 기존의 칩에서는 결과의 판독을 위해 수십 ng/ml이상의 cDNA를 사용하여 왔지만 BMT Guanine Chip™ 에서는 수십 pg/ml~수십 ng/ml 의 농도에서도 SNP 판독이 가능. 5) 측정점 주변에 배경 형광이 많이 존재하면 판독에 많은 문제가 있지만 BMT Guanine Chip™은 특수한 표면처리 과정과 blocking solution을 제공하여 cDNA가 표면에 부착될 수 없게 하여 배경 형광을 최대한 제거하여 선명한 측정점의 형광만을 관찰할 수 있다.

성 전파성 질환(sexually transmitted disease, STD)이란 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말로서 원인 별로 살펴 보면 (1) 성전파질환, (2) 질염, (3) 성기궤양 및 (4) 비 임균성 요도염 (nongonorrheal urethritis, NGU) 원인균 가운데 몇몇 원인균들이 95% 이상으로 절대 다수를 차지하고 있다. 여기에서 비임균성 요도염이란 남성에서 요도염이 발생하였으나 임균 (Neissetia gonorrhoeae)이 확인되지 않는 경우를 가리키며 비임균성 요도염의 가장 흔한 원인균은 클라미디아 트라코마티스며, 그 외에 유레아플라스마 유레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum)과 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium)도 중요 원인균으로 지적되고 있다. 즉 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레알리티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움 등의 4종류 세균이 STD 원인의 절대 다수를 차지하고 있다는 것이 기존의 연구 보고된 내용이었다. 이들 세균은 모두 공통적으로 남성에서 요도염 (anterior urethritis)의 중요 원인이 되며 부고환염 및 전립선염을 합병할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 된다. 또한 여성에서는 자궁경부염 (cervicitis)과 골반염증성질환 (pelvic inflammatory diseases)의 주 원인이 되며, 나팔관 폐쇄 (fallopian tube occlusion)를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신 (ectopic pregnancy) 등 의 합병증을 유발할 수 있다.

구미의 경우 오늘날 클라마이디아 감염이 가장 흔하며, 국내에서도 최근에는 임질은 줄어드는 대신 클라마이디아 감염과 비임균성 요도염이 늘어나는 추세이다. STD는 다른 질환과 달리 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 상기 STD의 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 만약 어떤 환자에서 일단 요도염이 발견되면 그것이 임균성인지 비임균성인지를 먼저 감별해야 하는데 그 이유는 치료 방법과 경과가 서로 다르기 때문이다. 그러나 근래에는 항균제의 오남용에 따른 세균의 변이와 혼합감염의 증가로 인해 양자간의 구별이 애매한 경향이 많고, 정확한 진단을 위해서는 본 발명에서와 같은 분자유전자적 검사법이 필요하다.

임균성 요도염을 일으키는 임균(N, gonorrhoeae)은 나이세리아(Neisseria)속에 속 하며 진단은 일차적으로 그람염색 (Gram stain)에 의한다. 그람염색으로 특징적인 세포내 그람음성 쌍구균의 존재를 확인하는 것은 간편하고 정확도가 비교적 높아서 널리 사용되는 방법이다. 그러나 무증상이거나 증상이 미미한 경우 그람염색으로 판단이 애매하거나 위음성 (false negative)으로 나오는 경우가 많아 이를 보완하기 위해서 임균배양을 시도한다. 임균의 배양은 여러모로 유용하고 정확한 검사 방법이지만 검사결과를 알기까지 많은 시간과 비용이 소모되는 단점이 있다.

이외 효소면역검사법 (enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광검사법 (immunofluorescence technique)은 임균 감염질환 진단에 있어 새로운 항원 확인방법으로 이용되고 있는데 배양검사에 비해 더 신속하게 결과를 얻을 수 있으며, 민감도 (sensitivity)와 특이도 (specificity)가 더 높은 것으로 보고되고 있으나 고비용의 단점이 있다. 비임균성 요도염은 최근 임균성 요도염이 감소하는데 대해 역으로 발병율이 증가하고 있다. 비임균성 요도염은 단일 질환이 아니라, 여러 가지 미생물에 의해 일어날 수 있는 일종의 증후군 (syndrome)이다. 비임균성 요도염의 원인 미생물로서 가장 중요한 것이 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia, trachomatis)인데 이는 세포내 기생성(intracellular parasitism)의 생존 주기(life cycle)를 가지는 미생물로 지놈에 DNA와 RNA를 모두 갖고 있으며 모두 15가지의 혈청형이 있는데 비임균성 요도염을 일으키는 것은 D-K형이다. 이에 의해 발병할 수 있는 인체 질환으로는 트라코마와 호흡기감염, 요도염과 자궁경부염, 부고환염, 골반염증성질환을 포함한 성전파질환이 있고 최근들어, 심근염을 야기한다 는 보고도 있다.

클라마이디아 트라코마티스의 진단은 (1) 감염부위에서 채취된 가검물을 배양, 분리 확인하는 방법, (2) 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 방법, (3) 환자의 혈청에서 항체를 분리, 확인하는 방법이 사용되어 왔으며, 최근에는 (4) 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)과 히브리다이제이션 (hybridization) 등의 분자유전학적 기법을 이용하는 방법이 선호된다. 상기 검체를 배양, 분리하는 방법은 장시간이 소요된다는 점, 진단 민감도가 낮다는 점 등으로 인해 임상 진단 목적으로 적합치 못하며 감염부위의 상피세포를 직접 도말 염색하여 균을 확인하는 간편성은 좋으나, 진단 민감도가 낮다. 또한 단클론항체에 형광물질인 FITC (fluorescein isothiocynate)가 부착된 시약을 이용하는 형광항체법은 민감도는 비교적 높으나 고비용과 전용 장비를 요한다는 단점이 있어서 제한적으로 사용되고 있다.

인간과 각종 포유류 동물에 광범위하게 존재하는 마이코플라스마와 유레아플라스마속에 속하며 비뇨생식기에 감염을 유발할 수 있는 유레아플라스마 유레아라이티쿰과 마이코플라스마 제니탈리움은 배양하기가 기술적으로 매우 어렵고, 염색이나 면역학적 방법으로도 발견하기가 어렵다. 이에 따라 PCR에 의거한 분자유전학적 검사법으로 진단하려는 것이 최근의 추세이다. 이 경우 각 균의 종에 특이한 유전자의 DNA의 염기서열을 PCR로 증폭한 후 이를 시퀀싱 반응이나 히브리다이제이션 등으로 확인하는 방법이 주로 이용되고 있으며 현재 많은 유용성이 입증된 상태이다.

이처럼, 세균감염이 있을 때 그 원인균을 정확하게 파악하는 것은 정확한 진단 뿐 아니라 감염의 근원을 파악하며, 병태를 파악하고, 경과와 예후를 예측하며, 치료방침을 결정하고, 백신의 개발을 하는 데 필수적이다. 이때의 원인균 진단은 단순한 균의 속과 종 뿐 아니라 아종 (subspecies) 내지 균주 (strain)까지 파악할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 세균감염의 원인균을 정확하게 파악하기 위해서는 검사방법은 민감도(sensitivity), 특이도 및 재현성이 100%에 가까워야 한다.

배양검사나 면역검사 등 기존의 세균 체형 검사법으로는 이와 같은 조건을 만족시키기 힘들다. 이에 대해 세균 지놈의 유전자형, 즉 DNA 및 RNA의 염기서열을 분석하는 유전자 검사는 이론적으로 상기한 3가지 조건을 모두 만족시킬 수 있으며, PCR기법을 이용하여 임균감염과 클라마이디아 감염만을 검사하는 진단키트는 이미 상업화되어 사용되고 있다. 그러나 세균파악을 위한 유전자 검사법이 임상 진료나 기타 검사실에서 활발하게 사용되고 임상 진료에 실제 도움이 되기 위해서는 상기한 조건 외에도 추가로 갖추어야 할 조건이 많다. 즉 검사의 방법이 용이하고 해석하기도 쉽고 간편해야 하며, 신속하게 결과를 얻을 수 있어야 하고, 특별한 고가의 장비가 필요 없이 검사할 수 있어야 하며, 검사가 자동화되어 있어서 다수의 검체를 신속하게 검사할 수 있어야 하고, 검사 비용도 저렴해야 한다. 이를 위해 PCR은 가급적 대상 세균 모두를 하나의 튜브 내에서 한번의 PCR 반응으로 검사하는 것이 현재 추세이다. 그러나 지금까지 성전파질환, 요도염, 성기궤양 및 자궁경부염 등의 원인이 되는 다음의 18종 세균(Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Corynebactrium)을 동시에 검색하는 방법에 대한 보고는 없으며 이러한 PCR 키트가 상업화 되어 있지는 않은 상황이다.

향후 PCR 후 증폭된 산물이 정확하게 원하는 세균의 DNA인지를 정확하게 확인하는 검사도 중요하다. 아울러 세균의 유전자형을 정확하게 판독하여 항균제 내성이나 생물학적 침해도 등을 정확하게 예측할 수 있는 유전자검사법도 필요하다. 이를 위해 각종의 STD 원인균을 동시에 분석하고 나아가 항균제 내성 등의 정보도 함께 알 수 있는 DNA 칩(또는 DNA 마이크로어레이)의 개발이 시급하다. 이에 따라 본 발명에서는 상기한 18종의 STD 원인균에 대한 PCR 방법 및 상기 18종의 원인균의 존재여부를 분석할 수 있는 DNA 칩을 연구하게 되었다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 성 전파 질환과 밀접한 관련이 있는 다양한 세균들을 신속하고 간단하게 검출할 수 있는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 이용하여 성 전파 질환 원인균을 선택적으로 검출할 수 있는 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩(마이크로 어레이) 및 상기 DNA 칩을 포함하는 성 전파 질환 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 성 전파 질환 원인균의 존재유무를 신속하게 진단할 수 있는 상기 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 18로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 성 전파 질환 원인균을 검출하기 위한 프로브가 제공된다. 상기 프로브는 성 전파 질환의 주요 원인균으로 남성 및 여성의 생식 관련해서 중요한 영향을 미칠 뿐만 아니라 이들 원인균들의 분류의 기준이 되는 16s rRNA 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 제공되는 올리고뉴클레오티드 프로브는 9개의 구아닌 염기를 첨가하여 표면의 글라스와의 반응성을 향상시킨 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩; 및 상기 프로브와 시료 DNA의 교잡 반응을 탐지하는 표지수단을 포함하는 성 전파 질환 원인균 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 따르는 상기 키트의 구성을 통하여 성 전파 질환과 관련이 있는 다양한 세균의 감염 및 존재여부를 조기에 정확, 신속하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 관점에서는 상기 DNA 칩 표면의 글라스와의 반응성을 증가시킬 수 있도록 각종 성 전파 질환 원인균과 특이적으로 결합할 수 있는 상기 프로브의 5' 말단에 구아닌 염기를 결합시켜 프로브를 변형시키는 단계; 및 상기 변 형된 프로브를 글라스 상에 고정시켜 DNA 칩을 제조하는 단계를 포함하는 성 전파 질환 원인균 진단 키트의 제조 방법을 제공한다.

더욱이 본 발명의 또 다른 관점에서는 성 전파 질환 원인균의 게놈 중 16s rRNA 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 프로브와 상기 DNA 프로브의 위치를 알려주는 포지티브 컨트롤을 포함하는 성 전파 질환 원인균 유형 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩이 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

상기에서 설명한 바와 같이, STD 원인균은 100여종 이상이 밝혀졌으며, 특히 성 전파 질환과 밀접한 관련성이 있는 세균으로는 약 18종이 보고되고 있다. 이들을 성 전파 질환별로 세분화하여 살펴보면 성 전파 질환(sexually transmitted diseases; STD) 원인균 (Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium), 질염 원인균(Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans), 성기궤양 원인균(Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi) 및 요도염 원인균(Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Corynebactrium) 등 총 18종 등이 있다.

우선, 본 발명에서는 성 전파 질환과 밀접한 관련이 있는 다양한 원인균을 탐지할 수 있는 프로브를 설계하고, 상기 프로브를 이용하여 다양한 샘플 내에 존재하고 있는 다수의 성 전파 질환 원인균을 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위하여 본 발명에서는 총 100여가지 성 전파 질환 원인균의 전 서열 중 질환에 직접적으로 많은 영향을 미치고 있는 18종의 STD 원인균 DNA 서열을 기준으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 특이적 프로브를 설계하였다. 상기 설계된 프로브는 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다양한 STD 원인균에 대한 결합능을 확인한 후 최종적으로 18조의 프로브를 선별하였다.

상기에서 선별된 프로브는 핵산자동합성기(ExpediteTM 8909 합성기, ABI 사)를 사용하여 합성되었다. 이와 같이 합성된 총 27조의 프로브 5' 말단에 다수의 구아닌 염기를 추가하는 변형을 실시하여 상기 프로브가 DNA 칩의 표면에 형성된 글라스 슬라이드에 자발적으로 고정될 수 있도록 하였다. 이와 관련하여 상기 DNA 프로브는 바람직하게는 50 ~ 150 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 약 100 pmol/㎕의 농도로 첨가된다.

상기와 같이 변형된 STD 원인균 특이적 프로브가 고정된 DNA 칩에 STD 감염 여부를 검출할 수 있도록 상기 프로브와 교잡 반응할 수 있는 총괄 프라이머(general primer)에 의하여 증폭된 PCR 산물에 적절한 물질이 표지되어 있는 표지수단을 더욱 포함하는 구성을 취할 수 있다. 본 발명과 관련하여 STD DNA 증폭 산물에 부착되는 표지 물질은 바람직하게는 형광 물질로서 Cy3가 사용될 수 있다.

상기와 같이 구성되는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 진단 키트를 이용하여 우선 대표적인 12종의 세균을 표적 DNA로 하여 본 발명에서 사용된 프라이머를 이용 하여 PCR을 실시한 후 본 발명에서 확인한 18조의 STD 원인균 특이적 프로브와의 하이브리디제이션 실험을 실시한 결과 모두 이에 상응하는 특정 원인균의 STD DNA와 선택적으로 결합한다는 사실을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예 일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : STD 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩의 제작

본 발명에 따른 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩(마이크로어레이)은 올리고 뉴클레오티드 프로브의 합성과 상기 프로브를 슬라이드 상에 고정하는 단계로 구성된다.

(1) STD 올리고 뉴클레오티드 프로브의 설계

남성에서는 요도염, 전립선 부고환염 및 전립선염을 야기할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 될 뿐만 아니라 여성에서는 자궁경부염(cervicitis)과 골반염증성질환 (pelvic inflammatory diseases)의 주 원인이 되며, 나팔관 폐쇄 (fallopian tube occlusion)를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신을 야기하는 성 전파 질환 원인균 DNA에 선택적으로 결합될 수 있는 유형 특이적 프로브로 사용될 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 설계하였다.

우선, 미국 NCBI ( National Center for Biotechnology Information ) 데이터베이스로부터 18종의 성 전파 질환 원인균(Neisseria gonorrhea, Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Herpes simplex virus type 1 & 2, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Corynebactrium)의 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 'DNASTAR( MegAlignTM 5, DNASTAR Inc .)'를 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬 ( pairwise alignment ) 및 다중서열정렬( multiple sequence alignment )을 실행한 후 계통도( Phylogenetic tree )를 작성하고 각 원인균별 유형 특이적 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5( primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co .)를 활용하여 원인균 특이 프로브를 설계하였다. 이때 프로브의 길이는 30+3 및 40+2의 올리고 뉴클레오티드로 설정하여 50조의 STD 원인균 특이적 프로브를 설계하였다.

(2) 설계한 프로브의 하이브리디제이션 및 프로브 선별

상기 과정에서 설계한 총 50조의 프로브를 대상으로 컴퓨터 프로그램( Amplify 1.2, University of Wisconsin )을 사용하여 설계 과정에서 이미 확보한 총 18종의 STD 원인균을 대상으로 가상 결합능을 분석하였다. 본 실시예에서는 상기의 성 전파 질환 관련 18종 원인균과 특이적으로 결합할 수 있는 것에 우선순위를 두고 선택하였으며 프로브의 명칭과 서열번호 및 유형은 하기 표 1에 제시하였다. 설명의 편의를 위하여 본 발명에서 사용되는 총 18조의 프로브는 각각 STD -1 내지 STD -18로 명명하였으며, 이들 프로브는 서열번호 1 내지 서열번호 18로 구성된다.

표 1. 다양한 유형의 STD 원인균 DNA 와 결합할 수 있는 유형 특이적 프로브

명칭	프라이머	원인균
STD1	CGCAATCGGCACCTTACGAGAAATCAAAG (서열번호 1)	Candida albicans
STD2	GGTTCTGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAG (서열번호 2)	Gardnerella vaginalis
STD3	TCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTG (서열번호 3)	Corynebactrium
STD4	CCATCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAG (서열번호4)	Chlamydiae trachomatis
STD5	CAGAATCTTTGGAGAAATCATAGTTCTTGGG (서열번호 5)	Trichomonas vaginalis
STD6	TTCGGTAGTGAAGTTAACACATTAAGTATCTC (서열번호 6)	Mycoplasma genitalium
STD7	CGGCGCCGACGCGAACGCATTAAGTGT (서열번호 7)	Treponema pallidum
STD8	TAATCGCGTGAGGCCTTGCGGTCCCC (서열번호 8)	Ureaplasma urealyticum
STD9	TGGTAGCGTAGCTAACGCGTGAAATTGA (서열번호9)	Neisseria gonorrhoeae
STD10	CTGGCGCCCGAAGCTAACGTGATAAATC (서열번호 10)	Haemophilus ducreyi
STD11	TTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCAC (서열번호 11)	Enterococcus
STD12	CTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTC (서열번호 12)	Pseudomonas
STD13	CTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCAC (서열번호 13)	Staphylococcus
STD14	GAGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTC (서열번호 14)	E-COIL
STD15	GTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAG (서열번호 15)	Klebsiella
STD16	GTGGCTTCTGGAGCTAACGCGTTAAATC (서열번호 16)	Proteus
STD17	CTCTTGACATCCTTCGCAAAGCTATAGAGAT (서열번호 17)	Mycoplasma hominis
STD18	AGGGTGTTGATCACCACGGAGGGCGA (서열번호 18)	Herpes simplex virus
PC	CTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAAC (서열번호 19)	Beta-globin

(3) 선별된 STD 원인균 특이적 프로브 합성

상기 과정에서 선별된 18조의 STD 원인균 특이적 프로브들은 5` 말단에 9개의 구아닌기를 포함하여 하기와 같은 과정을 통하여 합성되었다.

상기 프로브는 올리고 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 합성화학에 근거한 고체상 합성기법을 탑재하고 있는 ExpediteTM 8909 핵산 합성기( ABI 사)를 이용하여 합성하였다. 우선, 합성반응은 올리고뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오사이드를 고정시킨 CPG 컬럼에서 수행하였으며, 기본적으로 디트리틸레이션 ( detritylation ), 커플링( coupling ), 캡핑 ( capping ) 및 산화( oxidation ) 반응을 반복주기로 하여 선별된 프라이머의 올리고뉴클레오티드 중합반응을 행하였다. 합성 종료 후 30% 암모니아수를 CPG 컬럼에 가하여 상기 올리고머를 격리시킨 다음 55℃에서 12시간 이상 탈보호(deprotection)시켜 고속진공( Speed Vac.)으로 농축 건조하였으며 다시 역상액체크로마토그래피 및 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 순수 정제하였다. 최종 정제된 올리고머는 260 nm 에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

(4) STD 올리고뉴클레오티드의 고정

상기에서 합성된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기 방법을 이용하여 DNA 칩 상에 고정하였다. 우선, 5' 말단이 다수의 구아닌 염기로 변형된 채로 합성된 올리고 뉴클레오티드 프로브를 2X SSC (0.05M sodium citrate , 0.45M NaCl )에 100 pmol / ul 이 되도록 녹인 후 5' 말단에 첨가된 구아닌 염기와 반응되는 DNA 칩의 글라스 상에 1 ul (54 ug / ml )씩 스포팅(spotting)하였다 .

한편, 본 실시예에서는 상기 프로브와 대상 DNA 증폭 산물과의 위치를 확인할 수 있도록 포지티브 컨트롤( PC )로서, 서열번호 19로 구성되는 올리고 뉴클레오티드를 기술한 것과 같이 5' 말단에 구아닌 염기를 첨가하여 변형시킨 후에 동일한 절차에 따라 글라스 상에 스포팅 하였다. 이어서, 상기 스포팅한 것을 습식 반응용기 ( humid chamber )에 넣고 상온에서 2시간동안 반응시켜 고정하였다.

상기 반응종료 후 슬라이드를 0.2% 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에서 1분간 힘차게 세척한 후 3차 증류수로 옮겨 1분간 세척하고 NaBH4 용액(0.1g NaBH4, 30ml phosphate buffered saline (PBS), 10ml ethanol)에서 5분간 환원시킨 후 다시 3차 증류수에 1분간 세척하고 건조 후 사용할 때까지 상온의 암실에 보관하였다.

실시예 2

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 키트를 사용하여 성전파질환 원인균의 플라스미드를 포함하고 있는 E. coli 균주를 대상으로 균주의 존재여부 확인 및 하이브리디제이션 여부를 실시하였다.

본 실시예에서 사용된 균주는 다음과 같다.

Ureaplasma urealyticum (Clone)

Mycoplasma hominis (ATCC 23114D)

Ureaplasma parvum (ATCC 700970D)

Neisseria gonorrhoeae (ATCC 700825D)

Mycoplasma genitalium (ATCC 33530D)

Treponema pallidum (Clone)

Herpes simplex virus type 1 (Clone)

Candida albicans (ATCC 14053D)

Herpes simplex virus type 2 (Clone)

Trichomonas vaginalis (ATCC 30001D)

Chlamydiae trachomatis (Clone)

Gardnerella vaginalis (ATCC 49145D)

상기와 같은 유형의 STD 플라즈미드 DNA를 함유하는 각 E.coli 균주는 37℃ LB 액체 배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정되어 주형 DNA 로 활용하였고 클론들은 다음의 방법을 토대로 획득하였다. 즉, Salt solution : 1㎕, Vector : 0.5㎕, Template DNA : 4.5㎕를 넣은 후 혼합하여 22℃에서 30분간 방치한 다음 Competent cell을 17 ㎕넣고 섞은 후 30분간 ice에 방치하였다. 이후 42℃ heat block에서 30초간 heat shock한 후, Ice에 5분간 방치한 후 SOC용액 200㎕을 즉시 넣어서 37 ℃ incubator에서 200rpm으로 1시간 배양한 다음 Ampicillin(50㎍/ml), X-Gal(40mg/ml), 100mM IPTG가 포함된 LB배지에 spreading한 후,Overnight 배양(Invitrogen TOPO TA cloning vector 사용)한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정되어 주형 DNA로 활용하였다.

(2) 중합효소 연쇄반응

성전파질환 원인균의 존재 여부를 검출하기 위한 PCR 반응액의 조성은 슈퍼바이오(SuperBio) 사로부터 구입한 10X 버퍼 2.5 ㎕, 10 mM MgCl2 3.75 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, Taq 중합효소 0.5 ㎕(1 unti)를 사용하였으며, 사용되는 프라이머는 Cy3가 결합되어 있는 하기 프라이머 세트를 각각 1㎕(40 pmoles)와 0.2㎕(10 pmoles), 증류수 5.0 ㎕, 및 상기에서 정제된 각각의 주형 DNA(8.0㎕)로 구성된 반응액을 총 20 ㎕로 조정하였다.

표 2. 설계된 프라이머 서열

Name	Primer sequence(5`~3`)	Product size(bp)
STD-F1*	ATGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATG(서열번호 20)	300~350bp
STD-F2*	AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG(서열번호 21)
STD-F3*	AGGACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACCCACGCGG(서열번호 22)
STD-F4*	AGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACACCGTAAACGATA(서열번호 23)
STD-F5*	GCGGTGGCCCTCAACCGTGGGGAGATAGCCCAGACC(서열번호 24)
STD-R1**	CAGGTCAACCCACGCACCACCAACIGCCATGCACIACC(서열번호 25)
STD-R2**	CAAATCACTCCACCAACTAAGAACIGCCATGCACTACC(서열번호 26)
STD-R3**	CATCTCACGACACGAGCTGACGACIGCCATGCACIACC(서열번호 27)
STD-R4**	GTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAAIACC(서열번호 28)
STD-R5**	CATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCAIC(서열번호 29)
STD-R6**	GGCGCATCTGGATCGACGTGTAIGGICAGACCCACT(서열번호 30)
IC-F*	CACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTG(서열번호 31)	180bp
IC-R**	GCAGAATCCAGATGCTCAAGGCCCTTCATAATATCC(서열번호 32)

* : 정방향 프라이머

** : 역방향 프라이머

PCR 반응 조건은 최초 94℃에서 5분간 예비변성 시킨 후 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분의 사이클을 총 40회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 5분간 가열한 후 종료하였으며, 최종 반응액 5 ㎕를 DNA 사이즈 스탠더드 마커와 함께 2% 아 가로스 겔에 부과하여 전기영동하였다.

(3) 하이브리디제이션( Hybridization )

본 실시예에서 사용된 주형 DNA 와 합성된 총 18조의 올리고 뉴클레오티드 프로브를 고정시킨 슬라이드 기판에 PCR 에 의하여 증폭된 PCR 증폭 산물을 이용하여 교잡반응을 실시하였다 . 교잡 반응실(Hybridization reaction chamber)은 100 ㎕ 용량의 커버슬립( GRACE Bio - Labs , USA )을 사용하였다.

상기에서 얻어진 5 ㎕의 증폭산물을 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 얼음에 3분간 방치한 다음 교잡 반응 용액으로 20X SSC 18 ㎕, 90% 글리세롤 50 ㎕, 50 mM 인산 버퍼 15.65 ㎕, 0.1% SDS 1.35 ㎕를 첨가하여 최종 용량을 90 ㎕로 조정한 후에 51 ℃에서 슬라이드 상에 고정된 프로브와 10분간 반응시켰다.

교잡반응 종료 후 chip 을 2 XSSC /0.1% SDS 용액에 담근 후 30℃에서 2분간 세척한 후 4 XSSC 용액으로 상온에서 1분간 세척한 다음 well 을 제거하고 EtOH 로 상온에서 짧게 세척한 다음 0.1X SSC 용액으로 한번 더 세척 후 건조시켰다. 건조된 슬라이드는 콘포칼 레이저 스캐너( confocal laser scanner , GMS 418 Array Scanner TaKaRa )를 이용하여 형광신호를 분석하였다.

도 1a 내지 도 1l은 각각 본 실시예에서 사용된 성전파질환 원인균 감염 플라스미드 DNA를 주형 DNA를 대상으로 본 발명에서 합성한 18조의 변형된 프로브를 사용하여 하이브리디제이션 반응을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 원은 프로브의 종류에 따른 위치를 나타내며, 각각의 대문자는 본 발명에서 사용된 5' 말단에 구아닌 염기가 추가된 프로브의 종류에 따라 증폭되는 성전파질환 원인균을 표시한 것이고, PC는 변형된 프로브의 위치를 확인하기 위하여 사용된 포지티브 컨트롤(positive control)이다.

도 1a는 Ureaplasma urealyticum DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론, 도 1b는 Mycoplasma hominis DNA를 함유하고 있는 ATCC 23114D 균주, 도 1c는 Ureaplasma parvum DNA를 함유하고 있는 ATCC 700970D 균주, 도 1d는 Neisseria gonorrhoeae DNA를 함유하고 있는 ATCC 700825D 균주, 도 1e는 Mycoplasma genitalium DNA를 함유하고 있는 ATCC 33530D 균주, 도 1f는 Treponema pallidum DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론, 도 1g는 Herpes simplex virus type 1 DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론, 도 1h는 Candida albicans DNA를 함유하고 있는 ATCC 14053D 균주, 도 1i는 Herpes simplex virus type 2 DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론, 도 1j는 Trichomonas vaginalis DNA를 함유하고 있는 ATCC 30001D 균주, 도 1k는 Chlamydiae trachomatis DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론, 도 1l은 Gardnerella vaginalis DNA를 함유하고 있는 ATCC 49145D 균주로부터 얻어진 DNA를 대상 DNA로 한 것이다.

도면에서 분명히 알 수 있는 것과 같이, Ureaplasma urealyticum DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론은 Ureaplasma urealyticum와 특이적으로 결합하는 STD1 프로브 가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1a), Mycoplasma hominis DNA를 함유하고 있는 ATCC 23114D 균주는 Mycoplasma hominis와 특이적으로 결합하는 STD2 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1b), Ureaplasma parvum DNA를 함유하고 있는 ATCC 700970D 균주는 Ureaplasma parvum과 특이적으로 결합하는 프로브가 없기 때문에 하이브리디제이션을 실시한 결과 아무런 반응도 일어나지 않았으며(도 1c), Neisseria gonorrhoeae DNA를 함유하고 있는 ATCC 700825D 균주는 Neisseria gonorrhoeae와 특이적으로 결합하는 STD4 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1d), Mycoplasma genitalium DNA를 함유하고 있는 ATCC 33530D 균주는 Mycoplasma genitalium과 특이적으로 결합하는 STD5 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1e), Treponema pallidum DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론은 Treponema pallidum과 특이적으로 결합하는 STD6 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일아났으며(도 1f), Herpes simplex virus type 1 DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론은 Herpes simplex virus type 1 과 특이적으로 결합하는 STD7 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1g), Candida albicans DNA를 함유하고 있는 ATCC 14053D 균주는 Candida albicans과 특이적으로 결합하는 STD8 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1h), Herpes simplex virus type 2 DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론은 Herpes simplex virus type 2 과 특이적으로 결합하는 STD9 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1i), Trichomonas vaginalis DNA를 함 유하고 있는 ATCC 30001D 균주는 Trichomonas vaginalis과 특이적으로 결합하는 STD10 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1j), Chlamydiae trachomatis DNA를 함유하고 있는 포지티브 클론은 Chlamydiae trachomatis와 특이적으로 결합하는 STD11 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 1k), Gardnerella vaginalis DNA를 함유하고 있는 ATCC 49145D 균주는 Gardnerella vaginalis 와 특이적으로 결합하는 STD12 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났고(도 1l) STD 균주를 함유하고 있지 않은 음성 대조군에서는 아무런 교차-하이브리디제이션 반응이 일어나지 않았음을 확인하였다.

이러한 결과는 상기 실시예 1에 제시된 표 1의 결과와 일치하는 것임을 확인할 수 있었으며, 본 실시예에서 확인하지 못한 다른 많은 성전파질환 원인균에 대해서도 표 1에서와 동일한 결과가 도출될 수 있을 것으로 기대되었다.

실시예 3

본 비교예에서는 인체 유래 샘플(요도나 자궁경부, 구강 분비물 및 세포)을 면봉이나 세포솔로 채취하여 얻은 검체를 대상으로 성 전파 질환 원인균 존재여부를 확인하였다.

(1) DNA 분리

상기 실시예 3의 다양한 검체로 부터 DNA를 분리하기 위해 본 연구자가 개발한 방 법 및 시약을 이용하여 DNA를 분리 및 정제하였다. 즉, 소변이나 스왑 검체를 5분 동안 13,000rpm에서 원심분리 한 후 상층액은 버리고, 획득한 펠렛(pellet)에 완충용액(lysis buffer, pH 6.8) 400μl와 프로티나아제 K 20㎕를 넣은 후, 펠렛이 완전히 풀어질 때까지 혼합한 후 95℃에 서 5분간 반응시키고, 여기에 6M 소디움 클로라이드 150㎕를 넣고 진탕 혼합한 후 13,000rpm에서 3분간 원심분리 한다. 이 후 새로운 2ml 튜브에 상층액을 옮기 고 여기에 2배의 에탄올을 첨가하고 혼합한 후 12,000rpm에서 3분간 원심분리한다. 이후 상층액을 버리고 실온에서 건조시킨 후 멸균된 3차 증류수나 혹은 TE 완충액(10mM Tris-HCl[pH 8.0], 1mM EDTA) 50㎕에 녹였다. 이 중 3 내지 5㎕를 PCR에 사용하였다.

상기 실시예에서 multiplex PCR 분석으로 STD감염의 유무와 원인 균이 미리 확인된 바 있는 인체 검체의 DNA를 대상으로 상기 실시예에서 수립된 방법대로 DNA chip 분석을 수행하였다. 검사 대상에 포함시킨 DNA검체로는 7개의 임상 샘플로 감염 검체 가운데 5 검체는 복합감염되어 있었고 2개 검체는 정상인 것으로 확인되었다. 본 DNA chip 분석 결과를 상업적으로 분석을 시행하고 있는 타사의 키트와 비교 분석하여 STD원인균 진단의 정확도를 조사하였다. 이로서 본 성전파질환 원인균 검출용 DNA 칩이 임상에서 STD 원인균을 선별하고 1차 검색하는 데 사용할 수 있을 지를 분석하였다.

도면에서 분명히 알 수 있는 것과 같이,도 2a의 임상검체에 대한 하이브리다이제이 션 결과를 보면 CA, MH 및 MG DNA와 특이적으로 결합하는 성전파질환 원인균 특이 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며, 도 2b의 임상검체에 대한 하이브리다이제이션 결과를 보면 HD와 TR DNA와 특이적으로 결합하는 성전파질환 원인균 특이 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며, 도 2c의 임상검체에 대한 하이브리다이제이션 결과를 보면 CB와 PS DNA와 특이적으로 결합하는 성전파질환 원인균 특이 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며, 도 2d의 임상검체에 대한 하이브리다이제이션 결과를 보면 EL과 HSV1 DNA와 특이적으로 결합하는 성전파질환 원인균 특이 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며, 도 2e의 임상검체에 대한 하이브리다이제이션 결과를 보면 UU와 MG DNA와 특이적으로 결합하는 성전파질환 원인균 특이 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며, 도 2f와 2g의 경우 정상 샘플로 하이브리다이제이션 결과를 보면 어느 균주에도 감염되어 있지 않은 것을 확인하였고 이는 하우스키핑 유전자의 하이브리다이제이션을 통해 PCR이 정확하게 작동하였고 이를 통해 확인이 가능하였다. 이는 본 개발자의 다중중합효소 연쇄반응 결과와도 동일한 양상을 보인 것으로서 이를 토대로 본 발명을 이용한 성전파질환 원인균 분석을 수행할 경우 각각의 균주들을 빠른 시간내에 정확하게 반응하여 검색이 가능함을 확인하였다.

표 3. 임상검체의 상업적 분석키트와 비교한 결과

	진단의 정확도
	M사	S사	G사	본 발명
STD 환자군(N=50)
Neisseria gonorrhea, NG	+	+	+	+
Chlamydiae trachomatis, CT	+	+	+	+
Ureaplasma urealyticum, UU	+	+	+	+
Mycoplasma genitalium, MG	-	+	+	+
Trichomonas vaginalis, TV	-	+	-	+
Gardnerella vaginalis, GV	-	-	-	+
Candida albicans, CA	-	+	-	+
Herpes simplex virus type 1, HSV1	-	+	-	+
Herpes simplex virus type 2, HSV2	-	+	-	+
Treponema pallidum, TP	-	+	-	+
Haemophilus ducreyi, HD	-	+	-	+
Pseudomonas, PSE	-	-	-	+
Enterococcus, ENT	-	-	-	+
Staphylococcus, STA	-	-	-	+
Klebsiella, KLE	-	-	-	+
Proteus, PRO	-	-	-	+
Corynebactrium, CORY	-	-	-	+
E.COIL	-	-	-	+
단일감염(N=20)	14(70)	17(85)	13(65)	19(95)
복합감염(N=30)	24(80)	18.5(92.5)	17(85)	19(95)
전체	15.3(76.7)	18(90)	15.6(78.3)	19(95)
정상대조군(N=10)	(100)	(100)	(100)	(100)

이러한 결과를 토대로 본 실시예에서 확인하지 못한 다른 많은 성 전파 질환 원인균에 대해서도 동일한 결과가 도출될 수 있을 것으로 기대되었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

본 발명에 따른 PCR 방법 및 DNA 칩은 다양한 STD(요도염과 자궁경부염 및 골반염증성질환) 세균들에 특이적으로 결합할 수 있는 각각의 균주 특이적 올리고 뉴클레오티드를 변형시킨 프로브를 포함하고 있는 DNA 칩, 즉 올리고 뉴클레오티드 마이크로어레이와 증폭산물에 형광물질이 표지되어 있는 표지수단으로 구성되는 진단키트를 통하여 성 전파 질환 원인균의 감염 및 존재여부를 정확하고 신속하게 다량으로 진단할 수 있다.

더불어, 프로브와 슬라이드 글래스의 결합 및 결합과정을 개선함하여 제조공정을 단축하고 에러발생을 줄임으로서 STD 원인균의 존재여부를 정확하게 검출하고 자궁경부암과의 관련성을 신속하게 예측하여 진단할 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명의 DNA 칩은 STD 진단의 민감도나 특이도, 재현성이 모두 98% 이상의 신뢰수준을 뛰어넘고 있으며, 복합감염도 정확히 진단할 수 있으며 검사의 방법이 간편하며, 결과 해석도 용이하고, 짧은 시간 내에 다수의 검체를 신속하고 정확하게 분석할 수 있다는 점에서 기존의 방법보다 우수하며, 경제적이다.

따라서, 본 발명은 STD 원인균 검색용 키트는 1차 검색이나 확진과 치료방침 결정을 위해 널리 사용될 것으로 판단되며, 기존의 배양이나 염색이나 단일 PCR 및 다중중합효소연쇄반응법 등 기존 DNA검사 키트를 대치할 것으로 기대된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

1. 성전파질환 원인균의 존재여부를 확인하기 위한 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프로브로서, 서열번호 1 내지 서열번호 18로 구성되는 군에서 적어도 하나 이상 선택되는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프로브.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 프로브는 성전파질환의 발병에 관련성이 있는 다양한 성전파질환 원인균 DNA와 특이적으로 교잡(Hybridization)되는 것을 특징으로 하는 프로브.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 프로브는 성전파질환 원인균의 게놈 서열 중 16s rRNA 영역의 DNA 서열에 특이적으로 교잡되는 것을 특징으로 하는 프로브.
4. 제 1항에 기재되어 있는 프로브를 포함하는 성전파질환 원인균의 존재 여부를 확인하기 위한 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩; 및 상기 프로브와 시료 DNA의 교잡(hybridization) 반응을 탐지하는 표지수단을 포함하는 성전파질환 원인균 진단 키트.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 DNA 칩은 5' 말단에 구아닌 염기가 포함되어 있는 DNA 서열을 갖는 프로브와 상기 DNA 칩 표면에 슬라이드 글라스 사이의 반응을 통하여 고정된 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트.
6. 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 프로브의 농도는 50 ~ 150 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트.
7. 제 4항에 있어서,

   상기 시료 DNA를 증폭시킬 수 있는 증폭수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트.
8. 제 7항에 있어서,

   상기 증폭수단은 STDM-F/R 각각 3~4개씩을 혼합한 프라이머 시스템과 300bp 증폭기 를 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트.
9. 제 8항에 있어서,

   상기 증폭을 위한 표지수단은 Cy3가 결합된 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트.
10. 제 4항에 있어서,

    상기 DNA 칩은 DNA 프로브의 위치를 알려주는 포지트브 컨트롤(Positive control)을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트.
11. 제 1항 기재의 DNA 프로브의 5' 말단에 다수의 구아닌 염기를 결합시켜 상기 프로브를 변형시키는 단계와; 상기 변형된 프로브를 글라스 상에 고정시켜 DNA 칩을 제조하는 단계를 포함하는 성전파질환 원인균 진단 키트의 제조 방법.
12. 제 11항에 있어서,

    상기 DNA 프로브는 성전파질환 원인균 게놈의 16s rRNA 영역의 올리고 뉴클레오티 드로서 성전파질환 원인균 DNA와 특이적으로 교잡 반응하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트의 제조 방법.
13. 제 11항 또는 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 DNA 프로브의 농도는 50 ~ 150 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단 키트의 제조 방법.
14. 성전파질환 원인균 게놈 중 16s rRNA 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 제 1항 기재된 올리고 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 프로브와 상기 DNA 프로브의 위치를 알려주는 포지티브 컨트롤을 포함하는 성전파질환 원인균 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩.
15. 제 14항에 있어서,

    상기 DNA 프로브의 5' 말단은 다수의 구아닌 염기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩.
16. 제 14항에 있어서,

    상기 DNA 프로브의 농도는 50 ~ 150 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 성전파질환 원인균 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩.

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