KR100923345B1

KR100923345B1 - 올리고 유전자칩을 이용한 디엔에이 칩, 유전자 검사 진단키드

Info

Publication number: KR100923345B1
Application number: KR1020070029305A
Authority: KR
Inventors: 송재영; 김병한; 최은진; 이창희; 한규하; 김태선; 송금수; 주후돈; 장병식; 김준배
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원); (주)바이오메트릭스 테크놀로지; 주식회사 제노바이오텍
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2009-10-22
Also published as: KR20080087292A

Abstract

본 발명은 올리고 유전자칩을 이용한 DNA 칩, 유전자 검사 진단키드에 관한것으로, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) 방법과 유전자 칩을 이용해 이유후전신소모성증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome; PMWS)의 원인체 중 가장 빈번하게 감염되는 것으로 알려져 있는 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus Type 2; PCV2), 돼지 생식기호흡기증후군바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV), 돼지 파보바이러스(Porcine parvovirus ; PPV) 유전자의 검출과 유전자형을 검사할 수 있다.

본 발명에 따르면 돼지 혈액 또는 조직에 존재하는 바이러스 유전자의 검출 및 유전자형을 높은 특이도로 검사할 수 있고, 여러 단계를 거쳐야 하는 종래의 검사 방법과 달리 한 번의 검사로 신속하고, 저렴한 비용으로 유전정보 획득할 수 있다.

PMWS, PCV2, PPV, PRRSV, 멀티플렉스 알티-피씨알, Microarray, DNA Chip, 유전자칩, 유전자칩검사법, 동물용 유전자칩, Guanine chip, SNP

Description

올리고 유전자칩을 이용한 디엔에이 칩, 유전자 검사 진단키드{DNA CHIP, GENE ANALYSIS TEST KIT USING OLIGO-GENE CHIP}

도 1은 본 발명에 따른 PMWS 관련 바이러스 유전자 양성 반응 및 유전형 검사용 올리고 유전자 칩을 나타낸 사진이다.

도 2는 본 발명에 따른 PMWS 관련　 바이러스의 유전자 양성 반응 및 유전형 검사용 올리고 유전자 칩의 탐침의 종류와 위치를 나타내는 모식도이다.

도 3은 본 발명에 따른 PMWS 관련 바이러스의 유전자 양성반응 및 유전형 검사용 올리고 유전자 칩 키트를 구성하고 있는 성분을 나타내고 있는 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 PMWS 관련 바이러스의 유전자 양성반응 및 유전형 검사용 올리고 유전자 칩의 사용 순서도이다.

　　　도 5는 PMWS 관련 바이러스의 양성 확인 및 유전형 검사를 하기 위한 종래기술과 본 발명의 관계를 나타내는 모식도이다.

본 발명은 올리고 유전자칩을 이용한 DNA 칩, 유전자 검사 진단키드에 관한 것으로, 특히 특정 올리고 DNA탐침을 이용하여 양돈산업에 막대한 피해를 주고 있는 PMWS에 대한 원인 바이러스 유전자를 신속하고 정확하게 진단해내므로써, 각 바이러스의 양성 확인 및 PRRSV 경우 유전형 및 백신주 구분, PCV2 유전형 구분을 한번에 검사 가능한 유전자 칩을 제공하는 올리고 유전자칩을 이용한 DNA 칩, 유전자 검사 진단키드에 관한것이다.

일반적으로 PMWS는 이유자돈부터 육성돈에 이르기까지 모든 돼지에게 나타날 수 있는 질환으로서 감염농장에 따라 5~50%의 감염율을 보이고 있다. PMWS에 감염된 이유자돈의 폐사율은 그리 높은 편은 아니지만, 이유 후부터 점진적인 체중감소를 동반하여 성장지연이 나타나게 되는데, 이러한 증상을 보인 개체의 경우 폐사율이 상대적으로 높아지는 양상을 보인다. 질병의 경과는 전신면역기능의 저하로 인해 소화기나 호흡기질병에 대한 방어기전이 제기능을 하지 못하게 되고 2차적인 감염체에 의해 위의 증상이 가속화되게 된다. 부검소견으로 전신의 임파절이 평상시의 3~4배로 종대되고 혼합감염원의 증상이 심화되어 발증한다.

또한, 상기와 같은 PMWS의 발생에 관여하는 병원체로는 PCV2가 가장 주된 원인이고, 그 외에도 PRRSV, PPV 등과 같은 바이러스 병원체 및 Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae 외 기타 등의 세균성 병원체가 알려져 있다. 그러나, PCV2에 감염된 모든 돼지가 전신소모성 증후군의 증상을 보이는 것은 아니고, 2차적인 감염이나 백신면역에 의한 면역세포의 활성화가 일어난 경우에는 증상의 정도가 심화되는 것이 보고되고 있다. 특히 백신면역에 의한 발증 은 세균성 불활화백신으로서 흉막폐렴, 마이코플라즈마성 폐렴백신에 주로 해당하는 것으로 알려져 있다.

더나아가, 상기 PCV2는 1991년 캐나다를 시작으로 미국, 프랑스, 스페인, 아일랜드, 덴마크, 영국, 독일 등 전세계적으로 발생하고 있고, 아시아지역에서는 국내를 비롯한 일본과 대만에서도 발생이 확인된 원형의 외가닥 DNA 바이러스로서, 서코비리데(Circoviridae)에 속한다. PCV2는 1974년 돼지 신장 세포에서 발견된 비병원성의 PCV1과 달리 감염에 의해 PMWS를 유발하는 원인체중 하나인 것으로 알려져 있으며 소독제, 유기용매, 열에 강한 저항성을 갖고 있어 양돈장에 오염되면 근절하기 힘든 바이러스이다. 국내에는 1998년에 최초로 보고되어 1999년에는 전국에 산재한 것이 확인되었다. 국내 감염형인 경우 6~12주령의 돼지에서 발생하였으며 폐사율은 극히 낮아 평균 1~5%에 달한다. 하지만 위생관리가 열악한 농장의 경우 20%이상의 폐사율을 보이기도 하였으며 80%이상의 발증돈은 타 질병의 원인체와 혼합감염양상을 보였다. 혼합감염되는 경우 체중감소, 위축, 호흡곤란, 기침, 폐렴, 설사, 청색증, 신경증상 등의 임상증상을 보이면서 20%이상 폐사가 나타난다.

여기서, 상기 PRRSV는 아터리비리데(arteriviridae)에 속하는 바이러스로서 열에 약해 쉽게 불활화되며 유기용매에 사멸하기 때문에 외부환경에 노출되면 쉽게 사멸하지만 근절하기 힘들며 대륙간 항원적, 유전적인 변이가 뚜렷한 바이러스로 알려져 있다. 크게 폐렴양상을 보이는 호흡기형과 유사산 및 이유자돈의 폐사와 같은 생식기형으로 구분되지만 최근에는 동시에 발증하는 양상을 보인다. 감염경로는 농장간 돼지의 이동이나 사람, 차량의 이동으로 인한 직접감염이 성립하며 농장내 에서 돼지간 접촉감염, 경구나 호흡기를 통한 지속적인 순환감염이 의심되고 있다. 또한 종돈의 정액을 통한 교미 및 인공수정에 의한 감염도 이뤄지고 있다. 감염된 돼지는 항체의 보유와 상관하지 않고 약 100일간 바이러스를 지속적으로 배출하는 양상을 갖는다. PRRS바이러스는 전세계적으로 널리 분포하여 돼지에 질병을 일으키는 바이러스로서, 1980년대 후반 국내에 유입하였을 것으로 추정된다. 상기 바이러스에 대한 분리는 1993년 보고되었다. 최근 국내 항체양성돈 보유실태를 양돈장규모로 확인한 결과 약 60%정도의 농장이 PRRS바이러스에 감염되어 있었고, 각 농장별 감염정도는 5~90%로 다양하게 감염양상이 나타났으며 전국 개체에 대한 항체 양성돈 보유정도는 약 21%정도가 감염되어 있는 것으로 확인되었다. 감염된 모돈에서 유사산, 허약자돈의 분만, 호흡곤란 및 신경증상 등이 나타났다.

최근 국내의 PRRS바이러스의 감염양상은 준임상형 PRRS바이러스의 지속감염을 통한 질병확산이 일어나고 있으며 임상증상과 피해정도가 불명확한 실태이다.

세균성 병원체가 근절된 유럽의 경우 PMWS에 관여하는 주요한 원인체로 PCV2와 PPV로 확인되었지만, 국내에서는 PCV2와 PRRSV가 PMWS에 관여하는 주요 원인체인 것으로 보고되고 있다(대한민국 특허 출원 10-2004-0068570 참고).

　　　　　　한편, 한국에서 사용하는 PMWS의 검사 방법은 임상증상, 병리조직 소견, PCV2 검출 3가지 방법이 모두 만족되었을 때 PMWS라고 명하지만, 앞에서 언급하였듯이 PRRSV와 PPV 그리고 다른 요인을 무시할 수는 없는 실정이다.

　　　　　　더나아가, 상기 PMWS 유발 바이러스 원인체 중 주요 원인체로 알려져 있는 PCV2, PRRSV, PPV에 대해 동시에 검사하면서 각 바이러스에 대한 유전정보를 좀 더 쉽고 신속하게 1회에 얻을 수 있는 진단시스템 개발이 요구하고 있고, 또한 상기와 같은 유전자 칩은 유전자형 및 유전자 변이 해석을 단시간에 대량으로 해주는 도구로서 근래에 그 중요성이 증가하고 있다. 유전자 칩은 약물 관련 유전자 탐색, 기타 유용 유전자의 대량 스크린에 활용되어 생체의 유전자 정보 대량 검출용으로 사용되어 왔으며 최근에는 암 관련 바이러스 조기검출 및 사스바이러스 검색 등 질병 조기진단 기술로 개발되고 있으며, 대표적인 상용화 유전자칩으로 KFDA의 승인을 받은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) 유전자칩을 들 수 있다(대한민국 특허 등록,KR 10-0382703, KR 10-0437626).

그러나, 상기와 같은 종래 PMWS 의심 시료에 대한 기존의 검사 방법은 PCV2, PRRSV, PPV 및 관련 바이러스에 대하여 각각 형광항체검사법, 면역조직화학염색법, PCR기법 등을 통하여 검사하고 바이러스의 유전자형을 구분하기 위해 유전자 염기서열 분석을 진행하여 유전형을 결정하였는데, 이러한 방법들은 적은 인력으로 많은 원인체를 검사하는데 한계가 있으며 많은 비용과 시간이 소요되는 문제점이 있었다.

이에 본 발명은 상기와 같은 제반 문제점을 해결하기위해 발명된 것으로, 특정 올리고 DNA탐침을 이용하여 양돈산업에 막대한 피해를 주고 있는 PMWS에 대한 원인 바이러스 유전자를 신속하고 정확하게 진단해내므로써, 각 바이러스의 양성 확인 및 PRRSV 경우 유전형 및 백신주 구분, PCV2 유전형 구분을 한번에 검사 가능한 유전자 칩을 제공하는 올리고 유전자칩을 이용한 DNA 칩, 유전자 검사 진단키드를 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 칩 기술 중, 특히 구아닌 인식 슬라이드를 이용하여 고정화되는 탐침 간의 거리를 조절하면서 밀집되게 고정화하는 기술과 탐침의 합성 구조 개발로 목표유전자와의 반응성을 높여 소량의 DNA도 검출할 수 있는 감도 좋은 유전자 칩을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 동일 시료를 사용하여 PMWS 관련 바이러스성 원인체인 PRRSV, PCV2, PPV의 유전자 검출과 PRRSV 백신주 구분 및 각 바이러스의 유전형을 동시에 진단할 수 있는 검사방법을 제공하는데 있다.

더나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 PRRSV의 백신주를 구분하는 기술은 유전자 칩 개발에 있어서 구분하기 매우 어려운 기술로 알려져 있는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 수준으로 백신주를 깨끗하게 구분하는 기술을 제공하는데 있다.

본 발명의 특징은 올리고 유전자 탐침의 염기서열 구조 내에 하기 표 2과 같은 목표 유전자 영역을 갖는 하기 표1 의 올리고 유전자 탐침의 염기서열 구조를 1종 이상을 포함하는 DNA 칩을 제공한다.

[표 1] 올리고유전자 탐침의 염기서열 구조

탐침명	염기서열 구조(5`-3`)	서열번호
1	5`-GGGGGGGGGCGCTGAAACTYTGGTTAYAGGGGTTGCC-3`	서열번호 1
2	5`-GGGGGGGGGTTTATGACAGAAGTCATCTAAGGACG-3`	서열번호 2
3	5`-GGGGGGGGGTTTAAGCACCTTTTGTGGAGCCG-3`	서열번호 3
4	5`-GGGGGGGGGTTTAAGCACCTTTTCTGGAGCCG-3`	서열번호 4
5	5`-GGGGGGGGGTTTGCTCAGCCGAAGTCCTCGTCAAGGG-3`	서열번호 5
6	5`-GGGGGGGGGAAATAGGCCTCCCATTGCTCAGCCGAAG-3`	서열번호 6
7	5`-GGGGGGGGGAAATGTGCGGCGATAGGATCGTTGC-3`	서열번호 7
8	5`-GGGGGGGGGAAAGGGCGTATATCATTATAGGTGTG-3`	서열번호 8
9	5`-GGGGGGGGGAAAACCACGTAGGCCTCGGCACTGC-3`	서열번호 9
10	5`-GGGGGGGGGAAAGTAAACTACTCCTCCCGCCATAC-3`	서열번호 10
11	5`-GGGGGGGGGAAACGCCATACAATCCCCCAACCCTTC -3`	서열번호 11
12	5`-GGGGGGGGGAAACCCCAAACCTGTCCTAGATTC-3`	서열번호 12
13	5`-GGGGGGGGGTTTGTGTAGAACATAATGTCACTGTG-3`	서열번호 13
14	5`-GGGGGGGGGTTTCTTAGAAGATGAATTGGTACTGC-3`	서열번호 14

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염기 중 Y = C,T를 의미하며, 본 기술 분야의 전문가들에게 널리 알려져 있음.

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[표 2] 탐침 내 목표유전자 영역과 이의 반전 염기서열.

탐침명	목표 유전자 염기서열 (5`-3`)	목표 유전자의 반전 염기서열(5`-3`)
1	5`-CGCTGAAACTYTGGTTAYAGGGGTTGCC-3`	3`-GCGACTTTGARACCAATRTCCCCAACGG-5`
2	5`-ATGACAGAAGTCATCTAAGGACG-3`	3`-TACTGTCTTCAGTAGATTCCTGC-5`
3	5`-AAGCACCTTTTGTGGAGCCG-3`	3`- TTCGTGGAAAACACCTCGGC-5`
4	5`-AAGCACCTTTTCTGGAGCCG-3`	3`-TTCGTGGAAAAGACCTCGGC-5`
5	5`-GCTCAGCCGAAGTCCTCGTCAAGGG-3`	3`-CGAGTCGGCTTCAGGAGCAGTTCCC-5`
6	5`-TAGGCCTCCCATTGCTCAGCCGAAG-3`	3`-ATCCGGAGGGTAACGAGTCGGCTTC-5`
7	5`-TGTGCGGCGATAGGATCGTTGC-3`	3`- ACACGCCGCTATCCTAGCAACG-5`
8	5`-GGGCGTATATCATTATAGGTGTG-3`	3`-CCCGCATATAGTAATATCCACAC-5`
9	5`-ACCACGTAGGCCTCGGCACTGC-3`	3`-TGGTGCATCCGGAGCCGTGACG-5`
10	5`-GTAAACTACTCCTCCCGCCATAC-3`	3`-CATTTGATGAGGAGGGCGGTATG-5`
11	5`-CGCCATACAATCCCCCAACCCTTC -3`	3`-GCGGTATGTTAGGGGGTTGGGAAG-5`
12	5`-CCCCAAACCTGTCCTAGATTC-3`	3`-GGGGTTTGGACAGGATCTAAG-5`
13	5`-GTGTAGAACATAATGTCACTGTG-3`	3`-CACATCTTGTATTACAGTGACAC-5`
14	5`-CTTAGAAGATGAATTGGTACTGC-3`	3`-GAATCTTCTACTTAACCATGACG-5`

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염기 중 R = A,G ,Y = C,T를 의미하며, 본 기술 분야의 전문가들에게 널리 알려져 있음.

본 발명은 올리고유전자 탐침의 염기서열 구조 내에 표 2의 목표 유전자 영역을 갖는 표1 의 올리고 유전자 탐침의 염기서열 구조를 1종 이상 포함하는 DNA 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 염기서열 구조 내에 목표유전자 영역의 탐침을 포함하는 DNA 칩을 제공하고, 표 2와 같은 탐침 내의 목표유전자 영역의 반전 염기로 탐침을 포함하는 DNA 칩을 제공하며, 표2와 같은 탐침 내의 목표유전자 영역 또는 그 반전 염기를 PNA(Peptide nucleic acid) 또는 LNA(Locked nucleic acid)로 치환된 서열로 설계된 탐침을 포함하는 DNA 칩을 제공한다.

한편, 본 발명은 형광 다이(dye)가 부착된 특정 프라이머와 반응하도록 만든 DNA 칩 반응 콘트롤(positive Control) 탐침을 포함하는 DNA 칩을 제공하고, 상기 DAN칩 반응 콘트롤 탐침의 반응 유무로 시료와의 반응 조건이 올바른 지를 확인하고, 상기 DNA 칩 반응 콘트롤을 기준으로 DNA 탐침의 위치 및 다른 양성 탐침의 기준을 알려준다.

또한, 본 발명은 구아닌인식 DNA 칩 기판을 이용한 PMWS 관련 바이러스 PRRSV, PCV2, PPV의 유전자를 동시에 또는 개별로 확인하는 유전자 칩을 제공하는 한편, 본 발명은 증폭수단이 표3의 복합 역전사중합효소연쇄반응 또는 복합 중합효소연쇄반응 프라이머 염기서열에서 역전사중합효소연쇄반응에 사용되는 각 프라이머인 것을 특징으로 하는 PMWS 관련 바이러스 PRRSV, PCV2, PPV 유전자 검사 진단키트도 제공한다.

본 발명은 돼지 혈청 또는 혈액으로부터 RNA를 추출하여 이를 Multiplex RT-PCR(이하, 'MP RT-PCR' 이라함) 또는 Multiplex PCR (이하, 'MP PCR' 라 함)을 이용하여 증폭하는 단계, 증폭된 각 바이러스의 유전자를 올리고 유전자 칩에 교잡 반응시키는 단계 및 상기 반응에서 특이적으로 결합된 바이러스들의 유전정보를 확인하는 단계를 포함하는 PMWS 관련 원인 바이러스의 정보 검사방법을 제공한다.

상기 PMWS 관련 바이러스 PRRSV, PCV2, PPV 유전자 검사 진단키트는 포워드(forward) 프라이머 또는 리버스(reverse) 프라이머의 5` 말단 위치에 Cy3를 부착시키는 것을 특징으로 하고, 상기 Cy3이외에 Cy5, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 부착시킬 수도 있다.

또한, 본 발명은 PMWS 관련 바이러스의 양성 확인 및 유전형 검사 올리고염기 칩의　 탐침의 종류와 위치는 도2에 도시된 형태인 것을 특징으로 하고, PRRSV 바이러스의 백신주 유전자 검사와 유전형을 동시에 검사하고, PCV2 바이러스의 유전형을 검사하는 것을 특징으로 하는 유전자 칩을 제공한다.

[표 1] 올리고유전자 탐침의 염기서열 구조

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[표 2] 탐침 내 목표유전자 영역과 이의 반전 염기

염기 중 R은 A, G를, Y는 C, T를 의미하며, 본 기술 분야의 전문가들에게 널리 알려져 있음.

삭제

[표 3] 복합 역전사 중합효소 연쇄반응 프라이머 염기서열

프라이머 이름	염기서열 (5`-3`)	서열번호
PR_NA-F (Cy3)	5`-CAAGAGAGTRGTGCTTGARGGTTC-3`	서열번호 15
15PR_NA-R	5`-TTCCAGGTTTCTATGGCYGA-3`	서열번호 16
PR_EU-F (Cy3)	5`-GTCGTCCTCGAAGGGGTTAAAGC-3`	서열번호 17
PR_EU-R	5`-CGGCCWAGGCAACACAATCT-3`	서열번호 18
PC-F (Cy3)	5`-CACGGATATTGTAKTCCTGGTCG-3`	서열번호 19
PC-R	5`-CGCACCTTCGGATATACTG-3`	서열번호 20
PP-F (Cy3)	5`-CATACACTGGACAATCACAACAAA-3`	서열번호 21
PP-R	5`-GCCTAATTGCTGTTGCTTCTG-3`	서열번호 22
HC (Cy3)	5`-GTCGTCGTCGTCTCTGCTGCG-3`	서열번호 23

PR_NA-F,PR_EU-F,PC-F,PP-F 프라이머의 5`에 Cy3 형광물질 부착하여 합성

염기 중 R= A,G, W=A,T, K=G,T, Y = C,T 를 의미하며, 본 기술 분야의 전문가들에게 널리 알려져 있음.

본 발명에 있어서, 상기의 RNA추출에 사용된 시약은 Qiagen사의 RNeasy Mini Kit을 이용해 사용자 매뉴얼에 따라 RNA를 추출하며, PRRSV 북미주(NA)ORF6 영역 334bp, PRRSV 유럽주(EU) ORF6 영역 367bp를 MP RT-PCR, PCV2 ORF2영역 493bp, PPV VP2 영역 330bp를 MP PCR을 시행한다. 이때 복합 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용된 효소와 반응액은 Qiagen Onestep RT-PCR 키트를 사용하였고 프라이머의 5` 말단에 Cy3를 부착하여 올리고 유전자 칩과의 교잡반응 후 반응 유무를 확인할 수 있게 한다.

본 발명에 있어서, 상기 복합 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용되는 PMWS 관련 바이러스 증폭 프라이머 서열은 상기 표 3에 기재하였으며, 상기의 올리고 유전자 칩을 구성하는 유전자형 탐침은 상기 표 1인 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명에 사용된 탐침을 고정화하는 유리 슬라이드는 (주)바이오메트릭스테크놀로지의 구아닌인식용 유리 슬라이드를 사용하였으며, 이는 탐침 중 연속되는 구아닌 염기가 있는 영역을 선택적으로 분자 인식하여 유전자를 일정거리를 두고 밀집되게 고정화시키는 획기적인 기술이다.

본 발명에 있어서, 상기의 RNA추출에 사용된 시약은 Qiagen사의 RNeasy Mini Kit을 이용하고, 사용자 매뉴얼에 따라 RNA를 추출하며, PRRSV 북미주(NA)ORF6 영역 334bp, PRRSV 유럽주(EU) ORF6 영역 367bp를 MP RT-PCR, PCV2 ORF2영역 493bp, PPV VP2 영역 330bp를 MP PCR을 시행한다. 이 때 복합 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용된 효소와 반응액은 Qiagen Onestep RT-PCR 키트를 사용하였고, 프라이머의 5` 말단에 Cy3를 부착하여 올리고 유전자 칩과의 교잡반응 후 반응 유무를 확인할 수 있게 하였다.

(실시예)

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1.올리고유전자 칩의 제작

올리고유전자 칩 제작은 (주)바이오메트릭스 테크놀로지의 구아닌인식용 유리슬라이드에 제조사의 제공 매뉴얼에 따라 탐침을 고정화하였다.

(1) PMWS 관련 바이러스의 올리고 유전자 탐침의 합성

PMWS 관련 바이러스 검출을 위하여 사용된 각 바이러스의 유전정보에 특이적 올리고 유전자 탐침은 5`말단에 연속되는 9개의 구아닌기를 유도하여 합성한다.

탐침의 구조는 크게 3가지 영역으로 나누어지며, 구아닌인식 슬라이드에 고정화되는 영역, 목표유전자와 반응하는 영역 그리고 이 두 영역을 연결하며 일정한 공간을 만들어주는 영역으로 나누어지며, 공간을 만들어주는 영역은 경우에 따라 생략 가능한 영역이다. 표1의 탐침 2를 예로 들면 슬라이드에 고정화 될 영역 GGGGGGGGG, 공간을 만들어주는 영역 TTT, 목표유전자와 반응하는 영역 ATGACAGAAGTCATCTAAGGACG 을 예로 들 수 있으며, 이는 여기에 국한 되지 않고 모든 탐침 설계에 적용되는 기술이며, 또한 구아닌의 연속되는 숫자는 9개에 국한되지 않으며, 5 ~ 15 범위에서도 가능하고, 공간을 만들어주는 영역은 A,T,C중 어떤 염기든 제한을 두지 않으며, 서열 순서에도 제한을 두지 않으며, 염기숫자 또한 0 ~ 12 정도로 제한을 두지 않는다. 또한 목표유전자는 표1의 염기서열 전체 또는 일부를 포함하는 서열로 제한을 둔다. 표1의 탐침 중 C1 은 칩과 PCR 결과물과의 반응 시 교잡할 수 있는 탐침으로 이에 상보적인 Cy3 labeled primer가 PCR 시약에 포함되어 있어 증폭 유무와 상관없이 증폭 결과와 교잡반응을 하면 항상 양성으로 나오 는 양성대조이다. 이는 두 가지 역할을 할 수 있는데, 첫째는 칩 분석 시 전체 탐침들의 기준을 잡을 수 있는 것이고, 둘째는 교잡반응이 잘못 되었을 때 이 탐침을 대조군으로 결과를 분석 할 수 있는 것이다. 또한, C2 탐침은 칩 교잡 반응 시 비특이적으로 붙는 것을 확인하기 위한 음성대조이다.

(2) PMWS 관련 바이러스 올리고 유전자 탐침의 고정

　올리고 유전자 탐침은 (주)바이오메트릭스테크놀로지의 구아닌인식용 유리슬라이드에 제조사의 매뉴얼에 따라 고정화하였다

2. 표본 채취 및 RNA 추출

(1) PMWS 관련 바이러스 검체

PMWS 관련 바이러스 검체 샘플은 국립수의과학검역원으로부터 제공 받았으며, 시료는 전혈,　 조직 및 바이러스 배양액 형태의 샘플로 보관되어 있었다. 검체 RNA 또는 DNA의 추출은 검역원내에서 행하였다. RNA와 DNA는 Qiagne사의 RNeasy mini kit 을 이용하여 정해진 매뉴얼에 따라 추출하였다.

3. 올리고유전자칩을 이용한 PMWS 관련 바이러스 유전자 검사

(1) 복합 역전사중합효소연쇄반응(MP RT-PCR)과 복합 중합효소연쇄반응(MP PCR)

PMWS 관련 바이러스 중 PRRSV 유전자 증폭을 위한 MP RT-PCR에 사용한 프라이머는 PR_NA-F(Cy3 labeled)와　 PR_NA-R, PR_EU-F(Cy3 labeled), PR_EU-R (상기 표3)를 사용하며 증폭된 시퀀스의 길이는 PRRSV 북미주 334bp, PRRSV 유럽주 367bp로 한다.

MP RT-PCR은 다음과 같은 방법으로 시행한다. Qiagen사의 OneStep RT-PCR Kit를 사용하여 정해진 매뉴얼에 따라 최종 부피 25ul의 반응혼합물 용액을 만든다. 이때 사용한 프라이머의 양은 반응용액 25 ul에 각 10 pmol을 사용하며, DNA 칩 반응 대조 프라이머 HC를 적당량 넣어준다. PCR 서머싸이클러(thermocycler, Biometra)에서 50도로 30분간 RNA를 DNA로 합성(역전사: Reverse transcription)한 뒤, 95도로 15분간 초기 PCR 활성단계(Initial PCR activation step)를 거치고, 94도로 20초간 변성(denaturation)하고, 55도로 20초간 초기 어닐링(primer annealing)하고, 72도로 30초간 확장(extension)과정을 35회 반복하여 DNA를 증폭한다.

PMWS 관련 바이러스 중 DNA 바이러스인 PCV2 와 PPV 유전자 증폭을 위한 MP PCR에 사용한 프라이머는 PC-F(Cy3 labeled)와　PC-R, PP-F(Cy3 labeled), PP-R (표3)를 사용하며 증폭된 시퀀스의 길이는 PCV2 493bp, PPV 330bp로 한다.

MP PCR은 다음과 같은 방법으로 시행한다. Qiagen 사의 Taq DNA Polymerase 키트를 사용하여 정해진 매뉴얼에 따라 최종 부피 25ul의 반응혼합물 용액을 만든다. 이때 사용한 프라이머의 양은 반응용액 25ul에 각 10pmol을 사용하며, DNA Chip 반응 대조 프라이머 HC 를 적당량 넣어준다. PCR 서머싸이클러(thermocycler, Biometra)에서 94도로 1분간 초기 PCR 활성단계(Initial PCR activation step)를 거치고, 94도로 20초간 변성(denaturation), 55도로 20초간 초기 어닐링(primer annealing), 72도로 30초 확장(extension)과정을 35회 반복하여 DNA를 증폭한다.

증폭한 결과물 용액 중 10ul의 시료를 취하여 로딩 다이(loading dye)와 섞은 뒤 1.5% 한천 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 1ug/ml 농도의 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide, Sigma)용액에서 15분간 염색한 후, 자외선 하에서 DNA크기를 확인한다.

(2) 교잡반응(hybridization)

올리고 유전자 탐침이 고정화된 칩 기판에 증폭된 PMWS 관련 바이러스의 유전자를 교잡반응을 실시한다. 교잡반응실(hybridization reaction chamber)로 50ul 용량의 고무 웰 플레이트를 사용한다.

고무 웰 플레이트가 부착된 칩기판 위에 교잡용액(saline-sodium citrate:SSC, SDS, formamide) 40ul와 MP RT-PCR 증폭 산물 10ul를 혼합하여 뿌려준다. 고무 웰 플레이트 위를 플레이트 실러(plate sealer)를 사용하여 밀봉하여 용액의 증발을 막은 뒤 인큐베이터(40도 ~ 55도)에서 1~2 시간 반응한다.

교잡반응이 끝난 후 고무 웰 플레이트와 플레이트 실러를 제거하고, Wash 1(SSC,SDS)용액 45 ~ 25도에서 2분간 세척 후 다시 Wash 2(SSC) 용액으로 2분간 세척하여 준 뒤 칩 슬라이드를 건조시킨 후 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, PerkinElmer Scane Array Express HT)를 이용하여 형광신호를 분석하였다(excitation　 550nm, emission 570nm). 분석한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

(3) PMWS 관련 바이러스 올리고 유전자칩의 해석

PMWS 관련 바이러스 올리고 유전자 칩의 탐침에 대한 유전자지도는 도2와 같으며 칩에 증폭된 유전자를 중합 반응시킨 후 결과를 판독한다. 우선 교잡반응이 온전한지 대조 탐침 C1(양성 대조),C2(음성대조)를 확인한 뒤 반응이 온전하면 다음과 같이 판독한다. 아래에 기재된 표 4를 참조하면, 탐침 1 ~ 4 중 한개라도 양성으로 나오면 PRRSV 북미주 양성으로 판정하며(시료명 1, 2, 4, 5 및 6), 5 ~ 8 중 한개라도 양성으로 나오면 PRRSV 유럽주 양성으로 판정한다(시료명 3).　 그 중 탐침 1, 2, 4 가 모두 반응하며, 3이 반응하지 않거나 1, 2, 3, 4 모두 반응하며 그 반응성이 4 > 3 이면 PRRSV 백신주로 판정한다(시료명 2). 탐침 9 또는 10이 반응하면 PCV2 양성으로 판정하며(시료명 7, 8, 9 및 11), 탐침 9, 10, 11 만이 반응하면 PCV2 genotype 1(시료명 7), 탐침 9, 10, 12만이 반응하면 PCV2 genotype 2(시료명 8), 탐침 10, 11만이 반응하면 PCV2-genotype 3(시료명 9)로 판정한다. 탐침 13, 14 중 하나라도 반응하면 PPV 양성으로 판독한다(시료명 10 및 11).

[표 4] 올리고유전자칩에 의해 확인된 PMWS 관련 바이러스 유전자의 유전형 및 위치

여기서, 본 발명에 의하면, 바이러스와 특이적으로 반응하는 탐침을 합성하여 탐침과의 반응 결과의 조합으로부터 바이러스 감염 양성 또는 음성을 확인하고, PRRSV 백신주 구분 및 유전형 구분을 가능하게 한다. 특히, 백신주 구분 해당 탐침은 그 특이도가 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 수준이어서 구분하기 힘든 기술로 알려져 있으나, 본 발명에서는 정확하게 구분할 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명은 돼지의 혈액 또는 조직에 존재하는 바이러스 유전자의 검출 및 유전자형을 높은 특이도로 검사할 수 있으며, 기존 검사 방법으로는 여러 단계로 각각 시험하여 확인해야 했던 검사를 한번의 검사로 돼지 써코바이러스 2형(PCV2), 돼지 생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV), 돼지 파보바이러스(PPV)의 유전자 진단정보의 획득이 가능하여 신속하고 저렴하게 검사를 진행할 수 있다.

또한, 종래의 진단 시스템으로 여러 단계의 시험들을 진행하여 많은 시간이 소요되던 검사와는 달리, 본 발명은 샘플 채취 후 분리, 증폭, 유전자 칩 검사까지 약 4시간 내로 신속하게 검사할 수 있어 산업적으로 매우 유용한 검사시스템을 제공한다.

<110> korea biometrics technology jenobiotec <120> DNA CHIP, GENE ANALYSYS TEST KIT AND GENE INFORMATION TEST METHOD USING OLIGO-GENE CHIP <140> 10-2007-0029305 <141> 2007-03-26 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 1 gggggggggc gctgaaacty tggttayagg gttgcc 36 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 2 gggggggggt ttatgacaga agtcatctaa ggacg 35 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 3 gggggggggt ttaagcacct ttgtggagcc g 31 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 4 gggggggggt ttaagcacct tttctggagc cg 32 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 5 gggggggggt ttgctcagcc gaagtcctcg tcaaggg 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 6 ggggggggga aataggcctc ccattgctca gccgaag 37 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 7 ggggggggga aatgtgcggc gataggatcg ttgc 34 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 8 ggggggggga aagggcgtat atcattatag gtgtg 35 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 9 ggggggggga aaccacgtag gcctcggcac tgc 33 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 10 ggggggggga aagtaaacta ctcctcccgc catac 35 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 11 ggggggggga aacgccatac aatcccccaa cccttc 36 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 12 ggggggggga aaccccaaac ctgtcctaga ttc 33 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 13 gggggggggt ttgtgtagaa cataatgtca ctgtg 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> postweaning multisystemic wasting syndrome <400> 14 gggggggggt ttcttagaag atgaattggt actgc 35 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> PR NA-F(Cy3) <400> 15 caagagagtr gtgcttgarg gttc 24 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> PR NA-R <400> 16 ttccaggttt ctatggcyga 20 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> PR EU-F(Cy3) <400> 17 gtcgtcctcg aaggggttaa agc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> PR EU-R <400> 18 cggccwaggc aacacaatct 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> PC-F(Cy3) <400> 19 cacggatatt gtaktcctgg tcg 23 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> PC-R <400> 20 cgcaccttcg gatatactg 19 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> PP-F(Cy3) <400> 21 catacactgg acaatcacaa caaa 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> PP-R <400> 22 gcctaattgc tgttgcttct g 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> HC(Cy3) <400> 23 gtcgtcgtcg tctctgctgc g 21

Claims

올리고 유전자 탐침의 염기서열 구조 내에 하기 표 2와 같은 목표 유전자 영역을 갖는 하기 표 1의 올리고 유전자 탐침의 염기서열 중 선택된 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.

표 1. 올리고유전자 탐침의 염기서열 구조

표 2. 탐침 내 목표유전자 영역과 이의 반전 염기

염기 중 R은 A, G를 의미하고, Y는 C, T를 의미하며, 본 기술 분야의 전문가들에게 널리 알려져 있음.

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제1항에 있어서, 상기 유전자 탐침의 염기서열은 상기 표 2에 기재된 상기 목표유전자의 반전 염기서열 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA칩.
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하기 표 1의 서열번호 1 내지 8은 PRRSV, 서열번호 9 내지 12는 PCV2, 서열번호 13 내지 14는 PPV 반응 탐침으로 사용하여 PMWS 관련 바이러스 PRRSV, PCV2, PPV의 유전자를 동시에 확인하는 것을 특징으로 하는 DNA칩.

표 1. 올리고유전자 탐침의 염기서열 구조

증폭수단이 하기 표 3의 복합 역전사중합효소연쇄반응 또는 복합 중합효소연쇄반응 프라이머 염기서열에서 서열번호 15, 16, 17, 18을 사용하여 PRRSV 복합 역전사 중합 효소 연쇄 반응, 서열번호 19, 20, 21, 22를 사용하여 PCV2/PPV 복합 중합효소연쇄 반응으로 선택적으로 사용되는 각 프라이머인 것을 특징으로 하는 PMWS 관련 바이러스 PRRSV, PCV2, PPV 유전자 검사 진단키트.

표 3. 복합 역전사 중합효소 연쇄반응 프라이머 염기서열

염기 중 R은 A, G를, W는 A, T를, K는 C, T를 의미하고, 본 기술 분야의 전문가들에게 널리 알려져 있음.

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제10항에 있어서,

상기 Cy3 대신에 DNA 칩에서 반응하여 확인할 수 있는 Cy5, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 부착시키는 것을 특징으로 하는 PMWS 관련 바이러스 PRRSV, PCV2, PPV 유전자 검사 진단키트.
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하기 표 1의 서열번호 3과 서열번호 4의 반응으로부터 PRRSV 바이러스의 백신주 유전자 검사와 서열번호 1, 2, 3, 4 반응으로부터 북미 유전형과 서열번호 5, 6, 7, 8 반응으로부터 유럽 유전형을 동시에 검사하는 것을 특징으로 하는 유전자 칩.

표 1. 올리고유전자 탐침의 염기서열 구조

제13항에 있어서,

상기 표 1의 서열번호 9, 10, 11, 12 반응 양상으로부터 PCV2 바이러스의 유전형을 검사하는 것을 특징으로 하는 유전자 칩.
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