KR100904772B1 - 유전자칩, 이를 이용한 돼지콜레라 바이러스 또는소바이러스성설사증 바이러스 유전자의 검사방법 및 그를포함하는 진단키트 - Google Patents
유전자칩, 이를 이용한 돼지콜레라 바이러스 또는소바이러스성설사증 바이러스 유전자의 검사방법 및 그를포함하는 진단키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돼지콜레라 바이러스(Hog cholera virus; HCV 또는 Classical swine fever virus; CSFV)와 소바이러스성설사증 바이러스(Bovine viral diarrhea virus; BVDV) 유전자 및 이들 유전자형을 검사하는 방법 및 이를 이용한 정밀검사키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) 방법과 유전자칩을 이용하여 동일한 페스티바이러스(Pestivirus)에 속하며 동물에 질병을 일으키는 돼지콜레라 바이러스(Hog cholera virus; HCV 또는 Classical swine fever virus; CSFV)와 소바이러스성설사증 바이러스(Bovine viral diarrhea virus; BVDV) 유전자 및 이들 유전자형을 검사하는 방법, 및 이를 이용한 정밀한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 발명을 이용하여 돼지 및 소 혈액 또는 조직에 존재하는 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사증 바이러스를 높은 특이성으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 동시에 유전자형도 감별할 수 있다. 또한, 기존 검사 방법으로는 여러 단계를 거쳐 시험하여 확인했던 검사 과정을 한 번의 검사 과정으로 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자 및 이의 유전형까지 신속 정확하게 감별할 수 있으므로 매우 경제적이다.
돼지콜레라, 돼지콜레라 바이러스, 소바이러스성설사증, 소바이러스성설사증 바이러스, Multiplex RT-PCR, 유전자칩, 유전자칩 검사법, 동물용 유전자칩, 구아닌칩, SNP.
Description
도 1은 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자의 양성 반응 및 유전형 검사용 올리고 유전자칩을 나타낸 사진이다.
도 2는 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자 양성 반응 및 유전형 검사용 올리고 유전자칩에 사용된 탐침의 종류와 위치를 나타낸 모식도이다.
도 3은 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자 양성반응 및 유전형 검사용 올리고 유전자칩의 사용순서를 나타낸 순서도이다.
도 4는 돼지콜레라 바이러스의 양성 반응 및 유전형 검사를 위한 방법에서 종래 방법과 본 발명의 방법을 비교한 모식도이다.
본 발명은 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)과 유전자칩을 이용하여 동일한 페스티바이러스에 속하며 동물에 질병을 일으키는 돼지콜레라바이러스(Hog cholera virus, HCV. Classical swine fever virus, CSFV)와 소바이러스성설사증 바이러스(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)의 유전자 및 이의 유전자형을 검사하기 위한 방법, 및 이를 이용한 유전자 진단키트에 관한 것으로, 돼지 및 소의 혈액 또는 조직에 존재하는 바이러스 유전자 및 이의 유전자형을 높은 특이성으로 검사할 수 있으며, 기존의 검사 방법으로는 여러 단계에 걸쳐 시험하여 확인했던 검사 방법을 한 번의 검사 방법으로 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자를 신속하고 저렴하게 진단할 수 있다.
돼지콜레라는 돼지콜레라바이러스가 원인체로, 전염성이 높고, 폐사율 및 이환률이 매우 높으며, 감수성이 또한 높아 모든 연령의 돼지를 감염시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기 바이러스에 감염된 돼지는 일반적으로 고열, 피부발적, 식욕결핍, 변비, 설사, 백혈구 감소, 후구마비, 유사산 등과 같은 번식장애 등을 수반한다. 돼지콜레라 바이러스는 돼지에서만 감염되는 유일한 자연 숙주로서, 감염된 돼지와 감수성이 있는 돼지의 직접적인 접촉이 주된 전파 경로로 알려져 있다. 감염된 돼지는 질병으로 이환되기 전에 바이러스를 배출하기 시작하여 질병의 진행 기간 동안에도 지속적으로 바이러스를 배출한다. 또한, 상기 바이러스는 주로 경구, 비강, 눈물, 뇨, 분변으로 배출되며, 돼지콜레라 질병에서 회복된 돼지의 경우 에도 특이 항체가 형성될 때까지 바이러스를 지속적으로 배출하는 것으로 알려져 있다. 따라서 강한 균주 바이러스에 감염된 돼지는 10 내지 20일 동안 다량의 바이러스를 배출하고 약한 균주 바이러스에 감염은 바이러스 배출기가 매우 짧다. 그 결과, 강한 균주 CSFV는 돈군에서 급속도로 전파되어 높은 이환율을 나타낸다. 만성 감염된 돼지는 죽을 때까지 지속적으로 또는 간헐적으로 바이러스를 배출하고 약한 균주 바이러스에 감염된 임신 돼지는 초기에는 불현성을 나타내지만, 자궁내에서 태아에게 전파되어 사산 또는 허약한 자돈을 분만하는 등 여러 가지 증상을 나타내며, 출생한 자돈은 출생 후 곧 죽게 된다. 또한, CSFV는 태아에서 지속적으로 분비되기 때문에 분만 시 많은 양의 바이러스가 전파될 수 있다. 선천적으로 감염된 자돈이 건강한 경우에 몇 달 동안 생존할 수 있지만 그 감염이 인정되기는 힘들고, 또한 CSFV는 근절되기 전까지 수개월 동안 돈군에 지속적으로 질병을 전파한다. 일반적으로, 종돈장에서부터 전염되거나 많은 돼지들이 모이는 장소에서 오염매개체를 통해 새롭게 감염되어 다른 농장으로 전파된다. 우리나라에서는 제1종 법정 가축 전염병으로 분류되어 있으며, 국제수역사무국(OIE)에서는 목록 A(list A) 질병으로 분류되어 있다.
돼지콜레라는 1830년 미국에서 처음 발생한 이래 전 세계적으로 전파되었지만, 최근에는 박멸정책의 일환으로 미국, 캐나다, 영국, 아이슬란드, 아일랜드, 스칸디나비아 3국, 뉴질랜드, 호주 등에서는 돼지콜레라가 발생하지 않는 것으로 보고되고 있다. 또한 우리나라에서는 1947년 서울 근교농장에서 발생한 것이 공식적으로 보고되어 있고, 이후 돼지콜레라 순화 생독 바이러스인 LOM 균주에 의해 제조 된 생독 백신으로 예방 접종을 수행하고 있다.
기존의 돼지콜레라 진단 기술은 항원-항체 검사를 통해 의심되는 혈청에서 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 이용하여 상기 바이러스 유전자를 증폭함으로써 유전자 양성 유무를 확인하는 것이다. 그러나 상기 방법으로는 백신주와 야외주 바이러스를 구분할 수 없으므로 이를 다시 특정 염기에 대한 제한효소 처리를 하여 백신주/야외주를 분별 확인하고, 바이러스의 유전자형을 구분하기 위해 유전자 염기서열을 분석하여 유전형을 결정하였다. 그러나, 이러한 방법은 많은 비용과 시간이 소요되므로, 많은 질병을 검사하는데 한계가 있다.
또한 소바이러스성설사증 바이러스는 전 세계적으로 산재되어 있는 소바이러스성설사증의 원인체로, 설사에 의한 급성폐사 이외에도 임신한 소의 유산 또는 사산, 호흡 장애, 백혈병-유사 증상 등을 일으키며, 국내에서는 소 사육농가에 호흡기 질환 및 송아지 설사를 일으켜 심각한 피해를 주어, 사육농가에 엄청난 경제적 피해를 끼치고 있다.
아울러, 유전자칩은 약물 관련 유전자 탐색, 기타 유용 유전자의 대량 스크린에 활용되어 생체의 유전자 정보 대량 검출용으로 사용되어 왔으며 최근에는 암 관련 바이러스 조기검출 및 사스바이러스 검색 등 질병 조기진단 기술로 개발되고 있으며, 대표적인 상용화 유전자칩으로 대한민국 식품의약품안전청(KFDA)의 승인을 받은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) 유전자칩을 들 수 있다(대한민국 특허등록번호 제 KR 10-0382703 호 및 제 KR 10-0437626 호).
상기와 같은 유전자칩이 개발되어 있지만, 돼지콜레라와 소바이러스성설사증 바이러스는 분류학적으로 동일한 페스티바이러스에 속하여, 열악한 국내 가축 사육 환경으로 인해 돼지에서 종종 중복 감염되는 경우도 발견되며, 이는 호흡기 바이러스와의 유사성으로 인해 항원-항체 반응검사에서 돼지콜레라로 오인될 수 있다는 문제점을 갖는다.
따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해서는 동일한 시료를 사용하여 돼지콜레라 바이러스의 유전자 및 이의 유전형을 검사하기 위한 시료를 채취한 후 1일 이내 신속하게 돼지콜레라와 소바이러스성설사증 바이러스를 분별할 수 있는 진단시스템의 개발이 절실히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명자는 상기와 같은 돼지콜레라 바이러스 유전자를 신속하고 정확하게 진단하는 방법을 제공하기 위해 예의 연구한 결과, 특정 올리고 유전자 탐침을 이용하여 백신주/야외주 바이러스의 유전자 및 이의 유전형을 동시에 검사할 수 있는 유전자칩을 개발하였다. 통상의 돼지콜레라 바이러스의 검출방법은 적어도 1주일이 소요되었지만 본 발명에 따른 검출방법은 3 내지 4 시간 이내에 바이러스 유전자의 존재 여부, 백신주/야외주의 구분, 바이러스 유전자 및 이의 유전형을 동시에 신속하고 정확하게 판단할 수 있다. 또한 검사 과정의 간소화로 인해 검사 비용을 절감할 수 있어 매우 경제적이다.
본 발명의 목적은 동일한 시료를 사용하여 돼지콜레라 및 소바이러스성설사 증 바이러스의 유전자 및 이의 유전자형의 검출, 및 백신주/야외주의 구분을 동시에 진단할 수 있는 검사방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 유전자칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자칩을 포함하는 유전형 진단키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은,
돼지콜레라 유전자형을 검사하는 방법으로,
돼지 혈청 또는 혈액으로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 다중(Multiplex) 역전사 중합효소 연쇄반응(Multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)을 이용하여 증폭하는 단계;
상기 증폭된 돼지콜레라 유전자를 올리고 유전자칩에 교잡반응시키는 단계; 및
상기 교잡반응에서 특이적으로 결합된 돼지콜레라 유전자 및 이의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 유전자침을 이용한 돼지콜레라 유전자의 검사방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시로는, 서열번호: 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선 택된 1종 이상의 염기서열, 및 상기 서열번호: 1 내지 13의 10-mer 이상의 염기 상동성을 갖는 탐침(probe)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전방향 염기서열을 포함하며, 상기 전방향 염기서열 및 상기 전방향 염기서열 중 10-mer 이상의 염기 상동성을 갖는 탐침의 역방향 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 유전자칩을 제공한다.
이에 상기 염기서열 및 이의 역방향 염기서열이 펩타이드 헥산(Peptide nucleic acid: PNA) 또는 차단 헥산(Locked nucleic acid: LNA)으로 치환된 염기서열을 포함하는 탐침을 포함하고, 상기 염기서열은 5'-말단 위치에 형광염료가 부착되며, 상기 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴-결합물질, (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 형광염료가 부착된 상기 전방향 염기서열 또는 상기 역방향 염기서열과 반응하는 하이브리드화 대조군(Hybridization Control, 교잡반응) 탐침을 추가로 포함하는 유전자칩을 제공한다.
또한 상기 하이브리드화 대조군 탐침과의 반응 유무를 통해 시료와의 반응 조건이 정확한지 확인하고, 상기 하이브리드화 대조군 탐침을 기준으로 유전자 탐침의 위치를 알려주며, 구아닌 인식 유전자칩 기판을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하고, 서열번호: 14 내지 18로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자칩을 제공한다.
그리고 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스가 양성임을 확인하고 유전자형 검사 올리고 염기칩에 사용된 탐침의 종류와 위치를 확인하는데 사용되고, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자를 함께 검사하며, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 백신주 및/또는 야외주 바이러스 유전자 및 이의 유전자형을 동시에 검사하는 유전자칩을 제공한다.
본 발명의 다른 실시로, 상기에 따른 유전자칩을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하는 유전자칩을 포함하는 진단키트를 제공한다.
그리고 본 발명의 또 다른 실시로, 상기에 따른 유전자칩을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하는 유전자칩을 이용한 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사증 바이러스 유전자의 검사방법을 제공한다.
이와 같은 본 발명에 의하면, 돼지 혈청 또는 혈액으로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 다중(Multiplex) 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; 이하, MP RT-PCR이라함)을 이용하여 증 폭하는 단계; 상기 증폭된 돼지콜레라 유전자를 올리고 유전자칩에 교잡반응시키는 단계; 및 상기 교잡반응에서 특이적으로 결합된 돼지콜레라 유전자 및 이의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 것이다
상기 RNA 추출방법은 Qiagen사의 RNeasy Mini Kit에 포함된 사용자 매뉴얼에 따라 RNA를 추출하는 것이 바람직하며, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 경우에 5'-NTR 영역의 422bp를 MP RT-PCR로 증폭할 수 있다. 이때, 복합 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용된 효소와 반응액은 Qiagen Onestep RT-PCR 키드에 포함된 것을 사용하였으며, 프라이머의 5'-말단에 Cy3를 부착하여 올리고 유전자칩과의 교잡 반응을 수행한 후 반응 유무를 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 표 1의 서열번호 1 내지 13에서 고정화 염기서열인 9개의 구아닌(GGGGGGGGG)과 공간 확보를 위한 염기서열인 티민(TTT)과 아데닌(AAA)을 제외한 나머지 유전자 탐침(probe) 염기서열 중 선택된 1종인 염기서열을 포함하는 유전자칩을 제공한다.
본 발명에서, 상기 염기서열 및 이의 역방향 염기서열이 펩타이드 헥산(Peptide nucleic acid: PNA) 또는 차단 헥산(Locked nucleic acid: LNA)으로 치환된 염기서열을 포함하는 탐침을 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 유전자칩은 형광염료가 부착된 RT-PCR용 프라이머와 반응하는 하이브리드화 대조군(Hybridization Control, 교잡반응) 탐침을 추가로 포함할 수 있으며, 이로 인해 상기 하이브리드화 대조군 탐침과의 반응 유무를 통해 시료와의 반응 조건이 정확한지 확인한 후 상기 하이브리드화 대조군 탐침을 기준으로 유전자 탐침의 위치를 확인할 수 있다.
또한 본 발명에서 구아닌 인식 유전자칩 기판을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출할 수 있는데, 이때 사용되는 탐침으로는 서열번호: 14 내지 18로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 염기서열의 5'-말단 위치에는 형광염료가 부착되어 검출을 용이하게 한다. 또한 상기에서 사용된 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴-결합물질, 5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군으로부터 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용된 탐침을 고정화시키기 위한 유리 슬라이드로는 (주)바이오메트릭스테크놀로지사의 구아닌 인식용 유리슬라이드가 사용되었으며, 이러한 방법은 상기 유리슬라이드에 탐침 중 연속되는 구아닌 염기의 영역을 선택적으로 인식하여 유전자를 일정거리를 두고 밀집되게 고정화시킬 수 있는 획기적인 기술이다.
또한 본 발명의 유전자칩은 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스가 양성임을 확인하고 유전자형 검사 올리고 염기칩에 사용된 탐침의 종류와 위치를 확인하는데 사용될 수 있으며, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자를 동시에 검사할 뿐만 아니라, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 백신주 및/또는 야외주 바이러스 유전자 및 이의 유전자형을 동시에 검사할 수 있 다.
또한 본 발명은 상기 유전자칩을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하는 진단키트를 제공한다.
실시예
이하, 도면을 참고하여 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하지만, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 올리고 유전자칩의 제작
올리고 유전자칩의 제작은 (주)바이오메트릭스테크놀로지사의 구아닌 인식용 유리슬라이드 상에서 제조사의 제공 매뉴얼에 따라 탐침을 고정화하였다.
(1) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 올리고 유전자 탐침의 합성
돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 검출을 위해 사용된 각 바이러스의 유전형에 특이적인 올리고 유전자 탐침은 5'-말단에 연속되는 9개의 구아닌 잔기를 갖도록 하기 표 1과 같이 합성하였다.
| 탐침명 | 염기서열 구조(5'-3') | 서열번호 |
| CSFV-P1 | 5`-GGGGG GGGGAAA CAGGACTTAGACCACCCAGGG -3` | 서열번호 1 |
| CSFV-P2 | 5`-GGGGGGGGGAAA CAGCACCCTATCAGGTCGTAC -3` | 서열번호 2 |
| CSFV-L | 5`-GGGGGGGGGTTT ACATAGCATATCGAGGTGGG -3` | 서열번호 3 |
| CSFV-W | 5`-GGGGGGGGGTTT ACATAGCATCTCGAGGTGGG -3` | 서열번호 4 |
| CSFV-2-1 | 5`-GGGGGGGGGAAA ATACTAGCCTGCTAGTGGGCC -3` | 서열번호 5 |
| CSFV-2-2 | 5`-GGGGGGGGGAAA ATACTAGCCTGTTAGTGGGCC -3` | 서열번호 6 |
| CSFV-3-1 | 5`-GGGGGGGGGAAA ATCTCGAGATGAGCTGCTGC -3` | 서열번호 7 |
| CSFV-3-2 | 5`-GGGGGGGGGAAA CCCATCACGCAGTGTGATTTCAC -3` | 서열번호 8 |
| BVDV-1-1 | 5`-GGGGGGGGGAAA AGCCATCCAACGAACTCACCAC -3` | 서열번호 9 |
| BVDV-1-2 | 5`-GGGGGGGGGAAA CCACTGACGACTACCCTGTAC -3` | 서열번호 10 |
| BVDV-2-1 | 5`-GGGGGGGGGAAA TACTCAGGGGTTCGGCCATCC -3` | 서열번호 11 |
| BVDV-2-2 | 5`-GGGGGGGGGAAA TACTCAGGGATTAGGCCATCC -3` | 서열번호 12 |
| HC | 5`-GGGGGGGGGAAA CCTACTRTGGGCATGGCTAG -3` | 서열번호 13 |
(염기서열 중 R은 A, G를 의미하며, 이는 당 업계의 통상의 지식을 갖는 자들에게 널리 공지되어 있음)
탐침의 구조는 구아닌 인식 슬라이드에 고정화되는 영역, 목표유전자와 반응하는 영역 및 상기 두 영역을 연결하며 일정한 공간을 만들어주는 영역과 같이 크게 3가지 영역으로 나누어지며, 공간을 만들어주는 영역은 경우에 따라 생략될 수 있다. 상기 표 1의 탐침인 CSFV-P1을 예로 들면, 슬라이드에 고정될 영역은 GGGGGGGGG이고, 공간을 만들어주는 영역은 AAA이며, 목표유전자와 반응하는 영역 CAGGACTTAGACCACCCAGGG이다. 이는 상기 탐침에만 한정되는 것이 아니라 모든 탐침 설계에 적용되는 기술이며, 또한 연속되는 구아닌의 숫자는 9개에 국한되지 않으며, 5 내지 15개 범위에서도 가능하다. 공간을 만들어주는 영역은 A,T,C 중 어떤 염기든 가능하며, 염기서열의 순서에도 제한을 두지 않으며, 염기숫자 또한 0 내지 12개 정도이면 제한을 두지 않는다. 또한 목표유전자는 상기 표 1에 기재된 염기서열 전체 혹은 일부를 포함하는 서열이 가능하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 표 1의 탐침 중 돼지콜레라에서 증폭 프라이머와 교잡할 수 있는 탐침은 증폭 유무와 상관없이 증폭 결과물과 교잡반응을 수행하면 항상 양성으로 나오는 특징이 있어 2가지 역할을 하는데, 첫째는 칩 분석 시 전체 탐침의 기준점이 되고, 둘째는 교잡반응이 잘못되었을 경우에도 상기 탐침을 대조군으로 사용하여 결과를 분석할 수 있다.
(2) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 올리고 유전자 탐침의 고정
올리고 유전자 탐침은 (주)바이오메트릭스테크놀로지의 구아닌 인식용 유리슬라이드에 제조사의 매뉴얼에 따라 고정화하였다.
실시예 2. 표본 채취 및 RNA 추출
(1) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스 검체
돼지콜레라의 유형별 국내 표준 검체 샘플은 대한민국 농림부 국립수의과학검역원으로부터 제공받았으며, 시료는 전혈, 백혈구, 조직 및 바이러스 배양액 형태의 샘플로 보관되었다. 검체 바이러스는 전염성이 강하므로 생독 바이러스 형태로는 검역원 외로 반출이 금지되어 있어 검체 RNA의 추출은 검역원내에서 수행하였으며, RNA 추출은 Qiagene사의 RNeasy mini kit를 이용하여 RNA를 제조사의 매뉴얼에 따라 추출하였다.
실시예 3: 올리고 유전자칩을 이용한 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 검사
(1) 복합 역전사 중합효소 연쇄반응(MP RT-PCR)
돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자를 증폭하기 위해 MP RT-PCR에 사용한 프라이머는 Cy3가 부착된 Pesti-F와 CSFV-R, BVDV1-R1, BVDV1-R2, BVDV2-R을 사용하였으며, 증폭된 염기서열의 길이는 422bp 내지 423bp으로 하였다.
| 프라이머 이름 | 염기서열(5'-3') | 서열번호 |
| Pesti-F | 5`-GCTAGCCATGCCTTAGTAGGACT-3` | 서열번호 14 |
| CSFV-R | 5`-CAGCTTCARYGTTGATTGT-3` | 서열번호 15 |
| BVDV1-R1 | 5`-GAGCTTTAGCGTCGATTGA-3` | 서열번호 16 |
| BVDV1-R2 | 5`-CAGTTTTAGCGTCGCCTGC-3` | 서열번호 17 |
| BVDV2-R | 5`-GTAGTTTTAGTGTKGACTGCG-3` | 서열번호 18 |
(Pesti-F 탐침은 이의 5'에 Cy3 형광물질을 부착함. 염기서열 중 R은 A, G를 의미하고, Y는 C, T를 의미하며, K는 G,T를 의미한다)
MP RT-PCR은 다음과 같은 방법으로 수행한다. Qiagen사의 OneStep RT-PCR Kit를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 최종 부피가 25ul인 반응혼합물 용액을 준비한다. 이때, 사용한 프라이머는 반응용액 25ul에 각각 10pmol의 양으로 사용되었다. PCR 서머싸이클러(thermocycler, Biometra)에서 50℃에서 30분(역전사, Reverse transcription) 동안 RNA를 cDNA로 합성하고, 95℃에서 15분 동안 초기 PCR 활성화(Initial PCR activation) 단계, 94℃에서 20초 동안 변성(denaturation) 단계, 55℃에서 20초 동안 프라이머 어닐링(primer annealing) 단계 및 72℃에서 30초 동안 연장(extension) 단계를 하여, 상기 변성단계, 프라이머 어닐링 단계 및 연장 단계 등을 35회 반복하여 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 결과물 용액 중 10ul의 시료를 취하여 로딩 다이(loading dye)와 혼합한 후 1.5% 아가로즈겔(agarose gel)에서 전기영동하여 1ug/ml 농도의 에티움브로마이드(Ethidium Bromide, Sigma)용액에서 15분간 염색한 후, 자외선을 이용하여 증폭된 cDNA의 크기를 확인하였다.
(2) 교잡반응(hybridization)(하이브리드)
상기 올리고 유전자 탐침이 고정화된 칩 기판에 MP RT-PCR에 의해 증폭된 돼지콜레라 혹은 소바이러스성설사증의 유전자의 교잡반응을 수행하였다. 교잡반응실(hybridization reaction chamber)로는 50ul 용량의 고무 웰 플레이트(도 1)를 사용하였다.
고무 웰 플레이트가 부착된 칩 기판상에 교잡용액(saline-sodium citrate (SSC), SDS, formamide) 40ul와 MP RT-PCR 증폭 산물 10ul를 혼합하여 도말하였다. 고무 웰 플레이트를 플레이트 밀봉제(plate sealer)를 이용하여 밀봉하여 상기 용액이 증발하는 것을 방지한 후 인큐베이터(40 내지 55℃)에서 1 내지 2 시간 동안 반응시킨다. 교잡반응이 끝난 후, 웰 플레이트와 사용된 밀봉제를 제거하고, 워쉬 1(Wash 1, SSC, SDS) 용액으로 45 내지 25℃에서 2분 동안 세척한 후에 다시 워쉬 2(SSC) 용액으로 2분 동안 세척하고, 칩 슬라이드를 건조시킨 후, 콘포칼레이저스캐너(confocal laser scanner, PerkinElmer Scane Array Express HT)를 이용하여 형광신호를 분석하였다.(excitation 550nm, emission 570nm)(표 3 참조).
(3) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 올리고 유전자칩의 해석
돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스 올리고 유전자칩의 탐침에 대한 유전자 지도는 도 2에 도시된 바와 같으며, MP RT-PCR에 의해 증폭된 유전자를 상기 칩에 중합반응시킨 후 결과를 판독하였다. 탐침 CSFV-P1 또는 CSFV-P2가 반응하는 경우 돼지콜레라 양성 반응으로 판정하고, CSFV-L 탐침이 반응하는 경우 돼지콜레라의 유전자 1형 백신주로 판정하고, CSFV-L 탐침과 반응하지 않지만 CSFV-W 탐침과 반응하는 경우 1형 야외주로 판정하였다. 또한, CSFV-L 및 CSFV-W가 동시에 반응할 때에는 그 반응 우위에 따라 CSFV-L > CSFV-W인 경우에는 백신주로 판정하고, CSFV-L < CSFV-W인 경우에는 야외주로 판정하였다. CSFV-W, CSFV-2-1 또는 CSFV-2-2와 반응하는 경우 유전자 1형 야외주로 판정하고, CSFV-3-1 및 CSFV-3-2 탐침과 반응하는 경우 유전자 3형 야외주로 판정하였다. 탐침 BVDV-1-1 및 BVDV-1-2와 반응하는 경우 소바이러스성설사증 유전자 1형으로 판정하고, 탐침 BVDV-2-1와 반응하거나 BVDV-2-2와 반응하는 경우 소바이러스성설사증 유전자 2형으로 판정하였다(표 3 참조).
| 바이러스 | 유전형 | 시료명 | Multiplex RT-PCR | 유전자칩 | 비고 |
| 돼지콜레라 | Genotype1 백신주 | 1 |
 |
 |
 |
| Genotype1 야외주 | 2 |
 |
|||
| 3 |
 |
||||
| Genotype2 야외주 | 4 |
 |
|||
| 5 |
 |
||||
| Genotype3 야외주 | 6 |
 |
|||
| 소 바이러스성 설사증 | Genotype1 | 7 |
 |
||
| Genotype2 | 8 |
 |
|||
| 돼지콜레라, 소 바이러스성 설사증 중복 감염 | 9 |
 |
상술한 바와 같이, 유전자칩은 유전자 및 유전자 변이를 단시간에 대량으로 분석할 수 있는 도구로서 근래에 그 중요성이 증가하고 있으며, 본 발명에서는 상기 유전자칩 기술 중 특히 구아닌 인식 슬라이드를 이용하여 탐침 사이의 거리를 일정하게 조절하면서 밀집되게 고정시키는 기술과, 탐침의 합성구조의 개발로 인해 목표유전자와의 반응성을 높일 수 있어 소량의 유전자가 존재하여도 검출할 수 있는 우수한 민감도를 갖는 유전자 칩이 개발되었다. 또한, 바이러스와 특이적으로 반응하는 탐침을 합성하여 탐침과의 반응 결과물의 조합으로부터 바이러스 감염의 양성 및/또는 음성의 확인 및 백신주/야외주의 구분, 유전형 구분할 수 있게 되었다. 특히, 백신주/야외주를 구분할 수 있는 해당 탐침은 그 특이성이 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)의 수준이고 유전형 구분영역도 또한 SNP 수준이여서 구분하기 힘든 기술로 알려졌지만, 본 발명에 따른 유전자칩을 이용하는 경우 매우 확하게 이를 구분할 수 있었다.
상술한 바와 같이, 기존의 진단 시스템을 이용하여 감염여부를 검사하는 경우 1주일 이상 소요되었지만, 본 발명은 샘플의 채취, 분리, 증폭, 및 유전자 칩 검사를 수행하는데 3 내지 4시간 정도로 신속하게 검사할 수 있어 산업적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 유전형의 구분은 바이러스 확산시에 지역 간 유전적 동질성을 확인함으로써 감염원과 전파경로를 추적하는데 용이한 검사시스템이 될 수 있다. 또한, 이러한 유전자칩의 기술 시스템은 돼지콜레라뿐만 아니라 다양한 동물계에서 사용될 수 있으며, 이들 바이러스 진단 및 유전형 구분에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management:Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research and Quarantine Service)
Biometrix Techonology, inc.
Jeno Biotech Inc.
<120> GENE CHIP, METHOD FOR DETECTING CSFV AND BVDV GENE USING GENE
CHIP AND DETECTION KIT COMPRISING GENE CHIP
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-P1
<400> 1
ggggggggga aacaggactt agaccaccca ggg 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-P2
<400> 2
ggggggggga aacagcaccc tatcaggtcg tac 33
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-L
<400> 3
gggggggggt ttacatagca tatcgaggtg gg 32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-W
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gggggggggt ttacatagca tctcgaggtg gg 32
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-2-1
<400> 5
ggggggggga aaatactagc ctgctagtgg gcc 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-2-2
<400> 6
ggggggggga aaatactagc ctgttagtgg gcc 33
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-3-1
<400> 7
ggggggggga aaatctcgag atgagctgct gc 32
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-3-2
<400> 8
ggggggggga aacccatcac gcagtgtgat ttcac 35
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BVDV-1-1
<400> 9
ggggggggga aaagccatcc aacgaactca ccac 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BVDV-1-2
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ggggggggga aaccactgac gactaccctg tac 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BVDV-2-1
<400> 11
ggggggggga aatactcagg ggttcggcca tcc 33
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BVDV-2-2
<400> 12
ggggggggga aatactcagg gattaggcca tcc 33
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC
<400> 13
ggggggggga aacctactrt gggcatggct ag 32
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<212> DNA
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<220>
<223> Pesti-F
<400> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-R
<400> 15
cagcttcary gttgattgt 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BVDV1-R1
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gagctttagc gtcgattga 19
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<400> 17
cagttttagc gtcgcctgc 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BVDV2-R
<400> 18
gtagttttag tgtkgactgc g 21
Claims (14)
- 기판 및 유전자 탐침(probe)을 포함하는 올리고 유전자칩에 있어서,상기 유전자 탐침은, 하기 표1의 서열번호 1 내지 서열번호 13에서 상기 기판에 고정화하기 위한 염기서열인 9개의 구아닌(GGGGGGGGG)과 공간 확보를 위해 연속된 염기서열인 3개의 티민(TTT)과 아데닌(AAA)을 제외한 나머지 유전자 탐침(probe) 염기서열 중 선택된 1종인 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 유전자칩.(표1)
탐침명 염기서열 구조(5'-3') 서열번호 CSFV-P1 5`-GGGGGGGGGAAACAGGACTTAGACCACCCAGGG-3` 서열번호 1 CSFV-P2 5`-GGGGGGGGGAAACAGCACCCTATCAGGTCGTAC-3` 서열번호 2 CSFV-L 5`-GGGGGGGGGTTTACATAGCATATCGAGGTGGG-3` 서열번호 3 CSFV-W 5`-GGGGGGGGGTTTACATAGCATCTCGAGGTGGG-3` 서열번호 4 CSFV-2-1 5`-GGGGGGGGGAAAATACTAGCCTGCTAGTGGGCC-3` 서열번호 5 CSFV-2-2 5`-GGGGGGGGGAAAATACTAGCCTGTTAGTGGGCC-3` 서열번호 6 CSFV-3-1 5`-GGGGGGGGGAAAATCTCGAGATGAGCTGCTGC-3` 서열번호 7 CSFV-3-2 5`-GGGGGGGGGAAACCCATCACGCAGTGTGATTTCAC-3` 서열번호 8 BVDV-1-1 5`-GGGGGGGGGAAAAGCCATCCAACGAACTCACCAC-3` 서열번호 9 BVDV-1-2 5`-GGGGGGGGGAAACCACTGACGACTACCCTGTAC-3` 서열번호 10 BVDV-2-1 5`-GGGGGGGGGAAATACTCAGGGGTTCGGCCATCC-3` 서열번호 11 BVDV-2-2 5`-GGGGGGGGGAAATACTCAGGGATTAGGCCATCC-3` 서열번호 12 HC 5`-GGGGGGGGGAAACCTACTRTGGGCATGGCTAG-3` 서열번호 13 (염기서열 중 R은 A, G를 의미하고, 탐침명 중 HC는 교잡반응(Hybridization) 탐침을 의미한다) - 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 따른 올리고 유전자칩을 이용하여,돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자 또는 유전자형을 동시에 검사하는 것을 특징으로 하는 유전자 검사 방법.
- 제 1 항에 따른 올리고 유전자칩을 이용하여,돼지콜레라 바이러스에 있어서 백신주 및 야외주 바이러스 유전자 또는 유전자형을 검사하는 것을 특징으로 하는 유전자 검사방법.
- 돼지 혈청 또는 혈액으로부터 RNA를 추출하는 단계;상기 추출된 RNA를 다중(Multiplex) 역전사 중합효소 연쇄반응(Multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)을 이용하여 증폭하는 단계;상기 증폭된 돼지콜레라 유전자를 제 1 항에 따른 올리고 유전자칩과 교잡반응시키는 단계; 및상기 교잡반응에서 특이적으로 결합된 돼지콜레라 유전자 및 이의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 바이러스의 유전자 검사 방법.
- 제 6 항에 있어서,상기 RNA를 증폭하는 단계는, 하기 표2의 서열번호 14 내지 서열번호 18의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 바이러스의 유전자 검사 방법.(표2)
프라이머 이름 염기서열(5'-3') 서열번호 Pesti-F 5`-GCTAGCCATGCCTTAGTAGGACT-3` 서열번호 14 CSFV-R 5`-CAGCTTCARYGTTGATTGT-3` 서열번호 15 BVDV1-R1 5`-GAGCTTTAGCGTCGATTGA-3` 서열번호 16 BVDV1-R2 5`-CAGTTTTAGCGTCGCCTGC-3` 서열번호 17 BVDV2-R 5`-GTAGTTTTAGTGTKGACTGCG-3` 서열번호 18 (염기서열 중 R은 A, G를 의미하고, Y는 C, T를 의미하며, K는 G,T를 의미한다) - 제 7 항에 있어서,상기 프라이머의 5'-말단의 위치에는 형광염료가 부착된 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 바이러스의 유전자 검사 방법.
- 제 8 항에 있어서,상기 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴-결합물질, (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 바이러스의 유전자 검사 방법.
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