JP4477575B2 - 大腸がんの検査に使用する遺伝子セット - Google Patents
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Description
現在、大腸がんの検診には主に便潜血反応という方法が用いられている。便潜血検査とは血液中のヘモグロビンを化学的に測定し、肉眼ではそれとは認識できない大腸の内腔表面からの出血を検出する方法である。この方法は非常に鋭敏で、便に血液がごく微量混じっているだけでも検出が可能である。しかしながら、化学的便潜血反応は、感度は良いが、ヒトのヘモグロビンに特異的ではなく、食物として食べた肉や緑色野菜、薬物などとも反応して偽陽性が見られるため、検査前には厳密な食事制限を必要とする。
(1)total RNAの抽出
末梢血、正常大腸粘膜6症例、早期大腸がん組織(Dukes A, B)6症例および進行大腸がん組織(Dukes C, D)19症例を採取し、total RNAの回収を行った。total RNAの回収は常法に従い、以下に示す方法で行った。
大腸がん患者の便に含まれる細菌以外の生細胞は、少量のがん細胞、リンパ球、赤血球、肛門扁平上皮細胞であり、大腸粘膜から脱落する細胞には、生細胞は含まれないと考えられている。一方、健常人(ただし痔の人を含む)の便には、リンパ球、赤血球、肛門扁平上皮細胞が含まれる。したがって、早期および進行大腸がんのほとんどの症例で発現し、末梢血および扁平上皮細胞で発現しない遺伝子は、便からの大腸がんスクリーニングの良いマーカーとなりうる。脱落大腸粘膜中に含まれるごく僅かな生細胞の存在を考慮し、大腸正常粘膜で発現しないという条件をさらに加えて、マーカー候補の絞り込みを行った。絞り込みは、マイクロアレイを用いたゲノム網羅的遺伝子発現解析によって行った。
(1)逆転写(1st strandの合成)
実施例1で得られた進行大腸がん組織のtotal RNA のうち5μgを、Invitrogen社製 SUPER SCRIPT Choice Systemを用いてランダムヘキサマープライマーによる逆転写を行った。具体的には下記の方法で行った。
回収された1st strand cDNA溶液をテンプレートとして、表1に記載の50遺伝子に関し、PCR増幅を行なった。各PCR反応は、テンプレートとして(1)で合成した大腸がん組織の1st strand cDNA溶液を3倍に希釈したものを用い、プライマーとして表2に記載のプライマーセットを用いた。PCR反応液は、タカラバイオ株式会社製PCR酵素、TaKaRa Ex Taqを用い、表4に示す組成で調製した。
得られた各PCR産物から10μlを用いて1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、EtBr溶液で染色した。その結果、各PCR産物とも表2に示す所望の鎖長において1本の濃いバンドが検出され、主な産物は1種であることがわかった。
便から上皮細胞特異的抗体(Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社)を用いたMACS(Magnetic cell sorting)で分離した細胞(実施例6の1で詳細に記述)にはリンパ球や赤血球はほとんど含まれない。よって、選抜工程1で選ばれた50遺伝子は、この分離細胞による大腸がんスクリーニングに有効な遺伝子である。一方、便から直接RNAを抽出してスクリーニングするためには、リンパ球や赤血球では全く検出されない遺伝子を再選抜する必要がある。
得られたtotal RNA のうち5μgを、Invitrogen社製 SUPER SCRIPT Choice Systemを用いてランダムヘキサマープライマーによる逆転写を行った。具体的には下記の方法で行った。
回収された1st strand cDNA溶液をテンプレートとして、表1に記載の50遺伝子に関し、PCR増幅を行った。各PCR反応は、テンプレートとして(1)で回収した大腸がん細胞の1st strand cDNA溶液を3倍に希釈したものを用い、プライマーとして表2に記載のプライマーセットを用いた。
得られた各PCR産物の10μlを用いて1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、EtBr溶液で染色した。
50遺伝子のうち、末梢血で検出されなかった遺伝子は、15種(遺伝子No. 1, 2, 6, 8, 10, 11, 25, 30, 37, 38, 40, 41, 42, 46, 50)であった。そのうち代表的な遺伝子として、No. 1, 2, 6, 10, 11, 30, 42の電気泳動の結果を、図1に示した。また表6に全15遺伝子の30症例の大腸がん組織における発現の有無を示した。早期がん(Dukes A, B)でも進行がん(Dukes C, D)でも、70〜100%の症例で発現が認められ、どの症例も複数(7〜15種)の遺伝子の発現を認めた。
I.DNAマイクロアレイの作製
(1)ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板(サイズ(W×L×T):25mm×75mm×1mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で20分超音波洗浄を行った。次に、80℃に加熱した1N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、DNAチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、1%の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、120℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
表1に示した50遺伝子を検出するためのプローブDNA(配列番号1〜50)をそれぞれ合成した。
プローブDNAは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、常法に従って、5’末端にチオール化処理を施した。その後、DNA合成時における副反応を避けるために、保護基を脱保護し、さらにHPLC精製および脱塩処理を施した。
得られたプローブDNAは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度(インク溶解時)10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブDNAを上記の混合溶媒に規定濃度(10μM)となるように溶解した。得られたプローブDNA溶液を、バブルジェットプリンター(商品名:BJF-850 キヤノン社製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
加湿チャンバー内における30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブDNAを洗い流した。ガラス基板表面に、各DNAチップ当たり16スポットに所定の一本鎖プローブDNAが、それぞれ固定された、DANマイクロアレイ型DNAチップを得た。
(1)検体の増幅と標識化(取り込み標識によるPCR増幅)
検体としては、実施例1で合成した1st strand cDNA溶液を用いた。1st strand cDNA溶液をテンプレートとして、表1に記載の50遺伝子のうち、表9に示す10遺伝子に関し、それぞれ取り込み標識によるPCR増幅を行なった。プライマーとしては表2に記載のプライマーセットを用いた。PCR反応はタカラバイオ株式会社製PCR酵素TaKaRa Ex Taqを用い、表7に示す反応液の調製によって行った。なお、dNTPの最終濃度は、200μMになるように調製した。
反応終了後、精製用カラム(QIAGEN社製 QIAquick PCR Purification Kit)を用いて精製し、50μlの蒸留水で溶出した後、精製物を標識化検体とした。
Iで作製したDNAマイクロアレイと、これらの標識化検体10種を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
BSA(牛血清アルブミンFraction V:Sigma社製)を1wt%となるように、100mM NaCl/10mM Phosphate Bufferに溶解し、この溶液にIIで作製したDNAマイクロアレイを室温で2時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む0.1×SSC溶液(NaCl 15mM、Sodium Citrate(trisodium citrate dihydrate,C6H5Na3・2H2O) 1.5mM、p.H. 7.0)で洗浄を行った後、純水でリンスした。その後、スピン・ドライ装置でDNAマイクロアレイの水切りを行った。
最終濃度が6×SSPE/10% Form amide/PCR増幅産物溶液(6×SSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)となるよう、各PCR産物に対しハイブリダイゼーション溶液を調製した。なお、各PCR増幅産物溶液はそれぞれ精製物の約半量である25.0μl使用した。
水切りしたDNAチップを、ハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、表8に示す手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したDNAチップについて、DNAマイクロアレイ用蛍光検出装置(Axon社製、Genepix 4000B)を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。蛍光輝度を測定した結果を表9に示す。
(1)検体の増幅と標識化(取り込み標識によるマルチプレックスPCR増幅)
検体としては、大腸進行がん患者より大腸がん組織、正常大腸粘膜、および血液を採取した。それぞれについて、実施例1および実施例2で示した手法でtotal RNAの回収、1st strandの合成を行なった。なお、ここでも個人差をなくすために7人の患者から採取したものを混合した。得られた1st strandcDNA溶液を検体とした遺伝子の増幅、および、標識化反応を以下に示す。本実施例においては、実施例4で選択した遺伝子10種を検出対象とし、プライマーに関しては、10種すべてのプライマーを1本のPCRチューブ中に添加、すなわちマルチプレックスPCRを行った。基質としては実施例4と同様にCy3-dUTPを添加し、PCR産物の標識化を行った。PCR反応の溶液組成は表10に示した通りである。
5種の遺伝子(No. 1, 2, 6, 38, 50それぞれPAP, REG1A, DPEP1, MET, REG1B)についての7人の健常人および25人の大腸がん患者の便から分離した細胞RNAを用いてRT-PCRの解析を行った。なお、上記5遺伝子とそのプローブおよびプライマーは、表28および表29にまとめて示す。
手術前の大腸がん患者由来便を検体として使用した。便の使用に関しては事前に被験者へ実験内容の説明を行い、同意を得た。
便(約5〜80g)が入ったストマッカーバッグに200mlの10%FBS含有Hanks液(ニッスイ)を入れ、シールした後、ストマッカーを用いて(200rpm,1min)便の懸濁液を作成した。
(i) cDNA合成(1回目)
上記で得られたtotal RNAのうち1μgをInvitrogen社製 SUPER SCRIPT Choice Systemを用いてオリゴ(dT)プライマーによる逆転写反応を行った。total RNA(10μl)に100μMのT7-oligo dT 24 primer を1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後、氷上にて2分以上置き、急冷させた後、表12に示した試薬を加えて、37℃で2分間保温した。
続いて、2nd strand cDNA合成を下記に示す方法により行った。1st strand cDNA溶液に、表13に示した通りに試薬を加え、16℃で2時間保温した。
Ambion社製MEGAscriptT7Kitを用いて以下の反応を行った。(i)で作成した、cDNA溶液8μlに対し、表17に示した通りに試薬を加え、37℃で5時間保温した。次に、DNase ( RNase free ) 1μlを加え37℃で15分間保温し、DNAを除去した。
上記で得られたcRNA溶液に対し、ランダムヘキサマープライマーを用いて2回目の逆転写反応を行った。0.5μg/μl ランダムヘキサマーを1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後氷上にて2分以上置き、急冷させた後、前述の表12に示した通りに試薬を加えて、37℃で2分間保温する。その後、SuperScriptII RTを1μl加えて、37℃で1時間保温する。こうして、1st strand cDNA溶液約20μlを回収した。続いて、RNase H 1μlを加えてRNAの除去を行う。37℃で20分間保温し、RNAとDNAを離すため95℃で2分間保温し、その後氷上にて2分以上置き、急冷させる。
(iii)で作成した、cDNA溶液22μlに対し、(ii)で行ったのと同様の方法でcRNAの合成を行った。ただし、最後は10μlの蒸留水に溶解させた(RNA量は5μg〜10μg)。
(iv)で作成した、cRNA溶液10μlに対し、0.5μg/μl ランダムヘキサマーを1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後氷上にて2分以上置き、急冷させた後、表12に示した通りに試薬を加えて、逆転写反応が効率良く起きるように37℃で2分間保温する。その後、SuperScriptII RTを1μl加えて、37℃で1時間保温する。続いて、RNase Hを1μl加えてRNAの除去を行う。37℃で20分間保温し、RNAとDNAを離すため95℃で2分間保温し、その後氷上にて2分以上置き、急冷させる。上記反応液約20μlに20μlの精製水を加え、そのうち1μlを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件とその産物の電気泳動は実施例3の(2)および(3)と同様に行った。
5遺伝子による結果として、7人の健常人の便はすべて陰性であったのに対して、25人の大腸がん患者の便では、全体として約50%(12/25)で少なくとも1つの遺伝子が陽性であった。アクチン mRNAが検出された、すなわち細胞数が多かった症例に関しては、約80%(7/9)で少なくとも1つの遺伝子が陽性であった(図2)。すなわち、陽性的中率は100%であり、便鮮血検査(約0.1%)を遥かに凌ぐものであった。
実施例6で合成したcDNA溶液を検体とし、取り込み標識によるマルチプレックスPCR増幅を行った後、DNAマイクロアレイによる発現解析を行った。すなわち、実施例6と同様に、7人の健常人、および25人の大腸がん患者、計32例全てについて解析を行った。
表22に各症例における5遺伝子の発現の有無をまとめたものを示す。表21の蛍光輝度値において、25以上の値のものを陽性とした。5遺伝子中1遺伝子以上陽性であれば、陽性判定は「○」とした。なお、βアクチンの発現有無は、実施例6のPCR結果によるものである。また、最右列の細胞診は、便から回収した細胞を用いて細胞診を行った結果である。
(マイクロアレイによる約39000遺伝子の発現プロファイルの取得とマーカー遺伝子の選抜)
実施例6(1)で抽出したtotal RNAをターゲットとしてマイクロアレイ(human U133 oligonucleotide probe arrays (Affymetrix社 米国))を用いてゲノム網羅的遺伝子発現解析を行った。実験方法は製造会社の推奨する方法に従った(実施例1(2)参照)。ターゲットとしては大腸がん患者の便から分離した細胞RNA4種、および健常者の便から分離した細胞RNA7種を混合したもの、計5種を用いた。
(1)RT-PCR解析
実施例8で選抜した7遺伝子についての7人の健常人および25人の大腸がん患者の便から分離した細胞RNAを用いてRT−PCRの解析を行った。なお、上記7遺伝子とそのプローブおよびプライマーは、表30および表31にまとめて示す。また、実験手順は実施例6の(i)〜(v)の通りである。
実施例8で選抜した7遺伝子を検出するためのプローブDNA(配列番号151〜157)を合成し、実施例4のIで示した通りにDNAマイクロアレイを作製した。このDNAマイクロアレイを用いて、実施例7と同様に、表31に示したプライマーを用いて7遺伝子を検出対象とした取り込み標識マルチプレックスPCR増幅を行った後、発現解析を行った。プライマーは7種全てを1本のPCRチューブ中に添加してマルチプレックスPCRを行った。基質はCy3-dUTPを添加してPCR産物の標識化を行った。PCR反応の溶液組成、温度サイクル・プロトコル、DNAマイクロアレイとのハイブリダイゼーション方法は実施例7と同様である。標識化検体32種に対する各プローブの蛍光輝度値を表33に示す。
表34に各症例における7遺伝子の発現の有無をまとめたものを示す。表33の蛍光輝度値において、30以上の値のものを陽性とした。また、7遺伝子中1遺伝子以上陽性であれば、陽性判定は「○」とした。βアクチンの発現有無、細胞診は、実施例7中表22と同様である。
配列番号51〜150−人口配列の説明:プライマー
配列番号151〜157−人口配列の説明:プローブ
配列番号158〜171−人口配列の説明:プライマー
Claims (11)
- 配列番号1、2、6、38および50で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブの全ての組み合わせ、あるいは
前記塩基配列の少なくとも一以上において1〜3個の塩基が欠失、置換または付加した塩基配列で、かつそれぞれの対応する遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブの全ての組み合わせ、
を用いて、被験体由来の検体中からそれぞれのプローブが特異的にハイブリダイズするmRNAの量を測定する大腸がん細胞をスクリーニングする方法。 - 前記検体が、便のスメアであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 配列番号151〜157で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブの全ての組み合わせ、あるいは
前記塩基配列の少なくとも一以上において1〜3個の塩基が欠失、置換または付加した塩基配列で、かつそれぞれの対応する遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブの全ての組み合わせ、
を用いて、被験体由来の便中からそれぞれのプローブが特異的にハイブリダイズするmRNAの量を測定する大腸がん細胞をスクリーニングする方法。 - 配列番号1、2、6、50および151〜157で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブの全ての組み合わせ、あるいは
前記塩基配列の少なくとも一以上において1〜3個の塩基が欠失、置換または付加した塩基配列で、かつそれぞれの対応する遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブの全ての組み合わせ、
を用いて、被験体由来の便中からそれぞれのプローブが特異的にハイブリダイズするmRNAの量を測定する大腸がん細胞をスクリーニングする方法。 - 前記測定した被験体由来の検体におけるmRNA量が健常者由来の検体におけるそのmRNA量に基づいて算出された基準値よりも高い場合には、該被験体由来の検体が大腸がん細胞を含んでいると判定する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法を用いる採取された検体中の大腸がん細胞の判定方法。
- 大腸がんが早期大腸がんである、請求項6に記載の方法。
- 配列番号51〜54、61、62、125、126、149、150または158〜171のいずれか1に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、かつ表29または表31に記載の対応する遺伝子を特異的に増幅するための請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において用いるプライマー。
- 請求項1、3または4のそれぞれに記載のプローブの全ての組み合わせからなり、表28または表30に記載の対応する遺伝子にそれぞれ特異的にハイブリダイズして該遺伝子を検出するための請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法に用いるプローブセット。
- 請求項9記載のプローブセットを固相担体上に固定化したことを特徴とする、固相化試料。
- 表29および表31記載の遺伝子群から選択される少なくとも2種以上の遺伝子について、請求項8記載のプライマーと請求項9記載のプローブセットおよび/または請求項10記載の固相化試料とを含む、大腸がん細胞の遺伝子検出用キット。
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