KR100643146B1

KR100643146B1 - 급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 디엔에이칩

Info

Publication number: KR100643146B1
Application number: KR1020030087427A
Authority: KR
Inventors: 박종훈; 성주명; 조대호; 박민하; 양문희
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2003-12-04
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2006-11-10
Also published as: KR20050054109A

Abstract

본 발명은 급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 DNA칩에 관한 것이다.

본 발명의 급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 DNA칩은, 급성골수성 백혈병 세포의 유전자들 중 발현양상의 차이를 보이는 256 개의 cDNA와 컨트롤로 사용되는 베타-액틴(β-actin) 유전자와 GAPDH 유전자로 구성된다.

또한, 본 발명은 환자의 급성골수성 백혈병 세포에서 발현된 RNA를 제조한 다음, 급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 DNA칩에 혼성화하여, 예후가 좋은 군에서 발현되는 유전자인 C20orf97 유전자의 발현정도와 예후가 나쁜군에서 발현되는 유전자인 XRN2 유전자의 발현정도를 비교하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 급성골수성 백혈병환자의 예후를 판별할 수 있는 DNA 칩과, 특정 유전자의 발현정도를 비교하는 방법이 제공된다.

백혈병, DNA칩, 유전자, 발현

Description

급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 디엔에이칩{DNA CHIP FOR PROGNOSIS DISTINCTION OF ACUTE MYLOID LEUKEMIA CASE}

도 1은 급성골수성 백혈병 세포주의 cDNA 혼성화 실험결과 사진

A : 예후가 좋은군, B : 예후가 나쁜군

도 2는 본 발명의 급성골수성 백혈병환자의 예후를 판별하기 위한 디엔에이 칩의 마이크로어레이

도 3은 계층적 클러스터링 방법을 사용하여 조사한 유전자 발현양상

도 4는 XRN2 유전자와 C20orf97 유전자의 발현양상

최근 인간 게놈 프로젝트가 완성됨에 따라 유전자 이상에 대한 해석을 하려는 노력이 광범위하게 이루어지고 있으며 그 중요성이 더욱 부각되고 있다. 즉 게 놈 구조의 이해를 토대로 각각의 유전자가 아닌 인간의 유전자 전체, 게놈 수준에서 유전자와 생명현상과의 관계를 규명하고 유전자의 이상이 질병의 발생과 현상 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 규명하는 일이 가능하게 되었으며, 이를 통하여 질병의 진단과 치료 등에 있어 획기적인 개선이 가능하게 되었다.

그러나, 현 수준에서 단백질의 기능과 구조를 대단위로 연구하는 것은 기술적으로 미완성 상태라고 할 수 있으며, 이를 연결하는 가장 중요한 고리 중의 하나가 유전자의 발현에 대한 연구라 할 것이다.

따라서, 대단위 규모의 정보를 생산하는 게놈 시대에 있어서 대단위 규모로 유전자 발현의 변화를 검색하는 일이 필수적이며, 이는 최근 정립된 cDNA 칩 기법에 의하여 가능하게 되었다.

cDNA 마이크로어레이(microarray)는 2.5cm x 7cm의 유리슬라이드 위에 수천개 이상의 유전자를 부착한 후 특정 조직의 mRNA 발현 정도를 일시에 측정하는 기법으로서 1995년 미국 스텐포드 대학의 Pat Brown 등에 의하여 개발되었다.

대규모 유전자 발현 검사는 생명현상을 총체적으로 이해하는 단서를 제공한다는 데에 의미가 있다. 특정 유전자의 이상 또는 발현 변화는 단지 그 유전자의 변화만으로 끝나는 것은 아니며, 증폭과정 시스템(cascade system)을 통하여 또 다른 여러 유전자의 발현 변화를 유도함으로써 궁극적으로 특정적인 형질의 발현을 유도하게 된다.

따라서, 종래 연관성 분석(linkage analysis) 이나 연관 연구(association study)가 특정 형질을 유발하는 원인 유전자의 이상을 규명하기 위한 노력이었다면, cDNA 칩은 특정 유전자의 이상이나 발현 변화로부터 결과적으로 나타나는 게놈 활성의 총체적인 변화를 규명하는 것이라 할 수 있다.

이러한 연구를 통하여 병리현상에 대한 이해와 형질 특성과 관련된 표식자의 발굴, 신약 개발에 대한 타겟에 대한 정보를 얻을 수 있으며 각종 질환에서 질병의 발생 단계에 따른 유전자 발현의 변화를 관찰하고 각 질병 고유의 특징적인 유전자 발현 변화를 이해함으로써 진단, 치료의 효과적인 대상 유전자를 규명할 수 있을 것이다.

한편, 급성골수성 백혈병은 백혈구로 가는 전단계 아세포(blast) 단계에서 이상이 생겨 성숙된 백혈구로 진행되지 않고 또한 수적으로 많아지는 병이다.

급성골수성 백혈병(AML)은 소아에서 가장 흔히 발생하는 종양으로서 85% 이상에서 질환 특이 유전자의 이상을 동반한다고 알려져 있어 유전체 연구와 단백질 기능 연구를 통해서 향상된 진단법이 필요하다.

급성골수성 백혈병 분야에서도 85 % 이상의 환자에게서 질환 특이 유전자의 동반이 따른다는 사실에 바탕을 두어 미국을 비롯한 선진국에서는 DNA 칩 개발 등이 분야에 대한 연구가 활발히 진행되고 있고 투자도 확대되고 있다.

최근 cDNA 마이크로어레이(microarray)를 이용한 연구결과 중 중요한 것으로는 백혈병환자 중 AML과 ALL을 cDNA 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 분자생물학적인 진단이 가능하다는 보고(E.Lander, Whitehead Institute)와, 종래 한가지로 알려졌던 B-세포 림프종 (diffuse large B-cell lymphoma ; DLBCL) 질환을 cDNA 마이크로어레이 (microarray)를 이용하여 배반 B-세포형(germinal B-cell type)과 활성화된 B-세포형(activated B-cell type), 2개의 아형(subtype)으로 구분한 보고가 있다 (L.Staudt, NIH).

그러나, 한국인의 발병 양상은 서구와 구별되는 여러 가지 특징을 가지고 있을 뿐만 아니라 기존의 치료법에 반응하는 정도도 차이가 있어 한국인 급성골수성 백혈병에 관한 유전체와 단백질 기능연구에 대한 필요성이 크다.

또한, 급성 골수성 환자에서 불량 예후인자 중 염색체 이상이 예후에 가장 중요한 인자로 알려져 있으나, 골수이식 후 6개월 이내에 염색체 이상이 발견되지만 재발되지 않는 경우도 있으므로 새로운 진단방법이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 급성골수성 백혈병환자의 예후를 판별할 수 있는 DNA 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 급성백혈병 세포에서 예후에 따라 발현하는 특정 유전자의 발현정도를 비교하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 DNA칩은, 급성골수성 백혈병 세포의 유전자들 중 발현양상의 차이를 보이는 256 개의 cDNA와 컨트 롤로 사용되는 베타-액틴(β-actin) 유전자와 GAPDH 유전자로 구성된다.

또한, 본 발명은 환자의 급성골수성 백혈병 세포에서 발현된 RNA의 cDNA를 제조한 다음, 급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 DNA칩에 혼성화하여, 예후가 좋은 군에서 발현되는 유전자인 C20orf97 유전자(서열목록 1)의 발현정도와 예후가 나쁜군에서 발현되는 유전자인 XRN2 유전자(서열목록 2)의 발현정도를 비교하는 방법에 관한 것이다.

급성골수성 백혈병은 백혈구로 가는 전단계 아세포(blast) 단계에서 이상이 생겨 성숙된 백혈구로 진행되지 않고 또한 수적으로 많아지는 병이다.

한국인의 발병 양상은 서구와 구별되는 여러 가지 특징을 가지고 있을 뿐만 아니라 기존의 치료법에 반응하는 정도도 차이가 있어 한국인 급성골수성 백혈병에 관한 유전체와 단백질 기능연구에 대한 필요성이 크다.

본 발명에서는 예후가 좋은 군에 속하는 세포주 NB4와 예후가 나쁜 군에 속하는 세포주 KG-1의 RNA로부터 얻은 cDNA를 14,080개의 사람 유전자가 집적된 칩에 혼성화 하였다.

또한 예후가 좋은 군에 속하는 세포주 HL-60와 예후가 나쁜 군에 속하는 세포주 THP-1의 RNA로부터 얻은 cDNA를 동일한 칩에 혼성화하였다.

DNA 칩의 혼성화 결과를 분석하기 위해 Cy3-dUTP(Amersham Pharmacia, U.K.)를 사용하여 스캐너(Arrayworx scanner)로 이미지를 얻었다(도 1).

위 실험을 급성 골수성 백혈병에서 예후가 나쁜 군과 예후가 좋은 군과의 발현 양상이 큰 차이를 보이는 유전자들과 2002년 nature genetics에 출판된 논문, '별개의 백혈병으로 뚜렷이 구분되는 유전자 발현양식을 보여주는 혼합성 백혈병 유전자 전위(MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia ; scott A. Armstrong, jane E, Staunton etl. 2002 vol.30 p41 nature genetics)'를 토대로 다음의 표 1과 같은 유전자 리스트를 만들었다.

<표 1> 급성 골수성 백혈병에 특이적이 cDNA 칩 유전자 리스트

이들 백혈병과 관련된 256개의 유전자와 컨트롤로 이용될 베타-액틴(β-actin)과 GAPDH 16개씩 모두 288개의 유전자를 두 번 반복하여 칩에 집적하였다. 백혈병 관련 마이크로어레이(microarray)의 설계는 다음과 같이 하였다 (도 2).

백혈병 관련 마이크로어레이(microarray) 제작시 DNA 정제를 하여 각 유전자 를 가진 벡터(vector)에 해당하는 5'-amine을 가진 프라이머로 PCR을 수행하였다.

그 후 DNA를 정제 하여 스포팅 용액(spotting solution ; telechem 사)에 녹인 후 알데하이드(aldehyde)로 코팅된 슬라이드에 집적해준다. 이때 슬라이드에 코팅된 알데하이드는 DNA에 있는 아민(amine)과 공유결합을 하여 DNA를 고정시켜준다.

집적이 끝난 마이크로어레이(microarray)는 DNA를 고정시키기 위해 일주일간 실온에서 말린 후 슬라이드 표면에 있는 남아있는 알데하이드를 제거하기 위하여 소듐 보로하이드레이트(sodium borohydrate)와 함께 반응시킨다.

각 혼성화 실험은 한 칩 위에 유전자들이 2번 반복되어 있으므로 반복실험의 효과를 가지고 있다. 따라서 한 유전자에 대한 두 개의 값은 평균되어져 하나의 값으로 나타내었다.

세가지 조합의 임상시료혼성화 실험에서 각각 예후가 좋은 군에서 많이 발현된 유전자는 74개, 57개, 3개이고 예후가 나쁜 군에서 많이 발현된 유전자는 각각 100개, 49개, 35개 이다.

각 조합에서 예후에 따라 다른 발현 양상을 보인 이들 유전자들을 클러스터링 기법 중 계층적 클러스터링(hierarchical clustering) 방법을 사용하여 모든 조합에서 비슷한 발현양상을 보인 유전자를 확인할수 있었다 (도 3).

클러스터링 결과 C20orf97은 예후가 좋은 군 모두에서 많이 발현되었고, XRN2는 예후가 나쁜 군 모두에서 많이 발현되었다.

임상시료에서 예후에 따라 발현 양상의 차이를 보인 이 두 유전자들이 세포 주에서도 비슷한 양상을 보이는지 알기 위해서 예후를 알고 있는 세포주 NB4, KG-1, HL-60, THP-1에서 각 유전자를 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chin Reaction)을 수행하였다.

RT-PCR은 세포에서 얻은 RNA중 mRNA를 주형으로 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다음 이를 주형으로 하여 PCR을 통해 특정 cDNA를 증폭하는 기술이다.

세포주에서의 RNA 추출은 통상적으로 TRIzol 시약(GIBCO-BRL Grand Island, NY, U.S.A.)을 이용하였다.

본 발명에서는 원하는 두 유전자 C20orf97, XRN2를 증폭하기 위해 각 유전자에 특이적인 DNA 서열을 이용하여 두 유전자를 증폭할 수 있었다. 백혈병의 예후와 관련되어 발현양상의 차이를 보이는 두 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 다음과 같다 (표 2).

<표 2> C20orf97과 XRN2를 증폭하기 위한 프라이머 쌍

유전자	염기서열
C20orf97	tggtacccagctcctctacg ttctccagcaccagcttctt
XRN2	aagaaggaatggaagcagca caccaggagcactagcatca

상기 프라이머를 이용하여 예후를 알고 있는 급성골수성백혈병 세포주에서의 C20orf97, XRN2 발현 양상은 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타낸 바와 같이 C20orf97는 예후가 좋은 세포주인 NB4와 HL-60에서는 많이 발현되고 XRN2는 예후가 좋지 않은 세포주인 KG-1, THP-1에서 많이 발현되었다.

이 유전자들은 급성 골수성 백혈병 세포주에서 뿐만 아니라 환자 시료에서도 예후에 따라 다르게 발현하는 것으로 보아 급성 골수성 백혈병의 예후에 대한 바이오마커(biomarker)로서 사용할수 있음을 의미한다.

또한, 이 유전자를 포함한 256개의 유전자가 집적된 DNA칩은 환자에게서 백혈병과 관련된 많은 유전자의 발현을 한번에 알 수 있는 장점을 가지고 있다.

이하, 본 발명의 급성골수성 백혈병 환자의 예후를 판별하기 위한 DNA칩에 대해 실시예와 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예1> 급성골수성 백혈병 세포주의 RNA 추출

NB4, HL-60, KG-1, THP-1은 RPMI-1640 배지에 10 % 우태혈청(fetal bovine serum)과 1 % 패니실린-스트랩토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가하여 5 % CO2, 37 ℃ 배양기에서 부유배양 하였다.

이들 세포주를 트리졸에서 (Trizol, Gibco-BRL)에서 분쇄하여 분리하였다.

세포 1 ×10⁶개당 트리졸 1 ml을 첨가하여 실온에서 약 5 분간 방치한 후 200 ㎕ 클로로포름을 첨가하고 섞어주었다.

실온에서 10 분간 방치하고 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15 분간 원심분리한다. 새로운 튜브에 상층액만 옮긴후 이소프로판올 500 ㎕을 첨가하여 잘 섞은뒤 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15 분간 원심분리하였다.

여기서 얻은 RNA는 70 % 에탄올(ethanol)로 씻어준후 건조시켜 DEPC-dH20에 녹여 -70 ℃에 보관하였다.

<실시예 2> 급성골수성 백혈병 세포주의 RNA를 이용한 DNA 단편의 제조

실시예 1에서 제조한 백혈병 세포주의 RNA를 준비하였다.

준비한 RNA에 Cy3와 Cy5를 이용하여 형광물질이 표지된 cDNA를 만들었다.

세포주에서 얻은 각각의 RNA 약 100 ㎍을 22.5 ㎕에 준비하여 올리고 dT 2 ㎍을 넣고 70 ℃에서 10 분간 RNA를 변성시킨 다음 실온에 보관하였다.

각각의 50 ㎍의 RNA가 들어있는 튜브에 10 ㎛ dNTP, 100 ㎛ DTT, 400U 역전사효소를 넣고 50 ㎛ Cy3-dUTP 혹은 50 ㎛ Cy5-dUTP를 넣었다.

각각의 튜브는 42 ℃에서 2시간 보관한 다음 각 형광물질로 표지된 cDNA에 1.5N 수산화나트륨을 첨가하여 65 ℃에서 10 분간 반응시켰다.

여기에 이 용액을 중화시키기 위해서 1M Tris-HCl 과 1N 염산을 첨가하였다.

이를 마이크로 바이오 스핀 컬럼에 넣고 1000 g에서 4 분간 원심분리한 후 cy3, cy5로 표지된 cDNA를 섞어 마이크로콘-30에 넣어 12000 g에서 3 분간 원심분리하여 농축시킨 후, 컬럼을 뒤집어 1000 g에서 3 분간 원심분리하여 농축액을 회수하여 DNA단편을 제조하였다.

<실시예 3> 급성골수성 백혈병 세포주의 RNA로부터 제조한 DNA 단편 및 cDNA 칩과의 혼성화

실시예 2에서 급성골수성 백혈병 세포주의 총 RNA를 역전사하여 제조한 cDNA 와 14,080 개 유전자가 집적된 cDNA 칩과의 혼성화반응을 각각 실시하였다.

실시예 2에서 얻은 cDNA 혼합액에 human cot1 DNA 10 ㎍, 효모 tRNA 4 ㎍, 폴리dA 4 ㎍을 첨가한 후 99 ℃에서 5 분간 끓였다.

여기에 혼성화용액(Genetech, UK) 8 ㎕를 넣고 혼성화 챔버(hybridization chamber)에 cDNA 칩을 넣고 버블이 생기지 않게 cDNA를 잘 놓은다음, 커버글라스로 덮었다.

글라스 측면에 5X SSC와 0.2 % SDS 혼합 영액을 떨어뜨린 다음 55 ℃에서 16시간동안 혼성화 시켰다.

혼성화가 종료되면 슬라이드를 상온에서 0.1 % SDS를 포함하는 1X SSC용액으로 10분간 세척하고, 0.1 % SDS를 포함하는 0.1X SSC용액에서 10 분간 세척하고, 마지막으로 SDS를 제거하기 위하여 0.1X SSC용액에 10분간 세척하였다.

세척이 끝난후 500 rpm에서 1 분 30 초간 원심분리한 다음 CCD 카메라가 있는 어레이웍스( Arraywox, U.S.A.)로 스캔하였다.

실험 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 예후 정도에 따라 발현된 유전자가 녹색과 빨간색으로 나타났다.

<실험예 1> 급성 골수성 환자의 혼성화 실험조합과 세포유전학적 특징실험

표 1의 급성 골수성 백혈병과 관련된 256개의 유전자와 대조군으로 이용될 β-actin과 GAPDH 16개씩 모두 288개의 유전자를 두 번 반복하여 칩에 집적하였다.

백혈병 관련 마이크로어레이(microarray)의 설계는 도 2와 같이 하였다.

이 칩에 예후를 알고 있는 5명의 환자의 백혈구로부터 얻은 RNA를 혼성화 하였다.

5명 환자의 세포유전학적 특징과 예후, 혼성화 실험에서의 조합은 다음과 같다 (표 3).

각 조합에서 예후가 좋은 군은 cy3로 표지하고 예후가 나쁜 군은 cy5로 표지하였다.

<표 3> 급성골수성 환자의 혼성화 실험조합과 세포유전학적 특징

테스트	예후	환자	세포유전학적 특징
테스트 1	GPG	환자 1	t(8 : 21)
테스트 1	PPG	환자 2	Diploid
테스트 2	GPG	환자 3	t(8 : 21)
테스트 2	PPG	환자 4	Diploid
테스트 3	GPG	환자 3	t(8 : 21)
테스트 3	PPG	환자 5	Diploid

<실험예 2> cDNA 칩 데이터의 K-means 클러스터링(Clustering)을 통한유전자 발현양상 조사

cDNA 칩 결과들을 형광물질의 발광정도를 측정 비교하였다.

2 개의 형광물질의 이미지를 595 nm와 685 nm파장으로 스캔하였고, 시그날을 최대로 얻을 수 있는 노출시간으로 설정하였다.

예후정도에 대해서 변화가 거의 없는 유전자 수준을 정상 범위로 설정하여 정상범위 이상이거나 이하인 유전자를 예후 관련 유전자로 분류하였다.

즉, 예후가 좋은 시료를 실험군 예후가 나쁜군을 대조군으로 하여, 전체적인 유전자 발현율에 평균에 비해 비율값이 2 이상이면 예후가 좋은 군임을 나타내는 유전자로 보고, 비율값이 0.5 배 이하이면 예후가 나쁜 군임을 나타내는 유전자로 보았다.

각 임상시료의 예후관련 발현 양상을 조사하기 위하여 Genesight (biodiscovery, U.S.A.)를 이용하여 K-mean 클러스터링을 수행하였다.

<실험예 3> 예후에 따른 발현 양상실험

세가지 조합의 임상시료혼성화 실험에서 각각 예후가 좋은 군에서 많이 발현된 유전자는 74 개, 57 개, 3 개였고, 예후가 나쁜 군에서 많이 발현된 유전자는 각각 100 개, 49 개, 35 개였다.

각 조합에서 예후에 따라 다른 발현 양상을 보인 이들 유전자들을 클러스터링 기법 중 계층적 클러스터링(hierarchical clustering) 방법을 사용하여 모든 조합에서 비슷한 발현양상을 보인 유전자를 확인할수 있었다(도 3).

임상시료에서 예후에 따라 발현 양상의 차이를 보인 이 두 유전자들이 세포주에서도 비슷한 양상을 보이는지 알기 위해서 예후를 알고 있는 세포주 NB4, KG-1, HL-60, THP-1에서 각 유전자를 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chin Reaction)을 수행하였다.

원하는 두 유전자 C20orf97(Homo sapiens chromosome 20 open reading frame 97 ; 서열목록 1), XRN2(Homo sapiens 5'-3' exoribonuclease 2 ; 서열목록 2)를 증폭하기 위해 각 유전자에 특이적인 DNA 서열을 이용하여 두 유전자를 증폭하였다.

백혈병의 예후와 관련되어 발현양상의 차이를 보이는 두 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 표 2의 프라이머 쌍을 이용하였다.

표 2의 프라이머를 이용하여 예후를 알고 있는 급성골수성백혈병 세포주에서의 C20orf97, XRN2 발현 양상은 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타난 바와 같이 C20orf97는 예후가 좋은 세포주인 NB4와 HL-60에서는 많이 발현되고 XRN2는 예후가 좋지 않은 세포주인 KG-1, THP-1에서 많이 발현되었다.

<실험예 4> 역전사연쇄중합반응(RT-PCR)을 통해 예후 관련 유전자의 발현양상 분석

급성골수성 세포주로부터 추출한 총 RNA을 다음과 같이 역전사하여 예후 관련 유전자발현 양상을 살펴보았다.

RNA 5 ㎍을 DEPC 10 ㎕에 녹인 후, 올리고 dT 1 ㎕와 10 mM의 dNTP 1 ㎕을 넣고, 70 ℃에서 10 분간 반응시킨 후, 곧바로 얼음에서 냉각시켰다.

상기 시료에 5 X 첫번째 가닥 완충액(first strand buffer) 4 ㎕, 100 mM DTT, RNase OUT (Invitrogen, U.S.A.) 40 unit을 넣고 42 ℃에서 1 분간 반응시킨 후 superscriptⅡ 역전사효소를 넣고 잘 섞어준 후 42 ℃에서 50 분간 반응시킨 다음 잔류 단백질을 불활성화 시키기 위하여 70 ℃에서 15 분간 배양하였다.

이렇게 만들어진　cDNA는 10X 완충용액 5u, 10mM dNTP 5 ㎕, 2종류의 예후관련 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머 쌍(50pmole) 각각 1 ㎕, DNA 1 ㎕, Taq polymerase (Bioneer, Korea, 5U/ul) 1 ㎕ 및 나머지는 증류수로 50 ㎕가 되도록 첨가한 후, 94 ℃에서 5 분간 반응시킨 후, 94 ℃에서 1 분간, 62 ℃에서 1 분간, 72 ℃에서 1 분간 과정을 35 주기로 수행하였다.

72 ℃에서 10 분간 신장시킨 다음 1 % TAE 아가로오스 겔에서 확인하였다.

이때, β-actin을 마커로 하여 예후가 좋은 군과 나쁜군에서의 발현양을 비교하였다.

<실험예 5> 유전자의 발현정도를 비교하는 방법

실험예 3의 결과로 예후관련 유전자인 XRN2와 C20orf97의 발현 양상이 임상시료와 세포주의 예후에 따라 상이하게 나타났다.

XRN2의 경우 예후가 나쁜 군에서 과발현하였지만, 예후가 좋은 군에서는 저발현되었다.

C20orf97의 경우는 예후가 좋은군에서 과발현하였지만, 예후가 나쁜 군에서 는 저발현되었다.

이것은 두 유전자의 전사수준이 2 배 이상의 뚜렷한 범위의 값을 가질때 이들 유전자 mRNA가 급성 골수성 백혈병 예후 관련 바이오 마커로서 환자에 사용될 수 있음을 의미한다.

본 발명에 의해, 급성골수성 백혈병환자의 화학치료에 대한 예후를 판별할 수 있는 DNA 칩과 그 유전자의 발현정도를 비교하는 방법이 제공된다.

<110> PARK, Jong-Hun <120> DNA CHIP FOR PROGNOSIS DISTINCTION OF ACUTE MYLOID LEUKEMIA CASE <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2488 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagccgagat cgcgccaccg ccctccagcc tgggcgacag agcaagactc tgtctcaaaa 60 aaaaaaaaaa aaagagcaaa ttttttttcc aaggtgatag ggagagtccg tggctgatgt 120 ctgcactgac cagacgcccc tagggggcca gcgagggcgg gtcccaggtg cagcggatgc 180 agaggagaga ggcccgggcg cggcgcgggg gatggtgcga tcccgggccc gagggcatca 240 gacggcggct gattagctcc ggtttgcatc acccggaccg ggggattagc tccggtttgc 300 atcacccgga ccgggggatt agctccggtt tgcatcaccc ggaccggggg ccgggcgcgc 360 acgagactcg cagcggaagt ggaggcggct ccgcgcgcgt cgctgctagg acccgggcag 420 ggctggagct gggctgggat cccgagctcg gcagcagcgc agcgggccgg cccacctgct 480 ggtgccctgg aggctctgag ccccggcggc gcccgggccc acgcggaacg acggggcgag 540 atgcgagcca cccctctggc tgctcctgcg ggttccctgt ccaggaagaa gcggttggag 600 ttggatgaca acttagatac cgagcgtccc gtccagaaac gagctcgaag tgggccccag 660 cccagactgc ccccctgcct gttgcccctg agcccaccta ctgctccaga tcgtgcaact 720 gctgtggcca ctgcctcccg tcttgggccc tatgtcctcc tggagcccga ggagggcggg 780 cgggcctacc aggccctgca ctgccctaca ggcactgagt atacctgcaa ggtgtacccc 840 gtccaggaag ccctggccgt gctggagccc tatgcgcggc tgcccccgca caagcatgtg 900 gctcggccca ctgaggtcct ggctggtacc cagctcctct acgccttttt cactcggacc 960 catggggaca tgcacagcct ggtgcgaagc cgccaccgta tccctgagcc tgaggctgcc 1020 gtgctcttcc gccagatggc caccgccctg gcgcactgtc accagcacgg tctggtcctg 1080 cgtgatctca agctgtgtcg ctttgtcttc gctgaccgtg agaggaagaa gctggtgctg 1140 gagaacctgg aggactcctg cgtgctgact gggccagatg attccctgtg ggacaagcac 1200 gcgtgcccag cctacgtggg acctgagata ctcagctcac gggcctcata ctcgggcaag 1260 gcagccgatg tctggagcct gggcgtggcg ctcttcacca tgctggccgg ccactacccc 1320 ttccaggact cggagcctgt cctgctcttc ggcaagatcc gccgcggggc ctacgccttg 1380 cctgcaggcc tctcggcccc tgcccgctgt ctggttcgct gcctccttcg tcgggagcca 1440 gctgaacggc tcacagccac aggcatcctc ctgcacccct ggctgcgaca ggacccgatg 1500 cccttagccc caacccgatc ccatctctgg gaggctgccc aggtggtccc 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taatgcttcc 2400 aggagcaaga aagccagcag cagtactgaa acctagtgac tgggaaaaat ccagcaatgg 2460 acggcagtgg aagcctcagc ttggctttaa ccgtgaccgg aggcctgtgc acctggatca 2520 ggcagccttc aggactttgg gccatgtgat gccaagaggc tcaggaactg gcatttacag 2580 caatgctgca ccaccacctg tgacttacca gggaaactta tacaggccgc ttttgagagg 2640 acaagcccag attccaaaac ttatgtcaaa tatgaggccc caggattcct ggcgaggtcc 2700 tcctcccctt ttccagcagc aaaggtttga cagaggcgtt ggggctgaac ctctgctccc 2760 atggaaccgg atgctgcaaa cccagaatgc agccttccag ccaaaccagt accagatgct 2820 agctgggcct ggtgggtatc cacccagacg agatgatcgt ggagggagac agggatatcc 2880 cagagaagga aggaaatacc ctttgccacc accctcagga agatacaatt ggaattaagc 2940 ttttgtaaag ctttcccaaa tcctttcatc attctacagt tttatgctat ttgtggaaag 3000 atttctttct caagtagtag tttttaataa aactacagta ctttgtgtat ttcttttaac 3060 tgtgtatatt tctactgatc tgatctcact gtttatgttg ctttccaaag atgtatgttg 3120 cataatacag tggatctgaa tttattattg cttataaaac acatttgatg gaataggagt 3180 actggttttt cataatggtt aaaaatgaaa ccagctgtgg atttcaaaac 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Claims

DNA칩에 있어서,

급성골수성 백혈병 세포의 유전자들 중 표 1에 나타나있는 발현양상의 차이를 보이는 256 개의 cDNA와 컨트롤로 사용되는 베타-액틴(β-actin)유전자와 GAPDH 유전자로 구성된,

한국인 급성골수성 백혈병 환자의 화학치료에 대한 예후를 판별하기 위한 DNA칩.
유전자의 발현정도를 비교하는 방법에 있어서,

환자의 급성골수성 백혈병 세포에서 발현된 RNA의 cDNA를 제조한 다음,

청구항 1의 DNA칩에 상기 제조된 cDNA를 혼성화하여,

예후가 좋은 군에서 발현되는 유전자인 서열번호 1의 C20orf97 유전자의 발현정도와 예후가 나쁜 군에서 발현되는 유전자인 서열번호 2의 XRN2 유전자의 발현정도를 비교하는 것으로 구성된,

급성골수성 백혈병 세포의 유전자 발현을 비교하는 방법.